Twee-Photon In vivo Imaging van vertakte stekels in de Mouse Cortex met een uitgedunde schedel Voorbereiding

Summary

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Abstract

In de zoogdieren cortex neuronen vormen extreem gecompliceerde netwerken en informatie uitwisselen bij synapsen. Veranderingen in synaptische sterkte, evenals toevoeging / verwijdering van synapsen, plaatsvinden in een ervaringsafhankelijke wijze die de structurele basis van neuronale plasticiteit. Als postsynaptische onderdelen van de exciterende synapsen in de cortex, worden dendritische beschouwd als een goede benadering van synapsen zijn. Het nemen van de voordelen van de muis genetica en fluorescentielabelling technieken, individuele neuronen en hun synaptische structuren kunnen in de intacte hersenen worden geëtiketteerd. Hier introduceren we een transcraniële imaging protocol met behulp van twee-foton laser scanning microscopie om fluorescent gelabelde postsynaptische vertakte stekels in de tijd in vivo te volgen. Dit protocol maakt gebruik van een uitgedund-schedel voorbereiding, waarbij de schedel intact houdt en voorkomt inflammatoire effecten veroorzaakt door blootstelling van de hersenvliezen en de cortex. Daarom beelden kunnen direct na su verworvenrgery wordt uitgevoerd. De experimentele procedure kan herhaaldelijk worden uitgevoerd op verschillende tijdstippen, variërend van enkele uren tot jaren. De toepassing van dit preparaat kan ook worden uitgebreid tot verschillende corticale gebieden en lagen, alsmede andere celtypes, onder fysiologische en pathologische omstandigheden.

Introduction

De zoogdieren cortex participeert in vele hersenfuncties, van zintuiglijke waarneming en controle voor het abstracte informatieverwerking en cognitie. Verschillende corticale functies bouwen op verschillende neurale circuits, die zijn opgebouwd uit verschillende soorten neuronen communiceren en uitwisselen van informatie op individueel synapsen. De structuur en functie van synapsen consequent worden gewijzigd ingevolge ervaringen en pathologieën. In de volwassen hersenen, synaptische plasticiteit in de vorm van zowel kracht veranderingen en toevoeging / verwijdering van synapsen, spelen een belangrijke rol bij de vorming en instandhouding van een functionele neurale ....

Protocol

Goedkeuring moet worden verkregen van thuis instellingen voor aanvang van de chirurgie en beeldvorming studie. Experimenten in dit manuscript beschreven werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften van de Universiteit van Californië, Santa Cruz Institutional Animal Care en gebruik Comite.

1. Chirurgie

1. Autoclaaf alle chirurgische instrumenten en steriliseer de werkruimte met 70% alcohol goed voor de operatie.
2. Verdoven de muis door intraperitoneale (IP) injectie van KX anestheticum (200 mg / kg ketamine en 20 mg / kg xylazine) volgens muis lichaamsgewicht. Opmerking: KX dosering worden....

Results

In YFP-H lijn ²⁵ muizen, geel fluorescerend eiwit expressie in een subset van laag V piramidale neuronen, die de apicale dendrieten uitsteken in de oppervlakkige lagen van de cortex. Door de uitgedunde schedel voorbereiding, kan de fluorescent gelabelde dendritische segmenten herhaaldelijk worden afgebeeld onder twee-foton microscoop op verschillende beeldvormende intervallen, variërend van uren tot maanden. Hier tonen we een voorbeeld van een vier-time beeldvorming van dezelfde dendrieten dan 8 dagen in de m.......

Discussion

Om een ​​succesvolle uitgedund-schedel voorbereiding te verkrijgen, verschillende stappen in dit protocol zijn cruciaal. 1) De dikte van de schedel. Het schedelbot heeft een sandwich-structuur, met twee lagen van high-density compact bot en een middelste laag van lage-dichtheid sponsachtig bot. De hoge-snelheid micro boormachine is geschikt voor het verwijderen van de buitenlagen van compact bot en sponsachtig been, de microchirurgische blad is ideaal voor het verdunnen van de binnenlaag van compacta. Aangezien de dikte.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Bioniche Pharma	67457-034-10	Mixed with xylazine for anesthesia
Xylazine	Lloyd laboratories	139-236	Mixed with ketamine for anesthesia
Saline	Hospira	0409-7983-09	0.9% NaCl for injection and imaging
Razor blades	Electron microscopy sciences	72000	Double-edge stainless steel razor blades
Alcohol pads	Fisher Scientific	06-669-62	Sterile alcohol prep pads
Eye ointment	Henry Schein	102-9470	Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant
High-speed micro drill	Fine Science Tools	18000-17	The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area
Micro drill steel burrs	Fine Science Tools	19007-14	1.4 mm diameter
Microsurgical blade	Surgistar	6961	The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone
Cyanoacrylate glue	Fisher Scientific	NC9062131	Fix the head plate onto the skull
Suture	Havard Apparatus	510461	Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament
Dissecting microscope	Olympus		SZ61
CCD camera	Infinity
Two-photon microscope	Prairie Technologies		Ultima IV
10X objective	Olympus		NA 0.30, air
60X objective	Olympus		NA 1.1, IR permeable, water immersion
Ti-sapphire laser	Spectra-Physics		Mai Tai HP