Twee-Photon In vivo Imaging van vertakte stekels in de Mouse Cortex met een uitgedunde schedel Voorbereiding

Summary

Time-lapse beeldvorming in het levende dier levert waardevolle informatie over structurele reorganisatie in de intacte hersenen. Hier introduceren we een voorbereiding met een verdunde schedel die transcraniële beeldvorming mogelijk maakt van fluorescent gelabelde synaptische structuren in de levende muizencortex door middel van twee-foton microscopie.

Abstract

In de zoogdieren cortex neuronen vormen extreem gecompliceerde netwerken en informatie uitwisselen bij synapsen. Veranderingen in synaptische sterkte, evenals toevoeging / verwijdering van synapsen, plaatsvinden in een ervaringsafhankelijke wijze die de structurele basis van neuronale plasticiteit. Als postsynaptische onderdelen van de exciterende synapsen in de cortex, worden dendritische beschouwd als een goede benadering van synapsen zijn. Het nemen van de voordelen van de muis genetica en fluorescentielabelling technieken, individuele neuronen en hun synaptische structuren kunnen in de intacte hersenen worden geëtiketteerd. Hier introduceren we een transcraniële imaging protocol met behulp van twee-foton laser scanning microscopie om fluorescent gelabelde postsynaptische vertakte stekels in de tijd in vivo te volgen. Dit protocol maakt gebruik van een uitgedund-schedel voorbereiding, waarbij de schedel intact houdt en voorkomt inflammatoire effecten veroorzaakt door blootstelling van de hersenvliezen en de cortex. Daarom beelden kunnen direct na su verworvenrgery wordt uitgevoerd. De experimentele procedure kan herhaaldelijk worden uitgevoerd op verschillende tijdstippen, variërend van enkele uren tot jaren. De toepassing van dit preparaat kan ook worden uitgebreid tot verschillende corticale gebieden en lagen, alsmede andere celtypes, onder fysiologische en pathologische omstandigheden.

Introduction

De zoogdieren cortex participeert in vele hersenfuncties, van zintuiglijke waarneming en controle voor het abstracte informatieverwerking en cognitie. Verschillende corticale functies bouwen op verschillende neurale circuits, die zijn opgebouwd uit verschillende soorten neuronen communiceren en uitwisselen van informatie op individueel synapsen. De structuur en functie van synapsen consequent worden gewijzigd ingevolge ervaringen en pathologieën. In de volwassen hersenen, synaptische plasticiteit in de vorm van zowel kracht veranderingen en toevoeging / verwijdering van synapsen, spelen een belangrijke rol bij de vorming en instandhouding van een functionele neurale circuits. Dendritische stekels zijn de postsynaptische onderdelen van de meerderheid van exciterende synapsen in de hersenen van zoogdieren. De constante omzet en morfologische veranderingen van de stekels worden verondersteld om te dienen als een goede indicator van veranderingen in synaptische verbindingen ^1-7.

Twee-foton laser scanning microscopie biedt diepe penetratie door dikke, ondoorzichtige voorbereidingen en lage fototoxiciteit, waardoor het geschikt is voor live-imaging in de intacte hersenen ⁸ maakt. In combinatie met fluorescentielabelling, twee-foton beeldvorming biedt een krachtig instrument om een ​​kijkje in het levende brein en volg structurele reorganisatie bij individuele synapsen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Verschillende methoden zijn gebruikt om muizen te bereiden voor levende beeldvorming ^9-13. Hier beschrijven we een uitgedunde schedel voorbereiding van in vivo twee-foton beeldvorming om de structurele plasticiteit van postsynaptische vertakte stekels in de muis cortex onderzoeken. Met deze benadering hebben onze recente studies een dynamisch beeld van dendritische spine veranderingen weergegeven in reactie op motorische vaardigheden leren Met de toenemende beschikbaarheid van met fluorescent gelabelde neuronale subsets en snelle ontwikkeling van in vivo labeling technieken transgene dieren, kan dit hier beschreven ook worden toegepast te onderzoekente andere celtypes en corticale gebieden, gecombineerd met andere manipulaties, alsook in ziektemodellen ^16-23.

Protocol

Goedkeuring moet worden verkregen van thuis instellingen voor aanvang van de chirurgie en beeldvorming studie. Experimenten in dit manuscript beschreven werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften van de Universiteit van Californië, Santa Cruz Institutional Animal Care en gebruik Comite.

1. Chirurgie

1. Autoclaaf alle chirurgische instrumenten en steriliseer de werkruimte met 70% alcohol goed voor de operatie.
2. Verdoven de muis door intraperitoneale (IP) injectie van KX anestheticum (200 mg / kg ketamine en 20 mg / kg xylazine) volgens muis lichaamsgewicht. Opmerking: KX dosering worden aangepast aan de stam, leeftijd en gezondheidstoestand van de muizen. Veterinaire overleg om de optimale dosis te bepalen is ook een aanrader.
3. Voer een teen-pinch-test periodiek door op de tenen van de muis en het controleren op een reflexieve reactie op de verdoving statusvenster.Zorg ervoor dat de muis volledig verdoofd voordat de operatie. Opmerking: Tijdens langdurige beeldvorming sessies, controleer anesthesie status van de muis periodiek, administreren extra KX indien nodig.
4. Plaats de muis op een verwarmingselement voor de lichaamstemperatuur tijdens de operatie te handhaven.
5. Scheer de kop van de muis met behulp van een scheermesje om de hoofdhuid te bloot.
6. Steriliseer het geschoren gebied door de huid met afwisselend alcohol pads en betadine vegen. Verwijder eventuele resterende haren knipsels.
7. Voorzichtig toe te passen oogzalf in beide ogen te smeren, dus het voorkomen van permanente schade veroorzaakt door uitdroging tijdens het experiment.
8. Maak een rechte incisie langs de middellijn van de hoofdhuid, en verplaats de huid lateraal naar de randen van de schedel.
9. Verwijder het bindweefsel aan de schedel.

2. Verdunde-schedel Voorbereiding

1. Identificeer de beeldvorming regio op basis van ster. eotaxic coördinaten Opmerking: Probeer om grote bloedvaten, die blok lichtinval te voorkomen en vervagen de afgebeelde structuren. Vaatstelsel wordt het best waargenomen wanneer de schedel is vochtig met steriele zoutoplossing.
2. Met de high-speed micro boor te dun een cirkelvormig gebied van de schedel (0,5-1,0 mm diameter). Beweeg de boor parallel aan de schedel oppervlak, in plaats van vast te houden tegen de schedel en de naar beneden te drukken. Boor tot zowel de buitenste compact bot laag en de middelste sponsachtige bot laag worden verwijderd. Opmerking: Om schade door oververhitting te voorkomen, vermijd langdurig contact tussen de boor en de schedel.
3. Verder verdunnen van de binnenste compacta laag met een microchirurgische mes in het midden van de boor verdund regio. Houd de microchirurgische mes onder een hoek van ongeveer 45 ° aan de schedel schrapen zonder naar beneden te drukken tegen de schedel tot een gelijkmatig uitgedund klein gebied (200-300 micrometer diameter) met een dikte van ongeveerly 20-30 urn wordt verkregen. Door de automatische fluorescentie van de schedel, kan de dikte worden gemeten door het scannen van de afstand tussen bovenste en onderste oppervlak van de schedel onder de twee-foton microscoop. Opmerking: hoewel een schedel dikte van minder dan 20 urn biedt een goede beeldkwaliteit, het is niet aanbevolen, want het maakt het dunner proces in latere re-imaging-sessies moeilijk. Om te voorkomen dat over-dunner, de dikte van de schedel moet regelmatig worden gecontroleerd tijdens de operatie (zie Discussie).

3. Immobilisatie

1. Verwijder bot puin zorgvuldig.
2. Plaats een kleine druppel cyanoacrylaat lijm op elke rand van de centrale opening van de steriele kopplaat, die is geautoclaveerd (zie figuur 1). Houd het hoofd plaat strak tegen de schedel met de verdunde regio gelegen in het centrum van de opening. Opmerking: Als de lijm vervuilt de verdunde region per ongeluk, verwijder deze dan voorzichtig met de microchirurgische mes.
3. Trek de huid tegen de zijkanten van de schedel om de randen van de centrale opening van de kopplaat.
4. Wacht ongeveer 10 minuten totdat de kop plaat goed is bevestigd aan de schedel.
5. Plaats het hoofd plaat op twee zijdelingse blokken van de montageplaat en draai de schroeven over de randen van het hoofd plaat om de muis te immobiliseren op de montageplaat (zie figuur 1). Opmerking: Zorg ervoor dat er geen huid of snorharen tussen het hoofd bord en de blokken voor het aandraaien van de schroeven. Een goede geïmmobiliseerd preparaat dient geen waarneembare beweging van de schedel af onder de stereomicroscoop bij de rug van het dier zachtjes klopte.
6. . Spoel de blootgestelde schedel met zoutoplossing om gepolymeriseerde lijm verwijderen Opmerking: Het is belangrijk om alle resterende lijm te verwijderen, als niet-gepolymeriseerd lijm vervaagt beelden en schade microscoop doelstellingen <./ Li>

4. Imaging

1. Maak een foto van het vaatstelsel van de blootgestelde schedel met de uitgedund regio op de kaart 1, die wordt gebruikt om te verhuizen de afgebeelde regio in de daaropvolgende beeldvorming sessies (zie figuur 2).
2. Plaats de muis onder de imaging microscoop. Zoek de verdunde gebied onder een 10X lucht doelstelling met behulp van epifluorescentie en verplaats de dunste gebied naar het centrum van het uitzicht.
3. Voeg een druppel zoutoplossing op de bovenkant van de schedel en naar het 60x objectief, die is gespoeld met steriel water. Selecteer een regio waar individuele vertakte stekels duidelijk zichtbaar langs de dendrieten. Identificeer en label het overeenkomstige gebied op kaart 1 door het vergelijken vaatstelsel tussen de epifluorescerende uitzicht en het vaatstelsel foto.
4. Stem de twee-foton laser golflengte volgens de fluoroforen. Bijvoorbeeld 920 nm voor YFP; 890 nm voor GFP; 1000 nm voor DsRed en tdTomato ^24.
5. Acquire image stacks met 2urn stappen langs de z-as met de 60X objectief. Dit afbeeldingsstapel omvat een ongeveer 200 urn x 200 urn stippellijn (512 x 512 pixels) en wordt gebruikt als kaart 2 voor verplaatsing in latere beeldvorming sessies (zie figuur 2).
6. Acquire negen image stacks binnen Kaart 2 met behulp 3x digitale zoom. Elke afbeeldingsstapel heeft een oppervlakte van ongeveer 70 urn x 70 urn (512 x 512 pixels), met 0,7 micrometer stappen langs de z-as. Opmerking: De intensiteit van de laser moet lager zijn dan 40 mW, gemeten in monsters fototoxiciteit minimaliseren.

5. Recovery

1. Na beeldvorming, voorzichtig los het hoofd plaat uit de schedel.
2. Grondig reinigen van de schedel en de huid om alle resterende lijm te verwijderen. Opmerking: Eventuele resterende lijm op de huid irritaties veroorzaken en vertraagt ​​herstel van de huid terwijl de resterende lijm op de schedel zal erosie van de schedel en een oorzaakngiogenesis in de pas gegroeide bot laag, waardoor de daaropvolgende verhuizing en re-imaging moeilijk.
3. Spoel de schedel en de huid met een zoutoplossing meerdere malen.
4. Hecht de hoofdhuid met steriel chirurgisch hechtdraad.
5. Houd het dier op een verwarmingselement in een aparte kooi. Dien analgetische buprenorfine (0,1 mg / kg) subcutaan om postoperatieve pijn te verzachten. Breng het dier naar de kooi na volledig herstel. Nauwlettend toezien op het dier (check minstens eenmaal per dag) tot de incisie is genezen en de hechtingen worden verwijderd. Dien volgende injecties buprenorfine analgetische indien nodig.

6. Reimaging

1. Herhaal de stappen 1,1-1,8.
2. Herhaal de stappen 3,1-3,6
3. Zoek eerder afgebeeld regio door het vergelijken van het vaatstelsel patroon kaart 1 en de dendritische tak patroon kaart 2.
4. Als reimaging wordt uitgevoerd binnen 1 week, herhaal stap 2.3 de dunne laag van pas gegroeide bot bovenop de verdunde re verwijderenGewest met de microchirurgische mes. Als reimaging wordt uitgevoerd na meer dan 1 week, herhaalt u stap zowel 2.2 en 2.3. Opmerking: De pas gegroeide bot laag bestaat uit een minder gecondenseerde structuur in vergelijking met de oorspronkelijke compacte bot laag, wat leidt tot een mindere beeldkwaliteit. Daarom, om dezelfde kwaliteit te verkrijgen, is het noodzakelijk om dunne schedel iets meer dan de vorige opnamesessie.
5. Pas de positie en oriëntatie op de foto om stapels die voorheen image stacks overeenkomen genomen in het kader van de twee-foton microscoop te verkrijgen.
6. Acquire beelden als in stap 4.6.
7. Herhaal de stappen 5,1-5,5 na beeldvorming.

Results

In YFP-H lijn ²⁵ muizen, geel fluorescerend eiwit expressie in een subset van laag V piramidale neuronen, die de apicale dendrieten uitsteken in de oppervlakkige lagen van de cortex. Door de uitgedunde schedel voorbereiding, kan de fluorescent gelabelde dendritische segmenten herhaaldelijk worden afgebeeld onder twee-foton microscoop op verschillende beeldvormende intervallen, variërend van uren tot maanden. Hier tonen we een voorbeeld van een vier-time beeldvorming van dezelfde dendrieten dan 8 dagen in de m...

Discussion

Om een ​​succesvolle uitgedund-schedel voorbereiding te verkrijgen, verschillende stappen in dit protocol zijn cruciaal. 1) De dikte van de schedel. Het schedelbot heeft een sandwich-structuur, met twee lagen van high-density compact bot en een middelste laag van lage-dichtheid sponsachtig bot. De hoge-snelheid micro boormachine is geschikt voor het verwijderen van de buitenlagen van compact bot en sponsachtig been, de microchirurgische blad is ideaal voor het verdunnen van de binnenlaag van compacta. Aangezien de dikte...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Bioniche Pharma	67457-034-10	Gemengd met xylazine voor anesthesie
Xylazine	Lloyd laboratories	139-236	Gemengd met ketamine voor anesthesie
Saline	Hospira	0409-7983-09	0,9% NaCl voor injectie en beeldvorming
Vleesmessen	Electron microscopy sciences	72000	Dubbelzijdige roestvrijstalen vleesmessen
Alcoholdoekjes	Fisher Scientific	06-669-62	Steriele alcoholdoekjes
Oogzalf	Henry Schein	102-9470	Petrolatum oogzalf steriele oculaire smeermiddel
Microboor met hoge snelheid	Fine Science Tools	18000-17	De microboor met hoge snelheid is geschikt voor het verdunnen van de buitenste laag compact bot en het targeten van een klein gebied
Microboor stalen beitels	Fine Science Tools	19007-14	1,4 mm diameter
Microchirurgisch mes	Surgistar	6961	Het microchirurgisch mes is geschikt voor het verdunnen van de binnenste laag compact bot en de middelste laag sponsachtig bot
Cyanoacrylaatlijm	Fisher Scientific	NC9062131	Bevestig de hoofdplaat op de schedel
Hechtdraad	Havard Apparatus	510461	Niet-absorbeerbare, steriele zijdedraad, 6-0 monofilament
Dissectiemicroscoop	Olympus		SZ61
CCD-camera	Infinity
Twee-foton microscoop	Prairie Technologies		Ultima IV
10X objectief	Olympus		NA 0,30, lucht
60X objectief	Olympus		NA 1,1, IR doorlaatbaar, waterimmersie
Ti-saffierlaser	Spectra-Physics		Mai Tai HP