Monitoring Functionaliteit en morfologie van vaatstelsel aangeworven door gesekreteerd door Snelgroeiende Tumor genererende cellen

Samenvatting

We beschrijven een matrigel-plugtest om het angiogeen potentieel van een pool van factoren te illustreren die worden afgescheiden door kankercellen, met behulp van twee complementaire beeldvormingsmodaliteiten, echografie en endomicroscopie. De matrigel, een buitencelmatrix (ECM)-nabootsende gel, wordt gebruikt om de gastheer (muis) te introduceren met angiogeen factoren die worden afgescheiden naar het geconditioneerde medium (C.M.). 

Samenvatting

De subcutane Matrigel plug bij muizen is een voorkeursmethode voor de in vivo evaluatie van pro- en anti-angiogene factoren. In deze werkwijze worden gewenst factoren geïntroduceerd in koude vloeistof ECM-nabootser gel na subcutane injectie, stolt tot een omgeving nabootsen van kanker milieu vormen. Deze matrix maakt de penetratie van gastheercellen, zoals endotheliale cellen, en derhalve de vorming van bloedvaten.

Hierin stellen we een nieuwe gewijzigde Matrigel plug assay die kan worden benut angiogene potentieel van een pool factoren uitgescheiden door kankercellen illustreren, in plaats van een specifieke factor (bijvoorbeeld bFGF en VEGF) of middel. De plug met ECM-mimische gel wordt gebruikt om de gastheer (muizen) te introduceren met een pool van gesekreteerd aan de CM van snelgroeiende tumor genereren glioblastoma cellen. We hebben eerder beschreven uitgebreide vergelijking van de angiogene potentieelU-87 MG humane glioblastoma en slapende afgeleide kloon in dit systeemmodel, met geïnduceerde angiogenese in de U-87 MG oudercellen. De CM wordt bereid door het filteren van verzamelde media uit samenvloeiende weefselkweek platen van beide cellijn na 48 uur incubatie. Vandaar, het bevat slechts factoren uitgescheiden door de cellen, zonder de cellen zelf. Hier beschreven is de combinatie van twee beeldvormende modaliteiten, microbellen contrast-versterkte echografie en intravitale fibered-confocale endomicroscopy, voor een accurate, real-time karakterisering van de omvang, de morfologie en functionaliteit van de nieuw gevormde bloedvaten in de stekkers.

Inleiding

De Matrigel plug angiogenese assay werd eerst beschreven door Kibbey et al. In 1992, waar het gebruikt werd om angiogenese stimulatie evalueren van de peptide SIKVAV (Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val) ^1. In tegenstelling tot andere in vivo angiogenese assays, zoals de muis corneale angiogenese of kuiken chorioallantoïsmembraan assays deze test is relatief gemakkelijk uit te voeren ^2. De geïnjecteerde ECM-nabootsende gel cellen pro-angiogene en anti-angiogene verbindingen en / of factoren bevatten. Bij de beoordeling van de activiteit van een anti-angiogene samenstelling, de plug bevat gewoonlijk een mengsel van vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) en fibroblast groeifactor (FGF), en de anti-angiogene stof direct in de stekker of systemisch ³ worden ^{toegediend 4.}

De ECM-nabootsende gel wordt subcutaan geïnjecteerd waar het stolt binnen minuten. Beoordeling van recruitment bloedvat in de resulterende plug is typically uitgevoerd door het meten van hemoglobine niveaus binnen de stekker, met behulp van fluorescentie signaal meting na injectie van fluoresceïneisothiocyanaat (FITC) gelabelde dextran, door immunokleuring van histologie secties voor endotheel-specifieke markers of door fluorescentie-geactiveerde cel sortering (FACS) ^{2,5, 6.} Echter, deze beoordeling staat alleen eindpunt analyse en mist over de functionaliteit en morfologie van bloedvaten. Bovendien metingen van plasmavolume, hetzij door hemoglobinewaarden of met dextran-FITC als indicator, misleidend omdat inhoud bloed wordt beïnvloed door de grootte van de bloedvaten en de omvang van stilstaand plassen bloed. Dit is vooral belangrijk wanneer de aangeworven vaatstelsel wordt gekenmerkt door verhoogde permeabiliteit en retentie (EPR) effect ^7.

Wij stellen hierin een nieuwe, nauwkeuriger, methode voor het visualiseren van de aangeworven bloedvaten door het combineren van twee complementaire beeldvormende modaliteiten. High resolutie microbellen contrast-versterkte ultrageluid (US) gecombineerd met intravitale fibred-confocale endomicroscopy kan informatie niet alleen bloedvat dichtheid, maar ook van hun morfologie en functionaliteit. Bovendien kan deze analyse worden uitgevoerd op verschillende tijdstippen waardoor het mogelijk controle van angiogenese kinetiek. VS is een veel gebruikte beeldvormingstechniek die een hoge ruimtelijke resolutie voor bloedvaten beeldvorming na intraveneuze (iv) injectie van microbellen die uitsluitend blijven de vasculaire compartiment ^8-11 bezit. De microbellen zijn met gas gevulde microbellen die een sterke echogeen signaal te produceren wordt opgewekt met een Amerikaanse puls en dus dienen als een goede contrastmiddel. 3D-beelden van de stekker worden verkregen met behulp van de Amerikaanse imaging systeemsoftware volgende microbellen vernieling. De resulterende beelden zijn opgebouwd uit beeldframes vóór en na vernietiging van microbellen en weerspiegelen het verschil in video intensiteit van kleur. Deze overlaybeelden worden automatisch door de software. Bijgevolg kan het percentage van functionele schepen binnen de stekker worden gekwantificeerd. Hoge resolutie Fibered confocale endomicroscopy dient als een aanvullende beeldvormende modaliteit door de rapportage over de bloedvaten morfologie. In deze minimaal invasieve methode, worden de beelden verkregen na intraveneuze toediening van FITC-geconjugeerd dextran ^12. De fluorescerende polymeer verft de bloedbaan en dus dient als een 'contrastmiddel' voor bloedvaten morfologie en de doorbloeding. Aangezien de geïnjecteerde polymeer op een formaat van 70 KDa, kan slechts lekkende vaten zoals in tumorvasculatuur steken. Dit resulteert in hoge achtergrond van de FITC-gelabelde dextran buiten de bloedvaten. Bijgevolg kan Fibered confocale endomicroscopy worden gebruikt om de typische kenmerken van de EPR-effect te visualiseren in de tumor neovasculature- vergroot, lekkende, zeer verwarde schepen, met stompe uiteinden.

Dit systeem model werd described in de vergelijking van de angiogene potentieel van U-87 MG humane glioblastoma en slapende kloon ^13. Vascularisatie binnen de stekkers werd geëvalueerd drie weken na de ECM-mimische gel inenting. Er werd aangetoond dat de vascularisatie binnen stekkers met CM U-87 MG snel groeiende tumor genererende cellen was significant verhoogd in aantal, dichtheid en functionaliteit in vergelijking met vascularisatie binnen stekkers met CM van de slapende tumor genererende cellen. Derhalve waren de auteurs concluderen dat CM geïsoleerd uit U-87 MG snel groeiende tumor genererende cellen bevat hogere niveaus van pro-angiogene factoren, vergeleken met de CM van slapende tumor genererende cellen. Deze factoren stimuleren de vorming van functionele bloedvaten door actief die alle stappen van de angiogene cascade (dwz proliferatie, kiemen, migratie en tenslotte vorming van buisvormige structuren van endotheelcellen).

Protocol

OPMERKING: Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de normen van de Universiteit van Tel Aviv Sackler School of Medicine Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC).

1. Geconditioneerd Mediavoorbereiding

1. Seed 2 x 10 ⁶ U-87 MG cellen in een 10 cm kweek plaat in een volume van 8 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine / nystatine oplossing.
2. Incubeer cellen bij 37 ° C; 5% CO ₂ tot stand brengen van volledige samenvloeien op 48 uur.
3. Met behulp van een injectiespuit 10 ml, trekken alle medium uit de plaat en filteren door een 0,45 pm filter in een 15 ml buis.
4. Zonder de cellen te wassen plaat, voeg 1 ml trypsine-oplossing (0,25%) en incubeer.
5. Wanneer alle cellen losgemaakt, inactivatie van het trypsine met ten minste 5 ml DMEM aangevuld met 10% FBS en voorvormen een celgetal.
> Tel het aantal cellen met een hemocytometer of andere cel-telinrichting en bereken het aantal cellen volgens de telling methode.
Opmerking: Het zal later teneinde CM concentratie normaliseren gebruikt.
6. Breng de CM een glazen rondbodemkolf en concentreer onder hoog vacuüm roterende verdamper. Om het proces te versnellen, verhogen de badtemperatuur tot 37 ° C, indien gewenst. Ga door tot de CM behaalt een pasta-achtige textuur.
7. Resuspendeer de CM van elke cultuur plaat in 400 ul zoutoplossing. Bij gebruik van meer dan één plaat, gebruiken equivalent volume. Bijvoorbeeld voor 2 kweekplaten Gebruik 800 ul. Gebruik elke plaat voor 4 muizen.
8. Om verschillende cellijnen of behandelingen vergelijken, het volume volgens de celverhouding ontvangen in stap 1.6. Als bijvoorbeeld een plaat is 1.5x meer cellen, voeg 200 ul van zoutoplossing om de bestaande 400 pl. Dit zal de aangepaste cm

titel "> 2. ECM-mimische Gel Plug enting in Muizen

1. Vóór het inenten van de ECM-mimische gel in muizen, de voorbereiding van de volgende materialen:
   1. Groeifactoren verlaagde fenolvrij ECM-nabootsende gel (ontdooien nachts, een dag voor het experiment bij 4 ° C op ijs).
   2. Elektrisch scheerapparaat.
   3. Ketamine en xylazine om de muizen verdoven.
   4. Ijskoude 1.000 III steriele tips.
   5. Ijskoude 1 ml spuit en 27 G naalden.
2. Bereid je voor op elke muis een 1,5 ml Eppendorf buis met 80 pi aangepast CM en blijf op ijs.
3. Aan elke buis, voeg 600 ul ijskoude groeifactoren verlaagde fenolvrij ECM-nabootsende gel overnacht ontdooid bij 4 ° C, op ijs. De ECM-nabootsende gel vloeistof 4 ° C en stolt bij lichaamstemperatuur; om te voorkomen dat de ECM-mimic gel stollen Gebruik ijskoude 1.000 III tips. Meng buizen zorgvuldig zonder de vorming van bellen en te houden op het ijs.
4. Verdoven van 6 weken oude BALB / c muizen met ketamine (100 mg / kg) en xylazine (12 mg / kg). Bevestig de juiste verdoving volgens de institutionele verzorging van dieren en het gebruik comité, dat wil zeggen voor het begin van het experiment. Dieren hebben hun juiste vlak van anesthesie bereikt wanneer ze niet meer reageren op een stevige teen knijpen.
5. Scheer de buikstreek van de muizen en desinfecteren met behulp van een chirurgische scrub / alcohol.
6. Gebruik een koud 1 ml injectiespuit en een 27 G naald om de inhoud van de Eppendorf buis subcutaan injecteren. Voer de injectie zeer langzaam belvorming te voorkomen. Zodra alle volume wordt toegediend, niet uitwerpen van de naald gedurende enkele minuten, tot stolling optreedt.

3. Evaluatie van de ECM-mimische Gel Plug Vascularisatie met behulp van echografie

LET OP: Dit deel van het protocol vereist voorkennis van de exploitatie van een echografie systeem, of de hulp van een erkende technicus.

1. Voordat u begint, hebben de fadat materialen en instrumenten klaar:
   1. Elektrisch scheerapparaat.
   2. Ontharingscrème.
   3. Ketamine en xylazine om de muizen verdoven.
   4. Niet-gerichte microbellen.
   5. Activering apparaat.
   6. US beeldvormend systeem met een 55 MHz probe 708 en een 3D-acquisitie micromanipulator.
2. Meet vascularisatie binnen de stekkers drie weken na de inenting:
   OPMERKING: In de U-87-MG gebaseerd diermodel, werd 3 weken gevonden om het ideale tijdstip voor beeldvorming te vertegenwoordigen. Onder verschillende instellingen, kalibreren vascularization kinetiek vanaf een paar dagen na inoculatie van stekkers.
   1. Verdoven muizen met ketamine (100 mg / kg) en xylazine (12 mg / kg). Bevestig de juiste verdoving volgens de institutionele verzorging van dieren en het gebruik comité, dat wil zeggen voor het begin van het experiment. Dieren hebben hun juiste vlak van anesthesie bereikt wanneer ze niet meer reageren op een stevige teen knijpen.
   2. Scheer deabdominale gebied van de muizen en behandel met ontharingscrème.
   3. Bevestig de muizen achterover op het podium van de micro-manipulator.
   4. Met behulp van een 1 ml spuit met zoutoplossing en een 30 G naald, plaats de naald in de staart ader, bevestig de naald stevig vast en draai de spuit.
   5. Opgezet voor de Contrast 3D-beeld-stand overname sessie:
      1. Druk "3D" om de 3D motor stadium initialiseren en plaats de transducer in het midden van het gewenste aftastgebied.
      2. Druk op "3D" en voer de scan afstand en de stapgrootte, druk dan op "Scan".
      3. Zorg ervoor dat de gehele plug werd gescand in de beeldgegevens 3D weergegeven. Zo niet, stel de transducer, zodat de hele stekker is zichtbaar in de scan en herhaal stap 3.5.2.
      4. Druk op "Contrast" en druk op de tijdwinst compensatie (TGC) stuurt naar links om de afbeelding donkerder te maken.
   6. Activeer de microbellen met een flesje mixer die is desineerd voor de activering van microbellen 45 sec.
   7. Meng in een 1 ml spuit 50 ui van microbellen met 50 pi zoutoplossing.
   8. Vervang de-zoutoplossing die losgemaakte spuit met een spuit met geactiveerde microbellen. Spuit de verdunde microbellen in de staartader van de muizen, wacht een paar seconden voor het bellen naar een steady state te bereiken, en vervolgens te verwerven 3D-contrast-versterkte cine lus van de stekker, het gebruik van de 3D-acquisitie motor:
      1. Druk op "3D" en selecteer "Scan" om 3D-contrast-versterkte beelden te verwerven en vervolgens op "Cine Store" om het beeld op te slaan.
      2. Druk op "3D" en klik op "Destroy 3D" om de microbellen vernietigen.
      3. Druk op de "3D" opnieuw en selecteer "Scan" om een ​​post-vernietiging cine lus verwerven, druk dan op "Cine Store".
   9. Genereren van de overlay-afbeelding frames pre- en post-vernietiging van microbellen:
      1. In de &# 8220; Reference Instellingen "aan de linkerzijde van het scherm klikt u op" Create Reference ".
      2. Druk op "Studie Management" aan de pre-vernietiging cine lus verworven openen.
      3. Klik op "Proces Cine" om de groene contrast overlay genereren en klik op 'laden in 3D ".
   10. Gebruik de Amerikaanse imaging software om de resulterende 3D-beeld voor het bloedvolume in de pluggen te kwantificeren:
       1. Druk op "Scan / Freeze" en vervolgens op "Mode instellingen".
       2. Klik op "Volume" en selecteer "Parallel".
       3. Een 3D-volume van het doelweefsel door segmentering een reeks contouren.
       4. Klik op "Finish" om de segmentatie te voltooien.
          OPMERKING: Het volume van het contrastmiddel wordt op de linker kant van het scherm worden weergegeven.
   11. Aan het einde van de procedure, plaats muizen in een warme, schone, droge en rustige omgeving, weg vanandere dieren. Zorgen voor warmte met behulp van een in de handel verkrijgbaar chirurgische verwarming pad of een gloeilamp (50-75 watt), geplaatst 12-14 centimeter afstand van knaagdieren. Monitor muizen continu tot het handhaven van een rechte houding en normaal lopen.

4. Evaluatie van de ECM-mimische Gel Plug vaatstelsel morfologie behulp Fibered confocale endomicroscopy

LET OP: dit deel van het protocol wordt uitgevoerd onmiddellijk na de Amerikaanse beeldvorming en het vereist voorkennis van de bediening van de fibered confocale endomicroscopy imaging-systeem, of de hulp van een erkende technicus.

1. Voordat u begint, moet u de volgende materialen en instrumenten klaar:
   1. Chirurgie tools zoals een tang, schaar en absorbeerbare naaigaren.
   2. FITC-geconjugeerd dextraan (70 KDa).
   3. Ijkoplossingen (drie buisjes met elk waterstofperoxide, water of TL-oplossing).
   4. Het beeldvormingssysteem en eenprobe geschikt voor beeldvorming van bloedvaten volgens fabrikant.
2. Verdoven muizen met ketamine (100 mg / kg) en xylazine (12 mg / kg).
3. Dien iv, via de staartader, 200 ui 10 mg / ml FITC-gelabelde dextran.
4. Ontsmet de buikstreek met behulp van een chirurgische scrub / alcohol en een kleine incisie van toepassing op ongeveer 1 cm van de stekker.
5. Plaats de endomicroscopy sonde boven de plug voorzichtig terwijl de stekker intact.
6. Acquisitie:
   1. Zodra de sonde is ingesteld op de stekker, drukt u op "Start laser" met behulp van het voetpedaal. De fluorescentie moet worden getoond op het scherm.
   2. Verwerven korte films (tot 30 sec) door op 'Record' op het scherm of 'Select' met behulp van het voetpedaal.
   3. Tussen films, was de sonde door het plaatsen van de tip in een buis met water.
   4. Wanneer u klaar bent, verwijdert u de sonde en het reinigen van de tip met een wattenstaafje.
7. Te analyseren gemiddelde veSSEL diameter:
   1. Klik op het pictogram "Detect microvessels" in het bovenste paneel om het schip detectie module te openen.
   2. Klik op "Voorkeuren" en markeer "Mean vatdiameter" in de "Statistiek van belang" en "Display histogrambalken" in de "Weergavemodus".
   3. Klik op "Detect" om de geselecteerde metingen weer te geven.
8. Om het fluorescentiesignaal intensiteit grenzend aan bloedvaten geanalyseerd:
   1. Klik op "Create cirkel ROI" in het linkerpaneel en maak een cirkel in het gebied van belang.
   2. Klik op "Compute histogram binnen ROI" om de waarden met betrekking tot deze regio te berekenen.

5. Postprocedurele Behandeling van Muizen

1. Aan het einde van elke imaging procedure, plaats muizen in een warme, schone, droge en rustige omgeving, weg van andere dieren. Zorgen voor warmte met behulp van een in de handel eenvailable chirurgische verwarming pad of een gloeilamp (50-75 W), geplaatst 12-14 in de buurt van knaagdieren. Monitor muizen continu tot het handhaven van een rechte houding en normaal lopen.
2. Voor verdere analyse van vascularisatie pluggen 'op extra tijd punten, gelden de volgende herstel voorwaarden:
   1. Hechten de kleine incisie met behulp van absorbeerbare hechtingen.
   2. Geef muizen analgesie zoals buprenorfine (1 mg / kg) subcutaan en terugkeren naar individuele kooien.
   3. Neem alle dieren om te bepalen of verdere pijnstillende behandeling nodig is en re-evalueren dagelijks te volgen en te beoordelen voor nood.
3. Aan het eindpunt van het experiment, inslapen muizen door eerst isofluraan, gevolgd door cervicale dislocatie.
4. Als aanvullende beeldvorming in de weken na de eerste beeldvormende stappen worden uitgevoerd, moeten alle procedures zo steriel mogelijk gehouden. Een chirurgische huid scrub moet worden uitgevoerd, steriel water en steriele wattenstaafjes worden gebruikt om de endomicroscopy probe reinigen, en de probe wordt gedesinfecteerd tussen elk dier met steriel water.

Resultaten

Implanteren van ECM-mimische gel stekkers met CM uit snelgroeiende angiogene tumor genereren cellijn U-87 MG, resulteert in een uitgebreide angiogenese. Dit vaatstelsel kan uitgebreid worden onderzocht met behulp van twee complementaire beeldvorming.

Microbellen contrast-versterkte Amerikaanse beeldvorming onthult uitgebreide werving van functionele bloedvaten in de plug door het illustreren uitgebreide bloedstroom binnen U-87 MG CM geladen stekkers, in tegenstelling tot niet-detecteerbare b...

Discussie

Compelmentaire beeldvormende methoden maakt het verwerven van informatie over verschillende angiogenese componenten 'microvessel dichtheid, functionaliteit en morfologie. Loading CM on ECM-nabootsende gel pluggen genereert een tumor micro-omgeving, die gescheiden is van andere celpopulaties, zoals endotheelcellen, die worden gerekruteerd en extravaseren in de plug.

Door het uitvoeren, in parallel, microbellen contrast-versterkte Amerikaanse beeldvorming en Fibered confocale endomicroscop...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Rotary Vacuum Evaporator	-	-	-
Growth-factors reduced phenol-free Matrigel	BD Bioscience	FAL356231	Ontdooi een nacht, bij 4 °C op ijs
Depilatory cream	-	-	-
Vevo2100 US imaging system	VisualSonics Inc.	-	Vereist voorkennis in het bedienen of de hulp van een erkende technicus
55 MHz 708 probe	VisualSonics Inc.	-	-
Vevo2100 imaging software	VisualSonics Inc.	-	-
VialMix	DEFINITY Imaging	VMIX	-
DEFINITY microbubbles	DEFINITY Imaging	DE4	Activeer gedurende 45 seconden met VialMix voor gebruik
CellVizio (Fibered confocal endomicroscope)	Mauna Kea Technologies	-	Vereist voorkennis in het bedienen of de hulp van een erkende technicus
ProFlex MiniO/30 probe	Mauna Kea Technologies	-	-
70 kD FITC-labeled dextran	Sigma-Aldrich	46945	-
ImageCell software	Mauna Kea Technologies	-	-
Calibration Kit	Mauna Kea Technologies	-	-
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Gibco Life Tecchnologies	41965-039
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries	04-007-1A
Penicillin/streptomycin/nystatin solution	Biological Industries	03-032-1B