-Sonicatie vergemakkelijkt immunofluorescentiekleuring van Late-fase embryonale en larvale Drosophila Weefsels In Situ

Samenvatting

Immuunkleuring is een effectieve techniek voor het visualiseren van specifieke celtypen en eiwitten in weefsels. Door het gebruik van sonicatie vermindert het hier beschreven protocol de noodzaak om Drosophila melanogaster weefsels van laat-stadium embryo's en larven te dissekeren voordat immunokleuring wordt uitgevoerd. We bieden een efficiënte methodologie voor de immunokleuring van formaldehyde-gefixeerde hele larven.

Samenvatting

Studies uitgevoerd in Drosophila melanogaster embryo's en larven leveren cruciale inzicht in ontwikkelingsprocessen zoals lot van de cel specificatie en organogenese. Immunokleuring maakt de visualisatie van ontwikkelende weefsels en organen. Echter, een beschermende cuticula die zich vormt aan het eind van embryogenese voorkomt permeatie van antilichamen in late-embryo's en larven. Terwijl dissectie voor immunokleuring wordt regelmatig gebruikt om Drosophila larvale weefsels analyseren inefficiënt sommige analyses blijkt omdat kleine weefsels moeilijk kan zijn te lokaliseren en te isoleren. Sonicatie biedt een alternatief voor dissectie in larvale Drosophila immunostaining protocollen. Het maakt een snelle, gelijktijdige verwerking van grote aantallen late-embryo's en larven en onderhoudt in situ morfologie. Na fixatie in formaldehyde, wordt een monster gesonificeerd. Monster wordt vervolgens onderworpen aan immunokleuring met antigen-specifiek primair antibodies en fluorescent gelabelde secundaire antilichamen aan doelcel types en specifieke proteïnen te visualiseren via fluorescentiemicroscopie. Tijdens het proces van sonicatie, juiste plaatsing van een sonicatie sonde boven het monster, alsmede de duur en intensiteit van sonicatie, kritisch. Additonal kleine wijzigingen standaard immunokleuring protocollen die noodzakelijk zijn voor hoge kwaliteit vlekken. Op antilichamen met een lage signaal-ruisverhouding, langere incubatietijden zijn typisch noodzakelijk. Als een proof of concept voor deze-geluidsgolven gefaciliteerd protocol, laten we immunostains van drie soorten weefsel (testikels, eierstokken, en zenuwweefsel) op een afstand van ontwikkelingsstadia.

Inleiding

Drosophila embryo's en larven bieden een uitstekend model om ontwikkelingsprocessen te studeren in veel organen en weefsels. Beeldvorming van afzonderlijke cellen is vaak noodzakelijk in deze studies om de complexe omgevingen waarin cellen ontwikkelen bepalen. Visualisatie van cellen in weefsels kunnen worden bereikt door immunokleuring. Goed beschreven immuunkleuring protocollen bestaan ​​voor embryonale Drosophila weefsels <17 uur na de eileg (AEL) ^1-3. Echter, een beschermende cuticula vormt tegen het einde van embryogenese voorkomende effectieve antilichaam permeatie. Aldus zijn deze immunokleuring protocollen inefficiënt in de analyse van weefsels in late-stadium embryo en in latere fasen van larvale ontwikkeling ^(1e instar (L1), ^2e instar (L2) en ^3e instar (L3)). Deze inefficiëntie legt een barrière voor ons begrip van de dynamische processen die optreden tijdens deze uitgebreide ontwikkelingsperiode ^4. Tissue dissectie is een uitgebreid toegepast techniek om deze barrière ^5-7 omzeilen. Echter, dissectie ondoeltreffend. Extractie kan worden bezwaard door de moeilijkheden bij het lokaliseren of het isoleren van embryonale en larvale weefsels. Verder kan de fysieke verwijdering van doelwitweefsels schade veroorzaken door scheuren hen of door niet uitpakken in hun geheel.

Sonicatie is een methode die geluidsgolven maakt gebruik van intermoleculaire interacties te verstoren. Het is gebruikt om de integriteit van de Drosophila larven cuticula verstoren om immunostain ontwikkelen neurale celtypes ^6. Dit protocol is aangepast om late-fase embryonale en larvale geslachtsklieren, van slechts 50 urn diameter ^8-10 kan immunostain. Door middel van deze studies, is het proces van de mannelijke kiembaan stamcellen (GSC) niche-formatie werd gekenmerkt in een vergevorderd stadium Drosophila embryo's ^8-10 en mechanismen tot regeling van stamcellen ontwikkeling en differentiatie in een vergevorderd stadium embryonale gonaden en larven zijn opgehelderd ^9-12. Aldus sonicatie biedt een efficiënt alternatief voor weefsel dissectie die kan moeilijk zijn vanwege weefselgrootte. Bovendien maakt immunokleuring van Drosophila weefsels in situ, waardoor cellen in de context van het hele organisme en handhaven situ morfologie. Hier is een stap-voor-stap protocol voor fluorescentie immunokleuring van late-fase embryonale beschrijven we door vroege / midden-L3 weefsels in situ. Analyse van Drosophila gonadale en neuraal weefsel in de Representatieve resultaten voor de werkzaamheid van dit protocol aangetoond. Bovendien kan dit immunokleuring protocol worden aangepast aan andere Drosophila weefsels en weefsels in andere organismen te analyseren met een buitenste cuticula.

Protocol

1 Voorbereiding van een collectie Cage

1. Verdoven jonge, vruchtbare vliegen met CO _2. Transfer verdoofde vliegt naar een kooi. Om optimale opbrengst te verkrijgen, gebruik 100-120 volwassen vliegen variëren van 2-7 dagen oud op een 4: 1 verhouding vrouwtjes mannetjes. Laat vliegt een passende acclimatiseringsperiode, ~ 24 uur voorafgaand aan het verkrijgen monster voor fixatie. Als de kooi werd opgezet met maagdelijke vrouwtjes gepaard met mannen, een gebruik van een 36 - hr acclimatiseringsperiode 48.
2. Aan het open uiteinde van de kooi, plaats een voorbereide appelsap agarplaat met een dime-sized druppel gistpasta in het midden over de opening van de kooi. Dan, stevig met tape. Dicht de kruising tussen de appelsap agar plaat en de kooi met Parafilm.
3. Plaats de kooi in een secundaire container met appelsap agar plaat als de basis en laat de vliegen te reproduceren bij een bepaalde temperatuur gedurende een passende periode van tijd, zoals bepaald door het experiment.
   Opmerking: Monsterneming keer will variëren. Bijvoorbeeld, bij het verzamelen late stadium embryo / vroege L1 larven (17-24 uur), laten vliegen eieren op appelsap agarplaten gelegd voor 7 uur bij 25 ° C vóór veroudering van het monster gedurende 17 uur bij 25 ° C. Ook voor een verzameling van larven mid-late eerste instar (36-48 uur) laten vliegen eieren leggen gedurende 12 uur bij 25 ° C vóór veroudering van het monster gedurende 36 uur bij 25 ° C.
4. Zodra de tijd is voltooid, tikt u op de kooi op een tafel, zodat vliegen vallen weg van de appelsap agarplaat zonder verdoving. Sluit meteen de gebruikte plaat met een verse met een druppel gistpasta. Bevestig de verse plaat met tape en parafilm en bewaar de kooi met appelsap agar plaat als basis.
5. Verwijder de gist daling van de gebruikte plaat met een metalen spatel voorzichtig. Plaats het deksel op de gebruikte appelsap plaat en laat gelegd embryo's leeftijd als experimenteel nodig.
   Opmerking: Tijdens het verouderingsproces monsters, kunnen de platen bij 25 ° C worden bewaard, tenzij hogere temperaturen zijn experimenlly vereist. Voorbeelden van hoe embryo's voor de collectie zijn hierboven beschreven ouder (zie toelichting voor stap 1.3). Verwijdering van gist deeg voorafgaand aan veroudering proeven uitgevoerd om de larven te voorkomen kruipen in de gist en het opbreken van de agar eronder. De resterende appelsap agar en gist Lijmresten voedingsstoffen voor larvale groei. Terwijl rechtstreeks volgens de gistpasta embryo verloren gaan gistpasta verwijderen, dit verlies de voorkeur gist en agar residu in het monster die kleuring efficiëntie verminderen. Indien men kiezen de gistpasta niet te verwijderen, kan gist worden vloeibaar gemaakt met fosfaatbuffer Triton X-100 (PBTx), gemengd met een kwast en daarna uit het monster met een cel zeef voor fixatie.

2 Fixatie

1. Eenmaal gelegd op de appelsap agarplaat's naar de gewenste tijdstip zijn gerijpt, met een kleine penseel bevochtigd met fosfaatbuffer Triton X-100 (PBTx) oplossing om zorgvuldig uit th verwijderen monstere plate.
   Opmerking: Oudere larven zijn mobiel en kan kruipen naar de binnenkant van het deksel. Dit monster kan op dezelfde manier worden verzameld door het verwijderen met een penseel.
2. Veeg de sample-beladen penseel tegen de binnenkant gerichte nok van een cel zeef. Daarna spoel de muren van de zeef en de penseel met een spuit fles met PBTx oplossing. Plaats een petrischaal deksel onder de zeef om de PBTx oplossing vast te leggen.
3. Na al het monster is overgedragen aan de zeef, giet genoeg PBTx in de zeef om het monster uit het gaas te verhogen. Til de zeef en giet de inhoud van de petrischaal in een vloeibaar afval container.
4. Herhaal stap 2.3 drie keer om gist te verwijderen en vliegen afval die mogelijk zijn overgedragen, samen met het monster.
5. Giet genoeg 50% bleekwater (NaOCl) / water (DDH ₂ O) oplossing in de zeef om de larven van de maas te tillen. Laat larven zitten in oplossing gedurende 5 minuten. Til de zeef en giet thij de inhoud van de petrischaal in een vloeibaar afval container.
   Opmerking: Bleach is alleen nodig in embryonale samples 0 t - 22 uur teneinde het chorion membraan te verwijderen. De toepassing van bleekwater om oudere monsters kunnen worden weggelaten, maar de opname is niet schadelijk. Als omissie is gewenst, vervang het bleekmiddel in deze stap met PBTx. Verdund bleekwater moet worden gebruikt binnen 24 uur van de oplossing voorbereiding.
6. Was monster in de zeef met PBTx door gieten genoeg PBTx in de zeef om het monster uit het gaas verhogen. Laat monster te zitten in oplossing voor 3 minuten. Til de zeef en giet de inhoud van de petrischaal in een vloeibaar afval container.
7. Herhaal stap 2.6 vijf keer.
8. Dep de onderkant van de cel zeef droog, daarna monster over in een scintillatieflesje met 1,75 ml PEMS oplossing met behulp van een penseel.
9. Werken in een geventileerde zuurkast, voeg 250 ul van 37% formaldehyde en 8 ml van reagenskwaliteit heptaan de scintillatieflesje.
   Let op: Formaldehyde en heptaan zijn gevaarlijk. Voor de veiligheid, blijven werken in een geventileerde zuurkast en draag geschikte handschoenen voor stappen 2,9-3,3.
10. Laat het flesje te schudden bij 200 rpm of soortgelijke matige snelheid gedurende 20 minuten.
11. Voeg 10 ml methanol scintillatieflesje zonder de voorafgaande waterfase en laat de flacon krachtig schudden bij 500 rpm gedurende 1 minuut.
    Opmerking: Methanol is gevaarlijk. Blijven werken in een geventileerde zuurkast en draag geschikte handschoenen.
12. Verwijder de flacon uit shaker en giet onmiddellijk inhoud in een cel zeef boven een vloeibaar afval container in de kap. Voeg extra methanol aan de flacon en lopen door de cel zeef als nodig is om ervoor te zorgen alle monster is genomen.
    Opmerking: Cell filters kan langzaam leeglopen. Om dit te verhelpen, drukt een laboratorium weefsel onderaan de cel zeef om de oplossing door de zeef sneller trekken. Methanol moet formaldehyde en heptaan zijnopgeslagen in daarvoor bestemde containers tot het weggooien volgens de institutionele richtlijnen.
13. Droge bodem van cel zeef met een klinisch weefsel vervolgens een penseel monster meegenomen in de zeef overbrengen naar een 1,5 ml microcentrifugebuis met 0,5 ml methanol.
    Opmerking: Als er meerdere scintillatieflesjes in gebruik zijn, voert u stap 2.12 en 2.13 een flesje op een moment om monster te voorkomen uitdrogen op mobiele filters.
14. Nadat het monster is toegevoegd aan de microcentrifugebuis verwijderen methanol met een pipet. Zorgen monster is neergedaald op de bodem van de buis.
15. Spoel monster in de microcentrifugebuis door toevoeging van ongeveer 0,5 ml methanol buis. Wachten voor het monster om vervolgens genoegen te verwijderen methanol met een pipet.
16. Herhaal stap 15 drie keer.
17. Voeg 0,5 ml methanol aan de buis, en vervolgens op te slaan in een -20 ° C vriezer voor later gebruik.

3 Rehydratie en Voorbereiding van de Steekproef voor Immunokleuring

1. Verwijder methanol uit de microcentrifugebuis met een pipet, waardoor het monster in de buis. Store methanol afval naar de daarvoor bestemde container op het moment van weggooien.
   Opmerking: sonicatie efficiëntie, gebruik niet meer dan 3 mm monster zich op de bodem van 1,5 ml microcentrifugebuis. Excess monster worden overgebracht naar een afzonderlijke buis met een pipet, alvorens met de rehydratatietrap hierboven. Het snijden van de pipetpunt met een schone scheermesje kunnen worden gebruikt om verstopping van de pipetpunt voorkomen.
2. Voeg 1,0 ml van een 50% methanol / fosfaatbuffer Tween (PBTw) oplossing aan de buis en rock gedurende 3 minuten.
3. Verwijder methanol oplossing voor de juiste afvalbak en spoel af met 1,0 pi PBTw tweemaal. Na elke spoeling de sample te regelen vóór het tekenen van de PBTw met een pipet.
4. Voeg 1,0 ml van Bovine serum albumine / fosfaat gebufferde Tween (BBTw) mixen om de flacon en rock. Na 3 min op een rocker, laat de sample om zich te vestigen en te verwijderen van de BBTw met pipet.
5. Herhaal stap 3.4 tweemaal zorg zoveel BBTw mogelijk verwijderen zonder na de laatste wasbeurt verlies monster.
6. Voeg 0,5 ml van BBTw aan de buis en plaats de buis op ijs.

4 Sonicatie van Monster

1. Stel de sonicator tot 10% maximale amplitude en wijst een looptijd van 2 sec constant geluidsgolven.
   Opmerking: Deze instellingen zijn specifiek voor de in de materialen en apparatuur Tabel sonicator en kan optimalisatie voor verschillende sonicators vereisen.
2. Voorafgaand aan ultrasoonapparaat van het monster, het reinigen van de sonicator sonde door het plaatsen van de sonde in een 50 ml conische buis gevuld met gedemineraliseerd water en run sonicator om de sonde te reinigen. Droog sonicator sonde met laboratorium weefsel na run.
3. Dompel de sonde in de microcentrifugebuis bevattende monster zodat het zich ongeveer 3-4 mm boven het monster en begin sonicatie.
4. Verwijder de microcentrifuge buis en plaats op ijs gedurende ten minste 30 seconden om warmte van sonificatie en laat monster bezinken op de bodem van de microcentrifugebuis.
5. Herhaal de stappen 4.3 en 4.4 als nodig is gebaseerd op leeftijd monster wordt verwerkt.
   Opmerking: Voor een optimale sonicatiebuffer monstervolume, embryo's die jonger zijn dan 17 uur hoeft geluidsgolven niet nodig, maar die tussen 17 en 24 uur (stadium 17 / vroege-L1) vereisen twee sonications. Larven tussen de 24 - 36 (vroege / midden-L1), 36-48 (half / eind-L1), 48 - 60 (vroege / midden-L2), 60-72 (half / eind-L2), 72-84 ( begin-L3), 84-96 (vroege / mid-L3), 96-108 (mid / late-L3) hr vereisen 5, 9, 11, 13, respectievelijk 15, 18 en 22 sonications. Zie de bespreking voor het verder uitwerken van geluidsgolven tijden.
6. Spoelen met 1,0 ml BBTw tweemaal. Na elke spoeling laat het monster te regelen alvorens af BBTw met een pipet.
7. Voeg 1,0 ml van BBTw aan de flacon en rock. Na 3 min op de wip, het monster op te lossen en te verwijderen van de BBTw met pipet.
8. Herhaal stap 4.7 twee keer.

5 Immunokleuring

1. Blokkeer monster door toevoeging van 5% normaal serum verdund in BBTw de microcentrifugebuis. Verwijder blok na schommelen gedurende 1 uur.
   Opmerking: Gebruik een normale serum van de soorten waarbij de secundaire antilichamen worden opgewekt.
2. Verdunnen primaire antilichamen te eigenen werken concentratie in 5% normaal serum / BBTw oplossing.
3. Rock monster primaire antilichaamoplossing O / N bij 4 ° C of gedurende ten minste 3 uur bij kamertemperatuur (ongeveer 22 ° C.
   Opmerking: Antibody incubatie tijden en temperaturen kunnen variëren. O / N incubatie bij 4 ° C of 3 uur bij kamertemperatuur is meestal voldoende. Er kan evenwel een tweedaagse incubatie afgevend verbeteren, vooral bij oudere monsters of wanneer lage affiniteit primaire antilichamen gebruikt. Langere incubaties worden typisch uitgevoerd bij 4 ° C. Soortgelijke overwegingen moeten wordt opgenomen met secundaire antilichamen (zie 5.10).
4. Laat monster om zich te vestigen opbodem van microcentrifugebuis. Tap primaire antilichamen met pipet. Besparen indien gewenst antilichamen voor hergebruik.
5. Spoelen met 1,0 ml van BBTw tweemaal. Na elke spoeling toe monster te regelen alvorens af BBTw met een pipet.
6. Voeg 1,0 ml van BBTw aan de flacon en rock. Na 3 min op de wip, zodat monster om zich te vestigen en te verwijderen BBTw met pipet.
7. Herhaal stap 5.6 vijf keer.
8. Vak monster door toevoeging van 5% normaal serum / BBTw oplossing voor de microcentrifugebuis. Verwijder blok Schud gedurende 30 minuten tot 1 uur.
   Noot: de extra blokkering stap is niet vereist, maar kan afgevend specifieke antilichamen te verbeteren.
9. Verdunnen secundaire antilichamen te eigenen werken concentratie in 5% normaal serum / BBTw oplossing.
10. Wikkel microcentrifugebuis in aluminiumfolie te verminderen verkleuring door blootstelling aan licht. Rock monster secundair antilichaam oplossing 12 tot 48 uur bij 4 ° C of gedurende ten minste 3 uur bij kamertemperatuur (ongeveer 22 ° C.
11. Laat monster te regelen tot de onderkant van microfugebuis. Tap secundaire antilichamen met pipet.
12. Spoelen met 1,0 ml van PBTw tweemaal. Na elke spoeling toe monster te regelen vóór het tekenen van de PBTw met een pipet.
13. Voeg 1,0 ml van PBTw aan de flacon en rock. Na 5 min op de wip, het monster op te lossen en te verwijderen van de PBTw met pipet.
14. Herhaal stap 5.13 drie maal.
15. OPTIONEEL: Voeg DAPI- verdund 1: 1.000 in PBTw. Rock monster gewikkeld in aluminiumfolie gedurende 3 minuten; verwijder vervolgens DAPI oplossing met een pipet. Spoel vijf keer met 1,0 ml van PBTw, waardoor sample te regelen voordat PBTw verwijderen met pipet.
16. Toevoegen 80-100 gl 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octaan (DABCO) oplossing microcentrifugebuis en bewaar bij -20 ° C.
    Opmerking: Een andere-glycerol gebaseerde anti-fade middel kan worden vervangen.

6 Analyse

1. Voor de montage van monster op dia's, een extra 5 - 10 ul van DABCO / p-phenyleendiamine (PPD) antifade oplossing voor microcentrifugebuisje.
   Opmerking: De steekproef kan tot dia's worden toegevoegd zonder dissectie. Monstervolume toegevoegd aan een dia varieert met dekglas grootte. Bij het pipetteren monster op dia, kan de pipet worden afgesneden met een scheermesje om monster scheren voorkomen. Het is vaak handig om monster line-up in rijen voor eenvoudige analyse. De toevoeging van PPD als extra antifade middel kan niet vereist, maar kan voorkomen fotobleken wanneer monsters worden bewaard op lange termijn.
2. Plaats voorzichtig glazen afdekplaat slip of een monster. Dan, veilige dekglas op zijn plaats met behulp van nagellak.
3. Bekijk gemonteerde monster met behulp van fluorescentie microscopie.

Resultaten

Om de werkzaamheid van sonicatie gebaseerde immunokleuring in analyse van laat-stadium embryonale en larvale weefsels in situ aantonen, werden wildtype embryo's en larven bewerkt voor immunokleuring van testes, ovaria en zenuwweefsel. Monsters werden afgebeeld via confocale microscopie en representatieve resultaten worden getoond (Figuur 1 en Figuur 2). Resultaten blijkt dat het beschreven protocol is effectief voor het visualiseren van morfologische kenmerken als individue...

Discussie

Dit protocol verschaft een werkwijze succesvol immunostain richten Drosophila embryonale en larvale weefsels in situ, waardoor de noodzaak voor dissectie. Als per eerdere protocollen voor het kleuren van de vroege embryo's ^1,2,3, is het chorion membraan verwijderd met behulp van 50% bleekwater (NaOCl). Monsters worden gefixeerd in formaldehyde en methanol. Omdat de larvale cuticula veroorzaakt oudere monster drijven, wordt het gehele monster vervolgens door een cel-zeef om larvale retent...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Tabel 1: Reagentia en buffers
Fosfaatbuffer Triton X-100 (PBTx)			Voor 5 L: 500 ml PBS 10X, 4,45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Bewaren bij RT.
Fosfaatbufferzoutoplossing 10X (PBS 10X)			Voor 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4. Componenten toevoegen en aanvullen tot het juiste volume. Bewaren bij 4 °C.
Triton 10%			Voor 50 ml: 5 ml Triton, 5 ml PBS 10X, 45 ml ddH2O. Schudden om te mengen. Bewaren bij RT.
PEMS			0,1 M Pipes (pH 6,9), 2,0 mM MgSO4, 1,0 mM EGTA. Bewaren bij RT.
Pipes			Voor 400 ml van een 0,25 M oplossing (pH 6,9): 30,24 g Pipes dH20 NaOH. Pipes oplossen in 300 ml dH2O en vervolgens aanpassen naar pH 6,9 met NaOH. Het totale volume brengen naar 400 ml met dH2O en autoclaveren. Bewaren bij RT.
Formaldehyde			37% formaldehyde naar gewicht in methanol. Bewaren bij RT. Bewaren van formaldehyde, heptaan en methanol afvalmix in een goed afgesloten container in een afzuigkap voordat het wordt weggegooid volgens de institutionele richtlijnen.
Heptaan		CAS 142-82-5	n-Heptaan. Bewaren bij RT. Bewaren van formaldehyde, heptaan en methanol afvalmix in een goed afgesloten container in een afzuigkap voordat het wordt weggegooid volgens de institutionele richtlijnen.
Methanol		CAS 67-56-1	Bewaren bij RT. Bewaren van formaldehyde, heptaan en methanol afvalmix in een goed afgesloten container in een afzuigkap voordat het wordt weggegooid volgens de institutionele richtlijnen.
Fosfaatbuffer Tween (PBTw)			Voor 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter steriliseren na het toevoegen van alle componenten. Bewaren bij 4 °C.
Tween 10%			Voor 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml PBS 10X, 40 ml ddH2O. Schudden om te mengen. Bewaren bij RT.
Rundserumalbumine/fosfaatbuffer Tween (BBTw)			Voor 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g rundserumalbumine (BSA). BSA toevoegen en vervolgens steriliseren met behulp van een 0,2 μm vacuümfilterunit. Bewaren bij 4 °C.
Normaal geitenserum (NGS)	ackson ImmunoResearch Laboratories	005-000-121	Voor 10 ml: normaal geitenserum 10 ml ddH2O. ddH2O toevoegen aan flesje NGS en steriliseren met behulp van een 0,2 μm spuitfilter. Aliquots bewaren bij -20 °C.
1,4-diazabicyclo[2.2.2]octaan (DABCO)		CAS: 281-57-9	Voor 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7,5), 2,5 g DABCO-solid, 3,5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beker met roerstaaf, ddH2O, Tris HCl en DABCO toevoegen. Roeren en vervolgens 6N HCl, 10 N NaOH en glycerol toevoegen. Vervolgens 10N NaOH druppelsgewijs toevoegen totdat de oplossing pH 7,5 bereikt. Aliquots. Aliquots bewaren bij -20 °C.
DABCO + p-fenyleendiamine (PPD)-oplossing			1,765 ml NaHCO3, 0,353 Na2CO3, 0,02 g PPD (CAS: 106-50-3). PPD oplossen in NaHCO3 en NaCO3-oplossing. Voeg 60 μl PPD-oplossing toe aan 500 μl DABCO. Aliquots bewaren bij -20 °C.
Appelsapplaten			Voor ~200 platen: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g kristalsuiker (in de winkel gekocht), 500 ml appelsap (in de winkel gekocht), 15 ml Tegosept 10%, 1,5 ml ddH2O. Agar toevoegen aan ddH2O in 4 L fles en vervolgens 30 min autoclaveren. Appelsap en suiker mengen op een verwarmde roerplaat. Geleidelijk appelsapmengsel toevoegen aan geautoclaveerde agar. Mengen op een verwarmde roerplaat en vervolgens 10 ml volumes verdelen in 35 mm petrischalen en laten staan bij RT om te stollen. Bewaren bij 4 °C.
Tegosept 10%			Voor 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Aliquots bewaren bij -20 °C.
Gistpasta			~50 g droge actieve gist. Geleidelijk ddH2O toevoegen aan beker met gist onder roeren tot paste-achtige consistentie bereikt is. Bewaren bij 4 °C.
Tabel 2: Materiaal voor kleuring
DAPI	Invitrogen	D3571	1:1000, voorraad bij 5 mg/ml.
Konijn anti-Vasa