Een efficiënte methode voor kwantitatieve, single-cell analyse van chromatine modificatie en Nucleaire Architectuur in zijn geheel-mount Ovules in Arabidopsis

Summary

Wij bieden hier een efficiënt en betrouwbaar protocol voor immunokleuringen, fluorescentie in situ hybridisatie, DNA kleuring gevolgd door kwantitatieve, hoge-resolutie beeldvorming in whole-mount Arabidopsis thaliana eitjes. Deze methode is succesvol gebruikt om chromatine modificaties en nucleaire architectuur te analyseren.

Abstract

In bloeiende planten, is de somatische-to-voortplantingscel lot overgang gekenmerkt door de specificatie van spore moeder cellen (SMC) in floral organen van de volwassen plant. De vrouwelijke SMC (megaspore moeder cel, MMC) onderscheidt in het eitje primordium en ondergaat meiose. De geselecteerde haploïde megaspore ondergaat mitose aan de meercellige vrouwelijke gametofyt, die aanleiding zal geven aan de gameten, de eicel en de centrale cel te vormen, samen met accessoire cellen. De beperkte toegankelijkheid van de MMC, meiocyte en vrouwelijke gametofyt in de eicel is technisch uitdagend voor cytologische en cytogenetische analyses op enkel cel niveau. In het bijzonder wordt direct of indirect immunodetectie van cellulaire of nucleaire epitopen aangetast door slechte penetratie van de reagentia in de plantencel en single-cell imaging wordt demised door het gebrek aan optische helderheid geheel-mount weefsels.

Aldus wordt een efficiënte manier de Nucl analyseren ontwikkelden weoor organisatie en chromatine modificatie op hoge resolutie van enkele cel in whole-mount ingebed Arabidopsis eitjes. Het is gebaseerd op dissectie en inbedding van vaste eicellen in een dunne laag acrylamide gel op een microscopisch preparaat. De ingesloten eitjes worden onderworpen aan chemische en enzymatische behandelingen ter verbetering weefsel duidelijkheid en permeabiliteit voor de immunokleuring reagentia. Die behandelingen behouden cellulaire en chromatine organisatie, DNA en eiwitten epitopen. De monsters kunnen worden gebruikt voor verschillende stroomafwaartse cytologische analyse, waaronder chromatine immunokleuring, fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), en DNA kleuring voor heterochromatine analyse. Confocale laser scanning microscopie (CLSM) beeldvorming met hoge resolutie, gevolgd door 3D reconstructie maakt kwantitatieve metingen bij eencellige resolutie.

Introduction

In bloeiende planten, de oprichting van reproductieve geslachten begint met de differentiatie van SMC, MMC vrouwelijke en mannelijke microspore moeder cel. De MMC ontwikkelt zich uit een sub-epidermale nucellar cel aan het distale uiteinde van de eicel primordium, en de microspore moeder cel ontwikkelt zich vanuit sporogenous weefsel in de helmknop locule, die zich diep in de bloemen organen ^1. SMC ondergaan meiose tot haploïde sporen, die vervolgens leidt tot de gametofyten bij mitose produceren. Het vrouwtje gametofyt of embryozak, bestaat uit een eicel, een centrale cel, twee synergiden en drie antipodals. De mannelijke gametofyt, of pollen, bestaat uit....

Protocol

De procedure wordt beschreven in de workflow in figuur 1, en ​​de opstelling voor dissectie en inbedding van weefsels zijn weergegeven in figuur 2.

1. Tissue Fixation

1. Verzamel 20-30 carpels in een microfugebuis met vers gemaakte BVO fixatief buffer op ijs.
2. Bevestig het weefsel 30 minuten onder zacht schudden bij kamertemperatuur.
3. Draai de buisjes met de carpels in fixeermiddel in een tafelmodel microcentrifuge 1 min bij 400 x g.
4. Verwijder voorzichtig het fixatief buffer en voeg 1 ml van PBT, plaatst de buizen op ijs.

2. Dissection a....

Results

Wij bieden een robuust protocol voor grootschalige bereiding en verwerking van Arabidopsis eicellen geschikt zijn voor cytologische kleuring in whole-mount. Door de inbedding, de zaadknoppen behouden van een 3-dimensionale structuur (Figuur 3). Bovendien, het weefsel verwerking, met inbegrip van optische verduidelijking stelt beeldvorming subcellulaire structuren op een hoge resolutie. Figuur 4 toont DNA kleuring in whole-mount eitje primordia waar heterochromatin verschijnt zo.......

Discussion

In bloeiende planten, wordt het vrouwelijke reproductieve lineage omgeven door verschillende cellagen waaronder de nucellus en de eicel Zaadhuiden, dus waardoor cytologische kleuring in whole-mount technisch uitdagend. Hier geven we een efficiënt protocol waarvan de bereiding en verwerking van een groot aantal eicellen voor cytologische kleuring als immunokleuring, DNA-kleuring en fluorescentie in situ hybridisatie geheel-mount. Wij hebben met succes gebruikt voor de analyse van het vrouwelijk voortplantingssys.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
BVO Fixation Buffer (based on32)			2 mM EGTA, pH 7.5, 1% (v/v) formaldehyde, 10% DMSO, 1x PBS, 0.1% Tween-20
PBT			1x PBS, 0.1% Tween-20
PBT-F			1x PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde
30% acrylamide:bisacrylamide			3 g acrylamide, 0.33 g bisacrylamide, 1x PBS (prepare 10 ml, store at 4 °C)
200 ml 5% acrylamide mix in PBS			34 ml 30% acrylamide:bisacrylamide, 166 ml 1x PBS (make fresh from 30% stock)
20% ammoniumpersulfte			0.2 g ammoniumpersulfte, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C)
20% sodium sulfite			0.2 g sodium sulfite, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C)
Cell wall enzyme mix			0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase
Reagents and Materials
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F1635
DMSO	Sigma	D5879
Tris	Amaresco	0497
Ethanol	Schaurlau	ET00102500
Methanol	Schaurlau	ME03062500
Xylene	ROTH	4436.1
Cellulase	Sigma	1794
Driselase	Sigma	D8037
pectolyase	Sigma	P5936
Tween-20	Merck	8.22184.0500
EGTA	Sigma	E-4378
acrylamide	Sigma	A-3553
bisacrylamide	Sigma	M2022	toxic
ammoniumpersulfate	Sigma	A9164
Sodium sulfite	Fluka	71988
Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4)	Upstate	07-473
Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27)	Upstate	07-448
Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L)	Molecular Probe	A11008
ProlongGold	Invitrogen	P36934
Propidium iodide	Sigma	P4170	toxic
DAPI	Sigma	D9542	toxic
RNAse A	Roche	10109169001
Coplin jar	Huber & CO	10.055
Forceps	DUMONT BIOLOGY
Shaker	Heidolph	543-12310-00-0
Moist chamber			A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water.
Superfrost Plus slide	Thermo Fisher	J1800AMNZ	Menzel-Gläser
FISH Tag DNA KIt	Invitrogen	F32947
GFP booster	Chromotek