Karakterisering van Multi-layered Fish Scales ( Atractosteus spatel) Met behulp Nanoindentation, röntgen-CT, FTIR en SEM

Samenvatting

Dit document presenteert de voor sonderen ruimtelijk gecorreleerde chemische, structurele en mechanische eigenschappen van het meerlagige omvang van Atractosteus spatel (A. spatel) met nanoindentation methoden Fourier transformatie infrarood (FTIR) spectroscopie, scanning elektronen microscopie (SEM), en X- ray tomografie (X-ray CT). De experimentele resultaten zijn gebruikt om de ontwerpprincipes beschermende biologisch materiaal onderzocht.

Samenvatting

De hiërarchische structuur van beschermende biologische materialen zoals gemineraliseerde schubben, gastropod schelpen, ramshoorn, geweien, en schildpad schelpen biedt een uniek design principes met mogelijkheden voor het begeleiden van het ontwerp van beschermende materialen en systemen in de toekomst. Inzicht in de structuur-eigenschappen relaties voor deze materiële systemen op microschaal en nanoschaal waar falen initieert is essentieel. Momenteel experimentele technieken zoals nanoindentation, röntgen CT en SEM bieden onderzoekers een manier om het mechanische gedrag hiërarchische microstructuur van deze materiaalsystemen ^1-6 correleren. Echter, een goed gedefinieerde standaard procedure voor het prepareren van gemineraliseerde biomaterialen is momenteel niet beschikbaar. In deze studie, de methoden voor het sonderen van ruimtelijk gecorreleerde chemische, structurele en mechanische eigenschappen van de meerlagige schaal van A. spatel gebruiken nanoindentation, FTIR, SEM, met energy-dispersieve X-stralen (EDX) microanalytica en X-ray CT worden gepresenteerd.

Inleiding

Onderzoekers onderzoeken structurele biomaterialen en proberen de ontwerpprincipes, die structurele biomaterialen met verbeterde mechanische eigenschappen zoals veel hogere taaiheid en sterkte in vergelijking met de afzonderlijke bestanddelen helderen. Het onderzoek naar de ontwerp principes van gepantserde schubben voor Pagrus grote ^7, Polypterus senagalus ^2,6, Arapaima gigas ^3, Cyprinus carpio ^4, en Atractosteus spatel ¹ hebben de noodzaak om de toepassing van bestaande experimentele methoden uit te breiden naar de structurele antwoorden te bestuderen aangetoond en microstructurele kenmerken, aangezien gedetailleerde standaardprocedures zijn niet beschikbaar voor dit soort materialen en experimenten.

Van de verschillende gepantserde schubben besproken A. spatel is een historisch toproofdier van de centrale US ⁸ en is een soort met een hogely gemineraliseerde schalen. De soort uitwisselingen spiermassa voor massale huid een verbeterde roofdier afweersysteem te verkrijgen in vergelijking met de vis van vergelijkbare grootte eerder ⁹ vermeld. Volgens de pagina en Burr ^10, A. spatel is de derde grootste zoetwatervis in Noord-Amerika met de witte steur (Acipenser transmontanus) en de Atlantische steur (Acipenser oxyrhynchus) zijn grotere soorten. De zeer gemineraliseerde schubben van A. spatel worden pas recent bestudeerd. Thompson en McCune ¹¹ suggereerde dat de morfologie van de gar schalen een drielaagse composiet bestaande uit een ganoine buitenlaag, een diffuse laag bot en lamellair bot laag. Lopende onderzoek naar de A. spatel schalen hebben niet onderscheiden op het bot laag in diffuse of lamellaire bot regio, maar heeft net bestudeerd het bot regio als een binnenlaag ^1,12.

In deze studie, de procedures voor de inonderzoeken ten microstructuur, nanostructuur, chemische samenstelling, en ruimtelijke verdeling van de mechanische eigenschappen van de schalen van A. spatel op de resultaten van FTIR spectroscopie, SEM, röntgen CT en nanoindentation technieken worden gepresenteerd.

Protocol

1. Vis Schaal Monsterbereiding

Voor deze studie werden schalen verkregen van het Amerikaanse leger Engineer Research and Development Center (ERDC) Environmental Laboratory in midden van de lengte (29 ^th caudale kolom) van een ongeveer 600 mm lang gar (A. spatel). De schubben werden verkregen volgens de ERDC en National Institute of Health (NIH) dierverzorging richtlijnen.

1. Materieel
   Noteer de ruimtelijke locatie van de vis van de voor de studie schalen. Zorg ervoor dat u zich te houden aan de juiste organisatie of de overheid richtlijnen voor het verkrijgen van biologische monsters zoals de NIH dier zorg richtlijnen. Bewaar de schalen in een passend medium zoals fosfaat gebufferde zoutoplossing hydratatie behouden en mineralen behouden wanneer ze uit de vis. Langdurige opslag die kan resulteren in minerale verlies, dat de nanoindentation gegevens kunnen beïnvloeden. Gebruik een medium borstel en tweezers naar ander zacht weefsel uit de harde schilfers te verwijderen.
2. Specimen Montage en Snijden
   Behandeling van een dwarsdoorsnede van de vis schaal korte-as (figuur 1) met FTIR en nanoindentation vereist eerste montage van de schaal in een stijve medium zoals een tweecomponenten bestaande uit een hars en verharder. Gebruik algemeen gebruik RT uithardende epoxy met lage piek temperaturen zoals de zakelijke doeleinden epoxy gebruikt in deze studie die een piektemperatuur lager dan 55 ° C had

Figuur 1. X-ray CT-beelden van A. spatel schaal die de korte-as dwars sectie in deze studie van A. onderzocht spatel gebruiken nanoindentation en FTIR [A (anterior), P (posterior), D (dorsale), V (ventrale)].

2. 1. Houd de vis schaal in een 32 mm diameter monster mal met behulp van een los verkrijgbare plastic monsterhouder. Dit houdt de steekproef correct georiënteerd tijdens de montage in de epoxy.
   2. Nadat het monster wordt in de matrijs, giet de uitgeharde epoxy op het monster en laat de epoxy harden volgens de aanwijzingen van de fabrikant.
   3. Nadat de epoxy is uitgehard, het gedeelte gemonteerd monster met behulp van een diamantzaag hoge precisie afkortzaag op de middellijn van het monster.
   4. Ultrasone trillingen in gedestilleerd water gedurende 15 minuten om alle vuil uit het monster te verwijderen.
3. Polijsten Nanoindentation en FTIR
   Om een gladde vlakke oppervlak te verkrijgen voor nanoindentation zoals weergegeven in figuur 2, de volgende polijsten procedure en parameters worden voorgesteld op basis van gesprekken met de polijstmachine fabricage en proefmonsters. Maar de parameters moet mogelijk worden aangepast voor verschillende biomaterialen gebaseerd op de antwoordenzoals het verwijderen van materiaal tarieven. Ultrasone trillingen monsters in een bad gedestilleerd water tussen polijststappen essentieel deeltjes garanderen een grovere polijststap worden niet gebruikt in een volgende fijnere polijststap.

Figuur 2. Afbeelding van een gepolijste korte-as dwars sectie A. spatel schaal gemonteerd in epoxy.

4. 1. Grof polijsten met een 15 urn SiC pad en water als smeermiddel, totdat het monster is vlak met de automatische polijstkop kracht van 7 lbf en snelheid van 200 omwentelingen per minuut (rpm).
   2. Ultrasone trillingen het monster in een bad met gedestilleerd water gedurende 15 minuten.
   3. Intermediate polish met een 6 micrometer SiC pad met water glijmiddel op een glasplaat snelheid van 130 rpm en een kracht van 7 lbf voor5 min.
   4. Sonificeer monster in een bad met gedestilleerd water gedurende 15 minuten.
   5. Pools met een 1 micrometer SiC pad met water glijmiddel op een glasplaat snelheid van 130 rpm en een kracht van 7 lbf gedurende 5 minuten.
   6. Ultrasone trillingen het monster in een bad met gedestilleerd water gedurende 15 minuten.
   7. Definitieve polijsten met een 50 nm colloïdale silica suspensie met een geschikt polijstkussen zoals een hoge dichtheid, non-woven, low-nap poreus polyurethaan dat een fabrikant suggereert 50 nm suspensies. Pools met een snelheid van 130 rpm met een kracht van 7 lbf gedurende 5 minuten.
   8. Ultrasone trillingen het monster in een bad met gedestilleerd water gedurende 15 minuten.

2. Nanoindentation Testing

1. Kalibreer de nanoindentation systeem voor elke batch van testen per de fabrikanten richtlijnen. De kalibratie moet ook de bepaling van het gebied de functie van het systeem voor de Berkovich tip en stijfheid. Daarnaast is het uitvoeren van een microscoop-to-indenter calibratie bij deze stapte zorgen voor de streepjes correleren met de gekozen locaties microscoop.
2. Plaats het monster in de nanoindenter en gebruik de optische microscoop controles op de nanoindenter waarmee het monster in beeld te brengen.
3. Gebruik de software controles met het model te verplaatsen naar de locatie voor de eerste streepje. Idealiter is dit ongeveer 10 micrometer in de epoxy uit de rand van de ganoine laag langs de middellijn van de doorsnede van de weegschaal.
4. Voer 4 parallelle rijen van streepjes afstand 15 micrometer uit elkaar om het verkrijgen van een statistisch significante dataset vanaf deze plaats. Stel de nanoindenter om een ​​maximale belasting van 5 mN, laden en lossen tarieven van 0,1 mN / sec, een wachttijd van 30 sec, en een minimum streepje afstand van 5 micrometer voor elke rij. De rij van streepjes moet worden ingesteld op loodrecht op de ganoine oppervlak lopen, en een voldoende aantal streepjes moeten worden gespecificeerd om te reizen over de doorsnede van de schaal, terwijl het doorkruisen van ongeveer 10 micrometer in de Epoxy langs de benige laag.
5. Als de partij is voltooid, hebben de nanoindenter maken de vaste streepjes met een maximale belasting van 100 mN bij het eerste en laatste streepje, die moet worden in de epoxy voordat de ganoine laag en na het bot laag, respectievelijk. Deze correleren met het begin-en eindpunten voor elke rij streepjes.
6. Na nanoindentation, plaats het monster terug in de PBS-oplossing om verdere uitdroging te voorkomen.
7. Gebruik nanoindentation software om de modulus en hardheid op basis van Oliver-Pharr methode ¹³ bepalen of een tijdsonafhankelijke materiaal respons waargenomen. Anders kan het hold-tijd moeten worden uitgebreid tot de kruip waargenomen te snel lossen overwinnen.

3. Ruimtelijk opgeloste ATR-FTIR spectroscopie

Het gebruik van een dia-ATR attached een FTIR microscoop is een voorgestelde methode om ruimtelijk opgeloste verzamelen Fourier transformatie infrarood (FTIR) spectra van de layers in een vis schaal monster. De ATR accessoire maakt collectie van hoge kwaliteit spectra met zeer kleine (~ 10 urn ²⁾ ruimtelijke resolutie, die niet bereikbaar is met andere FTIR techniek. Dezelfde gepolijst monster (figuur 2) voorbereid nanoindentation experimenten werd gebruikt in deze experimenten.

1. Kies een monster met een oppervlak en de juiste afmetingen voor de FTIR microscoop wordt gebruikt voor analyse te zorgen voor een hoge kwaliteit spectra verkregen van ATR-FTIR spectromicroscopy.
2. Bereid de FTIR microscoop om gegevens te verzamelen. FTIR microspectroscopie vereist kalibratie van de FTIR signaal onder dezelfde voorwaarden als steekproef worden gebruikt voor het meten van het monster. Typisch, dit omvat het koelen van de detector en het toestaan ​​van tijd voor om te stabiliseren, alsmede het verzamelen van alle achtergrond spectra en monster spectra onder dezelfde omstandigheden. Dit kan vooral van belang zijn, omdat CO ₂ en waterdamp in de lucht kan dramatically invloed FTIR spectra. Het is ook belangrijk dat de optische instrument uitgelijnd.
3. Verzamel een passende achtergrond spectrum om het monster af te trekken tegen. Voor deze experimenten werd een gepolijste, goud gecoate objectglaasje gebruikt als achtergrond voor FTIR spectromicroscopy.
4. Met behulp van een geschikte doelstelling, gericht op het monster en selecteer een gebied van belang voor de analyse.
5. Zodra een gebied van belang wordt gevonden, bevestigt de ATR accessoire voor de FTIR microscoop doelstelling, het monster te verhogen totdat het maakt intiem contact met de ATR interne reflectie-element, en het verzamelen van een monster spectrum.
6. Na het verzamelen van de FTIR spectra, verricht de noodzakelijke standaard data verwerking.

4. X-ray Computed Tomography (CT)

1. Verkrijgen en schaal bereiden zoals besproken in hoofdstuk 1.1
2. Scanner Setup
   1. Warm-up van de X-ray source volgens de specificaties van de fabrikant.
   2. Set X-ray spanning en stroom tot 50 kV en 160 uA, respectievelijk.
   3. Stel belichtingstijd tot 1.450 msec.
   4. Selecteer een 1,0 mm aluminium filter.
   5. Vóór het laden monster, maak een flatscreen-veld correctie wanneer de X-ray source is uit (donker-veld) en op (bright-field).
3. Mount and Load Specimen
   Schalen moet zodanig worden gemonteerd dat ze niet verschuiven of verplaatsen in de lengte van de scan. Deze monsters kunnen ook worden bevestigd met materialen die bijna transparant röntgenstraling. Een combinatie van piepschuim en Parafilm kan worden gebruikt om de schaal te bevestigen aan de CT podium.
   1. Vast zet het monster zodat de langste afmeting evenwijdig aan de detector.
   2. Bevestig de gemonteerde monster op de scanner podium.
   3. Plaats het monster zodat het in het rotatiecentrum tijdens de scan.
   4. Selecteer de hoogste resolutie waarbij het gehele schaal in het gezichtsveld (FOV), in casu7,5 urn.
4. Acquisitie Instellingen
   Voer scan in deze studie met een roterende stap van 0,25 ° en een frame gemiddelde waarde van 15. Bij lagere resoluties aanvaardbaar, verhoging van de stapgrootte en / of verlagen lijst gemiddelde de totale scantijd verminderen.
5. Reconstructie Parameters
   Zodra een dataset wordt verkregen, reconstrueren de X-ray projectie beelden naar een data set met cross-sectionele beelden te creëren. Selecteer Skyscan's NRecon software standaardinstellingen, met uitzondering van het volgende.
   1. Wijzig de Ring Artifact Correctie op 20.
   2. Wijzig de Beam hardening correctie tot 25%.
   3. Pas de CS Static Rotatie om cross-sectionele het niveau te maken.
6. Beeldverwerking
   Gebruik Skyscan's CTAN software om het uiteindelijke 3D grijswaarden te verkrijgen. Pas de grijs-schaal bereik om een ​​geschikt niveau om de artefacten van het piepschuim en Parafilm verwijderen.

5. SEM Imaging en EDX analyse

Exemplaren opgesteld door polijsten voor nanoindentation en micro-/nano-structure karakterisering werden onderzocht met behulp van scanning elektronen microscopie (SEM). Laag vacuüm mode werd gebruikt om dehydratatie van monsters en de noodzaak van toepassing van geleidende coatings minimaliseren. Lokale chemische analyse werd uitgevoerd op gepolijste exemplaren in samenwerking met SEM beeldvorming met behulp van energie-dispersieve X-stralen spectroscopie (EDX). EDX analyses werden uitgevoerd op dezelfde lijn / raster dat werd geanalyseerd door nanoindentation om correlaties tussen chemische en mechanische eigenschappen. Vers gebroken oppervlakken werden ook door SEM onderzocht om betere informatie over de morfologie en de oriëntatie van biomineralized structuren aanwezig in de schubben te bieden. De resolutie voor observatie van nano-schaal structuur op breukvlakken te verbeteren, werden monsters sputter bekleed met goud (Au) en afgebeeld in high-vacuüm modus. De volgendebevat aanvullende informatie over de gebruikte procedures.

1. SEM beeldvorming van gepolijste oppervlakken
   1. Plaats gepolijst specimen in SEM kamer en pompkamer in laag vacuüm-modus met druk in de verbrandingskamer van 0,1 tot 0,5 mbar.
   2. Pas werkafstand tot ongeveer 5,0 mm.
   3. Activeer hoogspanning (HV) en navigeer naar de regio van de rente op specimen dat de overgangszone tussen ganoine en benige sublagen of andere gebieden van belang omvat.
   4. Verkrijgen beelden bij 15 kV HV en straalstroom van ongeveer 3.9 nA.
   5. Focus imago en het uitvoeren van alle nodige optimalisaties en stigmation aanpassingen.
   6. Maak foto's uit ten minste drie regio's van belang bij relevante vergrotingen (meestal 250X tot 10.000 X) met de laag-vacuüm terugverstrooid elektron (BSE) detector om te helpen bij de identificatie van veranderingen in biomineraal inhoud en dichtheid (dwz, compacter bot vs poreus bot ).
2. SEM beeldvorming van breukvlakken
   1. Bevestig vers gebroken specimen een 90 ° SEM stub met dubbelzijdig carbon tape met het breukvlak naar boven.
   2. Sputter jas met Au tot een sub-nm dikke geleidende laag op het breukvlak bieden.
   3. Plaats specimen in SEM kamer en pompkamer in hoog vacuüm modus.
   4. Pas werkafstand tot tussen 3,0 en 5,0 mm.
   5. Activeer HV en navigeer naar gebieden van belang op het monster. Primaire aandachtsgebieden in dit geval waren de huidige structuur in de ganoine en benige lagen.
   6. Verkrijgen beelden op tussen de 5 kV en 15 kV HV en een onderbalk stroom van 0,24 nA om de resolutie te verbeteren.
   7. In eerste instantie richten specimen en het uitvoeren van voorlopige uitlijning.
   8. Vergrotingsfactor verhogen tot meer dan 5000 X en omschakeling van de normale field emission lens in onderdompeling / ultra-hoge resolutie (UHR) lens.
   9. Voer UHR optimalisaties en stigmation aanpassingen.
   10. Maak foto's van ten minste drie regio of belang bij relevante vergrotingen (meestal 5000 X 250.000 X) met behulp van de door lens detector (TLD) gebruikt in het secundair elektron (SE)-modus.
3. EDX analyse van gepolijste oppervlakken (uitgevoerd in samenwerking met SEM imaging). Deze parameters zijn materiaal afhankelijk en zal moeten worden aangepast, zodat de EDX interactie volume is vergelijkbaar in grootte met de nanoindentation interactie volume zoals besproken door Moser ^14.
   1. Navigeer naar regio van belang op gepolijste specimen dat nanoindentation rooster aangegeven door de vaste merktekens aan het eind van elke regel van streepjes omvat.
   2. Zorg HV tenminste 15 kV, bundelstroom ten minste 3,9 nA en werkafstand groter is dan 5,0 mm.
   3. Leg BSE beeld van de regio te analyseren met behulp van EDX.
   4. Met behulp van EDX analyse software, vastleggen dezelfde afbeelding om te helpen bij het lokaliseren van gebieden van chemische analyses uit te voeren langs de lijn van streepjes.
   5. De "line analyse" techniek poling een lijn van chemische analyses uit te voeren langs de lijn van belang van streepjes te beginnen bij het eerste streepje, en eindigt bij het laatste streepje.
   6. Geef het aantal analyse punten langs de lijn te worden geplaatst. Het beste is om hetzelfde aantal analyses punten en streepjes die aanwezig een directe ruimtelijke correlatie tussen de chemische samenstelling en mechanische eigenschappen te verschaffen te gebruiken.
   7. Wanneer de lijn correct is geplaatst en punten aangegeven, inleiding van de lijn analyse met behulp van EDX software.
   8. Wanneer de lijn analyse is voltooid, te identificeren elementen van belang worden gekwantificeerd vanaf het punt spectra verkregen langs de omschreven lijn op het gepolijste oppervlak van het monster.
   9. Zodra elementen plaats worden geïdentificeerd, een achtergrondsynchronisatie kalibratie verantwoorden Bremsstrahlung straling en andere effecten.
   10. Kies deconvolutie analyse optie van de software om kwantitatieve analyse te verkrijgen op elk punt langs de omschreven lijn QuanTify de chemische samenstelling op elk punt.
   11. Spaar kwantitatieve chemische analyse resultaten samen met het beeld van bepaalde lijn die werd geanalyseerd om te helpen bij ruimtelijke correlatie met mechanische eigenschappen gemeten met behulp nanoindentation.

Resultaten

Figuur 3 geeft de gemiddelde resultaten van ruimtelijk-gecorreleerde nanoinidentation / SEM / EDX analyses uitgevoerd over de ongeveer 800 micrometer lang korte as dwarsdoorsnede. In de ongeveer 60 urn dikke laag ganoine, de nanoindenter berekende gemiddelde modulus van 69,0 GPa en hardheid van 3,3 GPa. De nanoindenter bepaald een gemiddelde modulus van 14,3 GPa en de hardheid van 0,5 GPa voor de ongeveer 740 micrometer dik bot laag.

EDX bepaald koolstof, zuurstof, calcium en fosfor, die typisch worden gevonden in gemineraliseerde schalen. De ganoine en bot lagen die meetbare verschillen in chemische samenstelling. De waargenomen koolstof piek in het bot laag kan worden toegeschreven aan dat gebied het niet zo sterk gemineraliseerd, waardoor een lichte stijging van koolstof die ook veroorzaakt de waargenomen daling van de totale helderheid van het BSE beeld. Met name de ganoine laag '; S bedoel atomaire concentratie verhouding van Ca: P van 1,71, vergelijkbaar met dat hydroxyapatiet met een theoretische verhouding van 1.67. Het bot laag gemiddelde Ca: P ratio daalde naar 1,51 wat neerkomt op een daling van de hoeveelheid mineralisatie uit de ganoine laag.

FTIR spectra in fig. 4 voor het bot laag en ganoine laag die de belangrijkste functionele groepen zoals amide, carboxyl, fosfaat, en carbonyl. Specifiek, FTIR bevestigde de visuele waarneming van hydroxyapatiet handtekeningen in de buitenste (ganoine) laag en collageen handtekeningen in de binnenstad (bot) laag. Pieken op 3,500-3,000 cm ^-1 vanwege NH strekken en buigen NH tussen 1550 en 1500 cm ^-1 vertegenwoordigen amide groepen in het bot laag. Pieken in de regio golfgetal 1,470-1,365 cm ^-1 vertegenwoordigen amidegesubstitueerde alkylgroepen. Bovendien onderscheidend C = O rekken in 1641 cm ^-1 werd waargenomen op het bot laag. Erwtks van 3,000-2,500 cm ^-1 vertegenwoordigen carboxylgroepen. Spectra zowel het bot en ganoine lagen 'leverde een opvallende piek in de buurt 1,079.33 cm ^-1 indicatief voor stretching fosfaat.

X-ray CT-beelden in figuur 5 vangt dat de ganoine laag dekt niet het bot laag waar de schalen overlappen elkaar. Hoe helderder grijze ganoine lagen aangeven dichter, harder en stijver fasen terwijl donkerder grijs bot lagen geven minder zwaar en minder stijf fasen. Bovendien, de röntgendetector CT beelden geholpen bij het identificeren van niet-uniformiteit in ganoine laagdikte. In feite zijn duidelijke kuilen dicht bij het centrum van de ganoine laag, die geen betrekking hebben op het bot laag helemaal waargenomen.

De SEM-beeld in figuur 6A van het breukvlak geëtst met H ₃ PO ₄ onthuld nanostructuren georganiseerd in een gelaagd patroon voor de ganoine laag. Dit-nanorod georganiseerdstructuur correleert met de hydroxyapatiet handtekeningen van FTIR voor de ganoine gebied.

Figuur 6A toont een typisch kleinere vergroting SEM microfoto van een breukvlak duidelijk de overgang tussen de ganoine en bot lagen met de stippellijn. Figuur 6B toont de sterkere vergroting SEM beelden van de breukvlak na etsen met H ₃ PO _4. Na het etsen, georiënteerde nanorods in de buitenste ganoine laag zijn duidelijk herkenbaar, terwijl een vezel-achtige nanostructuur wordt waargenomen in het bot laag.

Figuur 3. Modulus en hardheid gegevens nanoindentation ruimtelijk gecorreleerd met SEM / EDX chemische samenstelling.

Figuur 4. FTIR spectra verzameld uit de buitenste (ganoine) en innerlijke (benige) lagen.

Figuur 5. X-ray CT-beelden tonen putjes op de buitenste (ganoine) laag die de binnenste (benige) laag.

(A) Low-vergroting SEM beeld van de typische breukvlak, (B) een grotere vergroting beelden van nanorods in de buitenste (ganoine) Figuur 6. En vezels in de binnenste (bony) lagen .. Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussie

Van een experimenteel oogpunt, moeten de onderzoekers om te onthouden dat bij het werken met natuurlijke biologische materialen zoals gemineraliseerde schubben, de rapportage van de ruimtelijke ligging van de schaal op de vis is van cruciaal belang, omdat eerder onderzoek heeft aangetoond mechanische eigenschappen van gemineraliseerde schubben zijn afhankelijk waar de schalen waren op de vis ^4.

Mechanische eigenschappen van gemineraliseerde biologische materialen is ook getoond afhankelijk van de hydratatietoestand van de monsters ⁴ zijn. Dit beperkt de bruikbaarheid van deze techniek wanneer het proberen om verse monsters die goed zijn gehydrateerd aan gepubliceerde resultaten in de literatuur, die droog gefossiliseerde samples vergelijken. Daarom verlengde testtijden moeten worden vermeden om de effecten van uitdroging op een monster mechanische eigenschappen tijdens nanoindentation minimaliseren. Materiaal specifieke pilot-onderzoek wordt aanbevolen om de ervaring te garanderenment runtime minimaal voldoende om het mechanische gedrag van het materiaal niet veranderen. Natte cel nanoindentation zou een voorkeurswerkwijze een constante hydratie toestand van het materiaal bij de testapparatuur die toelaat zijn.

De nanoindentation methode die in deze studie, die de elasticiteitsmodulus berekend uit de lossing curve neemt het materiaal zich gedraagt ​​als een lineair elastisch isotroop materiaal. De techniek kan worden gebruikt met verschillende indenter tips. De driezijdige Berkovich tip met een halve hoek van 65,35 ° werd gebruikt in deze studie. Alternatieve tips zoals de kubus hoek (halve hoek = 35,36 °) zijn geschikt voor de in dit manuscript procedure, maar sinds de kubus hoek tip is acuter dan de Berkovich tip scheuren kan worden gegenereerd in de steekproef bij veel lagere belastingen dan met de Berkovich tip.

Polijsten is een essentiële stap om een ​​glad en vlak oppervlak te verkrijgen met een geminimaliseerde oppervlakteactievee ruwheid om geen invloed op de nanoindentation resultaten. Het polijsten stappen in dit manuscript zijn de gesuggereerde procedure die zou moeten worden aangepast afhankelijk van het type van machine wordt gebruikt. De kritieke stap om nauwkeurige nanoindentation gegevens te waarborgen dat oppervlakteruwheid geminimaliseerd, en dit materiaal een 50 nm laatste polijststap diende een glad vlak oppervlak te verkrijgen bij de inkeping diepte wordt gesondeerd.

De afstand van streepjes zorgt ook nauwkeurige nanoindentation gegevens die niet wordt beïnvloed door het materiaal vervorming optreedt vorige streepjes. De nanoindenter handleiding voor de apparatuur in deze studie suggereerde dat streepje afstand minstens 20-30x de maximale penetratie diepte voor Berkovich indringlichamen ¹⁵ zou moeten zijn. Voor alternatieve materialen zullen de vereiste streepje afstand moeten worden bepaald op basis van de uitgeoefende belasting en maximale diepte inspringen zoals eerder besproken in het groenliteratuur ^16,17. Daarnaast is de wachttijd voor dit materiaal gekozen elk kruip waargenomen voor de uiteenlopende fasen gesondeerd waardoor de nanoindenter software Oliver-Pharr analysemethode te gebruiken overwinnen. Zoals besproken Oyen ¹⁸ alternatieve analyse methoden beschikbaar zijn voor biologische materialen wanneer tijdsafhankelijke respons materiaal niet kan worden overwonnen met geschikte wachttijden.

Om resultaten met hoge resolutie van X-Ray CT bereiken moet een aantal instellingen worden geoptimaliseerd. Dit document schetst een zeer specifieke set parameters voor gebruik op een vis schaal met een unieke grootte en gelaagde dikte. Met verschillende steekproeven, zullen deze instellingen moeten worden aangepast om een ​​dataset van de hoogste kwaliteit te verkrijgen. Het proces van het selecteren van elke parameter moeten duidelijk worden omschreven in de handleiding die bij de machine wordt gebruikt. Scaninstellingen (spanning, stroom, belichting, filter selectie) en de wederopbouw instellingen(Ring artefacten, bundelverharding) moet mogelijk worden aangepast aan een verscheidenheid van andere steekproefomvang en geometrieën tegemoet.

X-ray CT gaf een beeld van de gehele schaal morfologie identificeren van een ganoine laag die een benige laag materiaal alleen wanneer de schalen elkaar niet overlappen. Het Röntgen CT beelden ook vastgesteld dat de ganoine laag bestond uit een niet-uniforme dikte over de omvang en zelfs vertoonde kuilen die de ganoine laag geheel ontbrak.

Interessant is dat de nanoindentation gegevens ruimtelijk gecorreleerd aan de SEM / EDX chemische analyse identificeerde een scherpe discrete overgang tussen de 2 lagen in plaats van een meer geleidelijke overgang waargenomen voor de gemineraliseerde schubben van de P. senagalus (in Bruet et al.. ^2).

Een combinatie van nanoindentation, FTIR, EDX, en SEM voorwaarde mechanische eigenschappen, chemische analyse en structurele informatie te bevestigende buitenste laag als ganoine met emaille-achtige morfologie en scheikunde. Bovendien zijn deze technieken bevestigde de binnenste laag als een benige laag materiaal.

Tot slot, de in deze studie methoden geïdentificeerd de procedure en de bijbehorende resultaten aan de gemineraliseerde vis schaal van A. te onderzoeken spatel uit de totale structuur naar de nanostructuur en chemische samenstelling.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Epoxy resin	Buehler	701-501512
Epoxy hardener	Buehler	703-501528
Samplkups	Buheler	20-8180
SamplKlips I	Buehler	20-4100-100S
High precision cut-off saw	Buehler	Isomet
UltraMet 2002 sonic cleaner	Buehler	B2510R-MT
Polisher	Buehler	49-1750-160
1,200 grit (15 μm) SiC paper	Struers	40400012
4,000 grit (6 μm) SiC paper	Struers	40400014
50 nm colloidal silica	Buehler	40-10075
Chemomet polishing pad for 50 nm suspension	Buehler	40-7918
Nanoindenter	MTS	G200
FTIR continuum microscope	Thermo Nicollet	6700
X-ray computed tomography	Skyscan	Skyscan 1173
SEM	FEI	NovaNanoSEM 630
EDX	Bruker	AXS Xflash detector 4010
Sputter coater	Denton	Desk II