Een werkwijze wordt beschreven voor een efficiënte zuivering van twin-Strep-gemerkte fusie-eiwitten en hun specifieke complexen van gemodificeerde streptavidine (Strep-Tactin) hars covalent verknoopt met Bis (sulfosuccinimidyl) suberaat (BS3). De methode heeft de voordelen van hoge snelheid, goede doeleiwit terugwinning en hoge zuiverheid, en is compatibel met daaropvolgende analyse door massaspectrometrie.
Methodenartikel
Een stap Zuivering van Twin-Strep-gelabeld eiwitten en hun complexen op Strep-Tactin Resin Cross-linked met bis (sulfosuccinimidyl) suberaat (BS3)
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Affiniteitszuivering van Strep-gemerkte fusie-eiwitten op harsen dragen een aangelegde streptavidine (Strep-Tactin) is uitgegroeid tot een veel gebruikte methode voor de isolatie van eiwitcomplexen onder fysiologische omstandigheden. Fusie-eiwitten die twee kopieën van Strep-tag II, aangeduid twin-Strep-tag of SIII-tag, hebben het voordeel van hogere affiniteit voor Strep-Tactin in vergelijking met degenen die slechts een enkele Strep-tag, waardoor efficiënter eiwitreiniging. Echter dit voordeel gecompenseerd doordat elutie twin-Strep-gemerkte eiwitten met biotine onvolledig zijn, leidt tot lage eiwit herstel. Het herstel kan drastisch worden verbeterd door denaturerende elutie met natriumdodecylsulfaat (SDS), maar dit leidt tot verontreiniging met Strep-Tactin afgegeven uit de hars monster, waardoor de bepaling onverenigbaar met downstream proteoomanalyse. Om deze beperking te overwinnen, hebben wij een methode waarbij hars gekoppeld tetrameer van Strep-Tactin ontwikkeldwordt eerste gestabiliseerd door covalente verknoping met Bis (sulfosuccinimidyl) suberaat (BS3) en het verkregen verknoopte hars wordt vervolgens gebruikt om doeleiwit complexen te zuiveren in een enkele batch zuiveringsstap. Efficiënte elutie met SDS zorgt voor een goede eiwit herstel, terwijl de afwezigheid van verontreinigende Strep-Tactin laat stroomafwaarts eiwit analyse door massaspectrometrie. Als een proof of concept, beschrijven we hier een protocol voor de zuivering van SIII-getagde viraal eiwit VPG-Pro van kernen van virus-geïnfecteerde N. benthamiana installaties die het Strep-Tactin polymethacrylaathars verknoopt met BS3. Hetzelfde protocol kan worden gebruikt om een twee-Strep-gelabeld eiwit van belang te zuiveren en te karakteriseren zijn fysiologische bindingspartners.
Inleiding
In de afgelopen jaren heeft Strep-tag technologie op grote schaal gebruikt worden in veel gebieden van het biomedisch onderzoek, met inbegrip van proteomics en structurele biologie. Deze eiwitzuivering technologie, die gebaseerd is op de fusie van recombinante eiwitten een korte Strep-tag peptide, gerijpt met de komst van affiniteitsmatrices uitvoering Strep-Tactin, een genetisch gemanipuleerde variant van streptavidine met verbeterde peptide-bindingscapaciteit. 1, 2 fusie-eiwitten die twee kopieën van Strep-tag II, aangeduid twin-Strep-tag of SIII-tag, vertonen een hogere affiniteit voor Strep-Tactin matrices dan die met slechts een enkele Strep-tag, waardoor efficiëntere zuivering van de recombinante eiwitten en bijbehorende bindingspartners. Echter, de hogere affiniteit van twin-Strep-gemerkte eiwitten om Strep-Tactin heeft ook zijn keerzijde. Concurrerende elutie van dergelijke eiwitten met overmaat biotine kan onvolledig zijn, waardoor doeleiwit rendement gedaald. Een merts efficiënt alternatief is elutie met SDS, maar het leidt tot ongewenste verontreiniging met monster Strep-Tactin afgegeven uit het hars, waardoor de bepaling onverenigbaar met proteoomanalyse. Dit document presenteert een techniek om deze beperking te overwinnen door eerst het stabiliseren van de hars-gekoppelde tetrameer van Strep-Tactin door chemische cross-linking en vervolgens met behulp van SDS naar twin-Strep-gemerkte eiwitten en hun bijbehorende complexen uit de resulterende verknoopte hars elueren. Zo kan voldoende eiwit opbrengst worden bereikt zonder monster besmetting met Strep-Tactin, waardoor verdere analyse met behulp van massaspectrometrie.
De methode is geschikt voor de zuivering van een recombinant fusie-eiwit met een oppervlak blootgestelde SIII-tag 3 of twin-Strep-tag (aminozuurvolgorde WSHPQFEK (GGGS) 3 WSHPQFEK en SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK, respectievelijk). Het eiwit kan van dierlijke, plantaardige of bacteriële oorsprong zijn en kunnen worden geïsoleerd uit zowel de totale cellysaat of verrijkte organel fractie. Als voorbeeld beschrijven we hier de zuivering van een SIII-gemerkt eiwit VPG-Pro Aardappel Virus A (PVA) 4 van de nucleaire fractie van PVA-geïnfecteerde Nicotiana benthamiana planten. De nucleaire fractie werd geïsoleerd zoals eerder beschreven 5 met de volgende wijzigingen: cellen werden niet behandeld met formaldehyde, werd natrium butyraat gesubstitueerd alle buffers met 5 mM natriumfluoride, werd volledige proteaseremmer gesubstitueerd met PMSF, Triton X-100 concentratie extractie buffer # 2 werd verlaagd tot 0,3% (v / v) en de nucleaire pellet verkregen door centrifugatie door sucrosekussen (extractiebuffer # 3) werd geresuspendeerd in 1,45 ml voorgekoeld bindingsbuffer en geroteerd gedurende 1,5 uur bij 4 ° C. De resulterende nucleaire extract dat de SIII-gelabeld aas eiwit en bijbehorende complexen (aas eiwit monster) werd verwerkt volgens de hieronder beschreven (zie punt 2) protocol.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Cross-linking van Strep-Tactin polymethacrylaathars met Bis (sulfosuccinimidyl) suberaat (BS3)
- Equilibreer een afgedichte microbuisjes met 2 mg BS3 vernettingsmiddel tot kamertemperatuur. LET OP: BS3 is een gevaarlijke stof. Draag beschermende handschoenen en een veiligheidsbril.
- Resuspendeer Strep-Tactin polymethacrylaat hars (50% suspensie in 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl) door korte krachtig schudden en 600 pl van de suspensie onmiddellijk over in de spin-kolom met een pipet met de einde afgesneden.
- Centrifugeer bij 1500 xg gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur. Gooi de doorstroom en voeg 450 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aan de kolom.
- Herhaal de vorige stap 2 keer volledig vervangen Tris-buffer met PBS en laat de hars in 430 pl PBS op pH 8,0 na de laatste centrifugatie.
- Prik de folie van de microbuisjes met BS3 met een pipet met 1001, l van ultrapuur water. Los het poeder in water BS3 door voorzichtig en neer te pipetteren en onmiddellijk 20 ul van de oplossing aan de spin kolom. De eindconcentratie van BS3 in de verknopingsreactie is ~ 1,2 mM.
- Draai de kolom gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Controleer dat de hars goed gemengd met de oplossing BS3.
- Om de reactie te blussen, voeg 6 ui 3M Tris-HCl, pH 7,5 en draai de kolom gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer bij 1500 xg gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur. Gooi de doorstroom en resuspendeer de verknoopte hars in 450 pl Tris gebufferde zoutoplossing met Tween 20 (TBST). Herhaal het centrifugeren en wassen stappen nog twee keer. Bij de laatste stap, resuspendeer de hars in 450 pl TBS.
- Breng het hars suspensie naar een nieuwe buis met behulp van een pipet tip met het uiteinde afgesneden. Resuspendeer de hars links in de kolom met een 450 pl TBS en dragen dezelfde buis. Herhaal the laatste stap nogmaals maximale overdracht van de hars van de kolom buis waarborgen.
- Laat de buis gedurende 10 minuten staan bij kamertemperatuur en het volume op 600 pi passen door het verwijderen van overmaat TBS. De hars is direct klaar voor gebruik (aanbevolen) of kan worden opgeslagen bij 4 ° C, zonder bevriezing.
2. Binding van de Twin-Strep-gelabeld Bait Eiwit en Associated Complexen voor de Cross-linked Strep-Tactin polymethacrylaathars
- Centrifugeer 1 ml van het aas eiwit monster in bindingsbuffer bij 17.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en breng het supernatant naar een nieuwe buis.
- Te minimaliseren binding van endogene gebiotinyleerde eiwitten aan de Strep-Tactin hars, voeg avidine tot een uiteindelijke concentratie van 100 ug / ml en roteer gedurende 15 minuten bij 4 ° C.
- Als de verknoopte hars van stap 1.10 is opgeslagen gedurende langere tijd bij 4 ° C, verzamel de hars door centrifugatie bij 400 xg for 1 min bij 4 ° C. Giet het supernatant en was de hars met 1 ml TBST. Herhaal het centrifugeren en wassen stappen nog twee keer, eerst met TBST en vervolgens met TBS. Centrifugeer het buisje bij 400 xg gedurende 1 min bij 4 ° C en aangepast voor het oorspronkelijke volume door het verwijderen van overmaat TBS.
- Resuspendeer de verknoopte Strep-Tactin hars door vortexen. Voeg onmiddellijk 50 ul van de harssuspensie de buis met het aas eiwit monster met een snit pipetpunt en draai nog eens 30 min bij 4 ° C.
- Afwachting, ingesteld Thermomixer tot 55 ° C en verwarm 500 ui elutiebuffer voor gebruik in stap 3.1.
- Centrifugeer bij 400 xg gedurende 1 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en was de hars op een rotator gedurende 5 min bij 4 ° C met 1 ml voorgekoeld wasbuffer # 1. Herhaal het centrifugeren en wassen stappen drie keer. Bij de laatste stap, resuspendeer de hars in 250 pl wasbuffer # 2.
- Tr ansfer de harssuspensie een frisse draai kolom. Resuspendeer de hars achterblijft in de buis in een 250 ui wasbuffer # 2 en transfer naar dezelfde kolom.
- Centrifugeer bij 400 xg gedurende 3 min bij 4 ° C. Giet de doorstroom en breng de kolom vers dolfijnen nose 2 ml buisje. Onmiddellijk naar de elutiestap hieronder.
3. Elutie van specifieke eiwitcomplexen
- Voeg 150 ul voorverwarmde elutiebuffer uit stap 2.4 tot de spin kolom.
- Incubeer in Thermomixer gedurende 5 minuten bij 55 ° C, onder schudden bij 1400 rpm.
- Centrifugeer bij 1500 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur.
- Gooi de kolom en bewaar de gezuiverde doelwit eiwitten bij ≤ -20 ° C.
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) | |
| Na 2 HPO 4 | 10 mM |
| KH 2 PO 4 | 2mM |
| NaCl | 137 mM |
| KCl | 2.7 mM |
| pH ingesteld op 7,4, tenzij anders aangegeven (pH 8.0 in sectie 1.4) | |
| Tris gebufferde zoutoplossing (TBS) | |
| Tris-HCl, pH 7,4 | 50 mM |
| ght = "20" style = "height: 20px; width: 299px;"> NaCl | 150 mM |
| Tris gebufferde zoutoplossing met Tween 20 (TBST) | |
| Tris-HCl, pH 7,4 | 50 mM |
| NaCl | 150 mM |
| Tween 20 | 0.1% (v / v) |
| Bindingsbuffer | |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 25 mM |
| NaCl | |
| NaF | 5 mM |
| EDTA | 0,5 mM |
| Glycerol | 10% (v / v) |
| PMSF | 0,1 mM |
| Wash Buffer # 1 | |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 25 mM |
| NaCl | 500 mM |
| NaF td> | 5 mM |
| EDTA | 0,4 mM |
| IGEPAL CA-630 | 0.2% (v / v) |
| Glycerol | 5% (v / v) |
| PMSF | 0,1 mM |
| Wash Buffer # 2 | |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 25 mM |
| NaCl | 150 mM |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 25 mM |
| SDS | 1% (w / v) |
Tabel 1. Buffers gebruikt in de onderhavige studie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De zuiveringswerkwijze is schematisch weergegeven in figuur 1, samen met een representatie van problemen in verband met andere bestaande zuiveringswerkwijzen.
Figuur 1. Schematische weergave van de zuiveringsprocedure. De workflow bevat stabilisatie van de hars gekoppelde Strep-Tactin tetrameer via covalent...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het bovenstaande protocol kan worden gebruikt om een twee-Strep-gelabeld aas eiwit van interesse en de bijbehorende complexen in elke geschikte buffer die niet biotine of sterke denatureringsmiddelen bevat zuiveren. In de huidige versie van het protocol, bindende en wassen wordt uitgevoerd onder relatief stringente omstandigheden in de aanwezigheid van hoge zoutconcentratie en niet-ionisch detergens. Hoewel dit leidt tot minder achtergrond, kan breekbare eiwitcomplexen dissociëren onder deze omstandigheden. Om dergeli...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Wij dankbaar erkennen de technische ondersteuning van Sini Miettinen, Minna Pöllänen en Taru Rautavesi. Wij danken Helka Nurkkala voor het verstrekken van HEK 293 cellen die twin-Strep-gelabeld GFP en Pekka Evijärvi voor het verstrekken van geluidsopname-apparatuur. Dit werk werd gefinancierd door de Academie van Finland, verlenen nummers 138329, 134684 en 258978.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Bis(sulfosuccinimidyl) suberaat (BS3), No-Weigh formaat, 8 x 2 mg | Pierce/Thermo Scientific | 21585 | www.fishersci.com LET OP: Gevaarlijke stof. Veroorzaakt ernstige irritatie van de luchtwegen, de huid en de ogen. Draag beschermende handschoenen en oogbescherming. |
| Strep-Tactin MacroPrep-hars (50% suspensie) | IBA | 2-1505 | www.iba-lifesciences.com |
| Spin-X centrifugeerbuisfilter, celluloseacetaatmembraan, poriegrootte 0,45 μm, niet-steriel | Costar (Corning) | 8163 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Dolphin-nose buizen | Costar (Corning) | 3213 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Avidin | IBA | 2-0204 | www.iba-lifesciences.com |
Referenties
- Voss, S., Skerra, A. Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification. Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).
- Schmidt, T. G., Skerra, A. The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins. Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).
- Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells. Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).
- Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions. Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).
- Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. Detection of histone modifications in plant leaves. J. Vis. Exp. (55), (2011).
- Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope. Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).
- Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean. Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).
- Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).
- Hendrickson, W. A., et al. Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).
- Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability. J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).
- Singh, I., et al. Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering. J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).
- Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5 (9), (2010).
- Wang, W., Barger, S. W. Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase. BMC Biochem. 12, 63(2011).
- Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).
- Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis. Proteome Sci. 9, 45(2011).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen