Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Nanomanipulatie van Single RNA-moleculen door een optisch pincet

14.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51542

⸱

20 augustus 2014

 ,  ,  , 
1Nanoscale Engineering Graduate Program, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, 2Nanoscale Science Undergraduate Program, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, 3Nanobioscience Constellation, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, 4The RNA Institute, University at Albany, State University of New York, 5Department of Biological Sciences, University at Albany, State University of New York

In dit artikel

Samenvatting

Optische pincetten zijn gebruikt om RNA-vouwing te bestuderen door individuele moleculen uit te rekken vanaf hun 5’ en 3’ uiteinden. Hier worden gebruikelijke procedures beschreven voor het synthetiseren van RNA-moleculen voor tweezing, kalibratie van het instrument en methoden om enkele moleculen te manipuleren.

Samenvatting

Een groot deel van het menselijk genoom getranscribeerd maar niet vertaald. In deze post genoom era, hebben regulerende functies van RNA is aangetoond dat steeds belangrijker te worden. Al RNA functie hangt vaak het vermogen om alternatieve structuren aannemen, is het moeilijk om RNA driedimensionale structuren direct van sequentie voorspeld. Single-molecule zal tonen mogelijkheden om het probleem van RNA structurele polymorfisme oplossen bewaken molecuulstructuren een molecuul tegelijk. Dit werk toont een werkwijze voor het vouwen en de structuur van afzonderlijke RNA-moleculen met optisch pincet nauwkeurig manipuleren. Eerste, methoden om te synthetiseren moleculen geschikt voor single-molecule mechanische werkzaamheden worden beschreven. Vervolgens diverse kalibratie procedures om de goede werking van de optische pincetten zorgen worden besproken. Vervolgens worden verschillende experimenten toegelicht. Om het nut van de techniek aan te tonen, resultaten van mechanisch ontvouwen RNA haarspelden en een enkele RNA Kissing complex worden gebruikt als bewijs. In deze voorbeelden werd de Nanomanipulatie techniek om vouwen van elk structureel domein, zoals secundaire en tertiaire studie onafhankelijk. Tenslotte, de beperkingen en toekomstige toepassingen van de werkwijze worden besproken.

Inleiding

De ontwikkeling van de optische pincetten techniek lang gepaard met de toepassing in biologisch onderzoek. Als de optische trapping effect voor het eerst werd ontdekt, Arthur Ashkin geconstateerd dat bacteriën in besmet water kan worden opgesloten in de laserfocus 1. Sindsdien trapping bacteriën is uitgegroeid tot een onbedoelde, leuk experiment voor de generaties van biofysica studenten als een serieuze research tool om microbiële fysiologie 2,3 bestuderen. De optische trapping techniek maakt gebruik van gefocusseerde laserbundel een microscopisch object 1 immobiliseren. Praktisch, een laser trap functioneert als een optische bron, controleert tevens kracht (F) op het ingesloten object door de verplaatsing van het centrum van de val (AX). Binnen een kort bereik, F = κ x AX, in κ is de veerconstante van de val. De optische val kan worden gebruikt in piconewton (pN) precisie kracht uitoefenen wanneer microscopic object en haar positie met nanometer (nm) nauwkeurigheid te meten. In de afgelopen twee decennia hebben een optisch pincet een van de meest gebruikte single-molecule technieken in biofysica geworden. De techniek is toegepast om vouwen en mechanica van DNA 4-6, 7-9 RNA en eiwitten te bestuderen 10,11. Optische pincetten zijn ook gebruikt om DNA replicatie 12, RNA transcriptie 13 en eiwitsynthese 14,15, evenals vele andere biomoleculaire evenementen 16-18 observeren.

Single-molecule benaderingen zijn werkzaam in RNA structureel onderzoek vooral naar de ruige vouwen energielandschap van RNA te verkennen. Een RNA-sequentie kan meestal vouwen in meerdere stabiele, elkaar uitsluitende structuren, door de eenvoudige chemische samenstelling en base paring regels van RNA. Het is lang bekend dat RNA structurele polymorfisme, zoals die voorkomt in riboswitches 19,20, speelt een belangrijke rol in genregulatie. Een recent genoom-breed onderzoek is zo klein als een paar graden grote invloed structuur en eiwitsynthese van een groot deel van het cellulaire transcriptoom 21 bleek dat temperatuurschommelingen. Dit voorbeeld duidt dat de biologische rol van alternatieve RNA vouwen is misschien belangrijker en ingrijpender dan gedacht. Structurele polymorfisme echter een uitdaging voor de traditionele biochemische en biofysische benaderingen die gemiddeld in vele nieuwe moleculen te onderzoeken. Bijvoorbeeld, de "aan" en "uit" conformaties van een riboswitch elkaar uitsluiten. Een gemiddelde structuur afgeleid van heterogene structuren is waarschijnlijk een van de biologisch relevante conformeren lijken. Bovendien getranslateerde RNA en mRNA vormen meestal structuren. Hun interactie met eiwitten en regelgevende RNAs gevallen vereist ontvouwing van de bestaande structuur van de interactie. Daarom bestuderen RNA ontvouwen / hervouwing wordt een pertinenteafgifte van RNA biologie. Om een dergelijke uitdaging aan te gaan, is de enkel-molecuul benadering toegepast om RNA structurele polymorfisme ontrafelen door het bestuderen van een molecuul per keer 22-27.

In vergelijking met de populaire single-molecule fluorescentie werkwijze pincet gebaseerd mechanische ontplooiing biedt een voordeel dat conformaties van afzonderlijke moleculen worden gemanipuleerd door toegepaste kracht en worden gemeten nanometerprecisie. Dit Nanomanipulatie capaciteit kan worden gebruikt voor het ontvouwen / vouwing van individuele structurele domeinen zodat de hiërarchische vouwen van een grote RNA kan worden ontleed 28 volgen. Alternatief kan een enkele streng worden aan vouwen tot een van de verschillende conformaties; of een bestaande structuur kan mechanisch worden geïnduceerd opnieuw vouwen in een andere conformatie 29. Onder biologische omstandigheden, kan een RNA-structuur af van de temperatuur veranderingen of ligand bindend worden gewijzigd. De mogelijkheid van het direct manipuleren moleculaire sTRUCTUUR opent een nieuwe locatie van RNA structurele studie. In principe andere mechanische technieken, zoals atomic force microscoop en magnetische pincet, kan ook worden gebruikt om vouwen van afzonderlijke RNA-moleculen te bestuderen. Echter worden dergelijke toepassingen grotendeels beperkt door de relatief lage ruimtelijke resolutie 30.

De tewerkstelling van een optisch pincet maakt RNA structuren worden ontvouwd door mechanische kracht.

Het voordeel van mechanische ontplooiing is verscheidene malen. Kracht kan worden gebruikt om zowel secundaire en tertiaire structuren ontvouwen, terwijl metaalionen en ligand geïnduceerde vouwen voornamelijk beperkt tot tertiaire structuren. Temperatuur en denatureringsmiddel kan een aanzienlijke invloed hebben op de activiteiten van water en opgeloste stoffen. In tegenstelling, is kracht lokaal toegepast op moleculaire structuren verstoren; het effect van de werking op de omgeving is te verwaarlozen. Daarnaast is thermische smelten best gebruikt vouwen thermodynamica van kleine RNA structuren,dat optische pincetten werden gebruikt om RNA structuren bestuderen met verschillende afmetingen, variërend van een zeven-base-pair tetraloop haarspeld 28 een 400-nucleotide ribozym 31. Bovendien kan RNA structuren mechanisch worden ontvouwen bij mesofiele temperaturen. In tegenstelling tot RNA ontvouwen in een thermisch smeltende experiment wordt de temperatuur verhoogd typisch ver boven fysiologische temperaturen, die aanzienlijk verhoogt RNA hydrolyse, met name bij aanwezigheid van Mg2 + ionen.

Het is belangrijk op te merken dat de mechanische effect van werking afhankelijk van deze wordt toegepast op een structuur. De uitgeoefende kracht kantelt het vouwen energielandschap. Bijvoorbeeld, wanneer kracht wordt uitgeoefend op een haarspeld, de basenparen opeenvolgend gebroken, een tegelijk (figuur 1a). De scheuren vork verloopt langs de spiraalvormige as, die loodrecht op de uitgeoefende kracht. Wanneer daarentegen een minimale kussen complex onder spanning, de twee kussenbasenparen, die evenwijdig aan de uitgeoefende kracht is, geef de kracht load (Figuur 1b). De verschillende geometrieën van de haarspeld en kussen complex ten opzichte van de uitgeoefende kracht resultaat in hun verschillende mechanische respons, die kan worden gebruikt om secundaire en tertiaire vouwing 28,32 onderscheiden. Het theoretische aspect van mechanische ontvouwen is eerder beoordeeld 8,9,30. Dit werk beschrijft de fundamentele benaderingen voor het opzetten en uitvoeren van een single-molecule mechanische ontvouwen assay.

Experimentele opstelling. In ons experiment mechanisch trekken, het RNA monster pincet uit het RNA van belang geflankeerd door twee dubbelstrengs DNA / RNA handgrepen (figuur 2) 7. De gehele molecuul kan worden vastgebonden aan twee oppervlak beklede micron-size kralen (Spherotech) via streptavidine-biotine en digoxigenine-anti-digoxigenine antilichaam interactions, respectievelijk. Een kraal wordt gehouden door een kracht meten van optische trap, terwijl de andere is op het puntje van een micropipet gehouden. De onderlinge afstand tussen de korrels kan worden veranderd door ofwel sturen van de val of verplaatsen van de micropipet. Met deze aanpak kan een enkele RNA-molecuul tethering de kralen worden uitgerekt en ontspannen.

Voorbereiding van de monsters. De synthese van RNA monsters voor pincet bevat enkele stappen (figuur 3). Eerst wordt de DNA-sequentie overeenkomend met het RNA van belang eerst gekloneerd in een plasmide vector. Vervolgens worden drie PCR-reacties uitgevoerd om de twee handvatten en een template voor transcriptie genereren. De transcriptie sjabloon omvat de handgreep regio's en de ingebrachte sequenties. De volledige lengte RNA wordt gesynthetiseerd door in vitro transcriptie. Ten slotte worden de RNA en chemisch gemodificeerde handgrepen samen gehybridiseerd met de moleculen te genereren voor pincet.

Kalibratie en uitvoering van de pincet. Het basisontwerp van de Minitweezers gebruikd in dit werk volgt die van de dual-beam optisch pincet 33. Met veel verbeteringen, de Minitweezers bezitten buitengewone stabiliteit vergeleken met de eerste generatie optische pincetten. Een aantal onderzoeksgroepen in verschillende landen gebruiken de Minitweezers in hun single-molecule onderzoek 14,15,34-37. De details van de bouw, kalibratie, en de werking van het apparaat, inclusief instructie video's, zijn beschikbaar op de "pincet Lab" website (http://tweezerslab.unipr.it). Hier, verbeteringen en kalibratie procedures die moeten worden uitgevoerd op dagelijkse basis worden beschreven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1 Voorbereiding van de RNA-moleculen voor Single-molecule Pincet

  1. Klonen van de sequentie van belang. Kloon de DNA sequentie die overeenkomt met RNA structuur in een vector.
  2. Synthese en zuivering van de transcriptie template. Samenstel transcriptie matrijs door PCR. [Plaats tabel 1 hier] Next, te zuiveren van de PCR producten met behulp van een PCR zuivering kit, en concentreer het monster tot> 200 ng / ul. Omdat het gezuiverde DNA wordt gebruikt voor transcriptie moet RNase vrij water worden gebruikt in de elutie en concentratie.
  3. In vitro transcriptie. Synthetiseren van RNA in vitro transcriptie bij 37 ° C gedurende de nacht RNA opbrengst maximaliseren. [Plaats tabel 2 hier] Na transcriptie voeg 1 pl DNase I van het DNA template verteren gedurende 15 minuten bij 37 ° C. Zuiver het RNA met een silica spinkolom.
  4. Synthese van de gebiotinyleerde handgreep A. Allereerst produceren ongemodificeerde handgreep A met PCR met gebruik van primers Af en Ar en concEntrate het geamplificeerde DNA tot> 200 ng / ul. Vervolgens nemen biotine wijzigingen in het PCR product op een primerverlengingsreactie. [Place tabel 3 hier] OPMERKING: De gebiotinyleerde handgreep A (biotine-HA) kan direct in de annealing zonder zuivering. Aangezien de biotine-HA wordt gegloeid met RNA, is het essentieel om RNase-free water in beide stappen.
  5. Synthese van de digoxigenine-gemodificeerde handgreep B. synthetiseren digoxigenine gemodificeerde handgreep B (dig-HB) door PCR met primer Bf en digoxigenine-gemodificeerde oligo Dig-Br (figuur 3). Vervolgens zuiveren het PCR-product en concentreer het monster tot> 200 ng / ul.
  6. Gloeien RNA de hendels. Het hybridiseren RNA handgrepen. [Plaats tabellen 4 en 5 hier]
  7. Zuiver gegloeid monster. Voeg 3 volumes ethanol van het gegloeide monster en meng. Bewaar het mengsel bij -70 ° C gedurende tenminste 1 uur. Spin down bij 15.800 xg en gooi supernatant. Droog de pellet met een vriesdroger. Los het pellet in100 gl RNase-free water. Opmerking: Het monster is klaar voor gebruik en kan bij -20 ° C opgeslagen.

2 kalibratie en uitvoering van de optische pincet

  1. Kalibreren pixelgrootte van Video Monitor
    1. Gebruik de optische val te vangen een kraal met een bekende diameter (maat standaard).
    2. Maak foto's van het gevangen kraal met behulp van beeldbewerkingssoftware (figuur 4).
    3. Bepaal de diameter van de kraal met de imaging software gebaseerd op het zwaartepunt methode.
    4. Herhaal deze procedure tot diameters van kralen van verschillende grootte te bepalen.
    5. Breng de gemeten en bekende diameters van de korrels door een lineaire regressie op de fysieke afmetingen van een pixel te verkrijgen.
  2. Verifiëren Afstand Calibration
    1. Gebruik de optische val te vangen van een kraal.
    2. Bepaal de pixel positie van zijn zwaartepunt door de software voor het vastleggen en opnemen van zijn positie met behulp van de Minitweezers.
    3. Sturen de kraal te diffe posities huren en herhaal de positiebepaling.
    4. Zet de X en Y-posities van de kraal van pixels tot m toestel met de gekalibreerde pixelgrootte.
    5. Vergelijk de X en Y tussen posities gemeten video en de Minitweezers. De twee sets van waarden moeten het eens. Als de beeldresolutie is> 0,1 micrometer, beweeg de kraal dan 1 micrometer tussen de metingen om de nauwkeurigheid te garanderen. Als de afstand kalibratie is niet vergelijkbaar met de ene opgeslagen in de Minitweezers, opnieuw kalibreren van het instrument.
  3. Trap Stijfheid Calibration
    1. Het veroveren van een kraal met behulp van de optische val en houd het nog steeds.
    2. Noteer de kracht van de val met behulp van een bypass snelle data-acquisitie met een snelheid> 5 kHz voor 3 sec.
    3. Genereer een vermogensspectrum van de opname van de kraal beweging met behulp van software. Monteer het vermogensspectrum aan van een Lorentz (figuur 5) 38:
      542 / 51542eq1.jpg "width =" 200 "/> (Vgl. 1)
      waarbij S (f) het vermogen bij de frequentie f, f c is de hoek frequentie, S en 0 is de asymptotische kracht. De hoek frequentie fc is de frequentie waar de kracht van thermische beweging is afgenomen tot de helft van de asymptotische waarde. Als f c varieert met laservermogen en korrelgrootte, kalibreren elke gevangen kraal afzonderlijk.
    4. Bereken de veerconstante van de val, κ, van f c:
      figure-protocol-1 (Vgl. 2)
      waarin γ is de Cw-waarde van de kraal (Vgl. 3). Gebruik de veerconstante aan uitbreiding veranderingen van een RNA van kracht verandering bepalen.
  4. Stokes 'Law Test
    1. Het veroveren van een kraal met behulp van de optische val. Beweeg de kraal heen-en-force op verschillende snelheden.
    2. Noteer de beweging van de hiel en forceren met de Minitweezers.
    3. Bereken de straal van de kraal.
      OPMERKING: De wrijvingskracht F d, gegenereerd door de beweging van een bolvormig deeltje in een vloeistof kan worden beschreven door de wet van Stokes:
      figure-protocol-2 (Vgl. 3)
      waarin r de straal van de bol, v de snelheid en h is de dynamische viscositeit van het fluïdum, te vinden in referentietabellen. De gemeten kracht F d, kan de straal van de kraal worden berekend met vergelijking. 3 (figuur 6) en moet eens met dat bepaald wordt door het beeld acquisitie software. De wet van Stokes-test effectief test de algehele kalibraties en de prestaties van het instrument.

3 Nanomanipulatie van Single RNA-moleculen

  1. Maken fluïdica.
    1. Boor zes gaten (2 mm diameter per stuk) op een nummer 2 afdekglas (figuur 7a) en snijd drie sleuven (2 mm breed) in dubbelzijdig polyimide tape (figuur 7b) met behulp van een laser graveur.
    2. Maak een flow chamber door daartussen twee dekking van glas met twee lagen dubbelzijdig Kapton tape. Plaats een micropipet en twee bypasses tussen de band (figuur 7c).
    3. Monteer de stroom kamer op een metalen frame door het afstemmen van vloeibare gaten (figuur 7d).
    4. Sluit de vloeibare kanalen van de kamer tot 10 ml spuiten gevuld met buffer van keuze via polyethyleen buizen (figuur 7e).
    5. Monteer de hele kamer op het optisch pincet tussen de twee doelstellingen. Zorg ervoor dat de voorzijde van de kamer met de vloeibare kanalen kijkt naar rechts. Trek de juiste doelstelling en steek de koperen pennen van het frame (figuur 7e) om montagegaten op thij pincet. Draai de schroeven vast om de kamer te bepalen van een positie.
  2. Mengen van het gehybridiseerde monster en kralen. Meng het monster gehybridiseerd met anti-digoxigenine-beklede parels (dig-korrels), en laat het mengsel verblijven bij kamertemperatuur gedurende 5-10 minuten. Typisch wordt 1 ui gegloeid monster gemengd met 5 ui dig-korrels in 1 ml buffer. OPMERKING: De hoeveelheid van de korrels in de stromingskamer worden geladen moeten worden gekozen dat een redelijke hoeveelheid van de korrels van het omzeilen tube te leveren. De verhouding van de gegloeide monster op de kralen kan niet gemakkelijk worden gekwantificeerd. In het ideale geval meeste kralen hebben geen RNA, dat slechts een kleine fractie van korrels slechts een RNA-molecuul per bead kunnen hebben. Aangezien de gegloeide monsters en de kralensuspensie moeilijk te kwantificeren, de beste en enige manier momenteel de mengverhouding varieert en test het mengsel op het pincet.
  3. Lever kralen om de reactie plaats in de stromingskamer (dwz enkele micrometers bovenop de micropipette tip, figuur 7c).
    1. Plaats een schorsing van streptavidine gecoate kralen (strep-parels) in een spuit van 1 ml.
    2. Sluit de spuit aan de vloeibare slang die leidt naar de bodem van het kanaal stromingskamer (Figuur 7a).
    3. Duw de spuit aan de strep-beads stromen in de kamer.
    4. Beweeg de gehele kamer met motor control software om de optische val nabij de opening van de onderste omleidingsbuis (figuur 7b) plaatsen. Opereren dan de optische val door een trackball om een ​​strep-kraal vangen.
    5. Beweeg de kraal nabij de punt van de micropipet met de motor control software.
    6. Trek de spuit verbonden met de micropipet aan de korrel zuigen op de micropipet.
    7. Solliciteer stroom zachtjes door op de spuit om het midden kanaal voor het spoelen van extra strep-kralen.
    8. Evenzo levert het mengsel van monster en dig-korrels (zie stap 3.2) boven kanaal van de kamer.
    9. Leg een opgraving-kraal en breng het dicht bij de strep-kraal met behulp van de optische val.
    10. Reinig het midden kanaal door het toepassen van stroom. OPMERKING: De Streptomyces en graaf-kralen zijn gekozen verschillende afmetingen zodat ze visueel kunnen worden onderscheiden onder microscopisch beeld (figuur 4).
  4. Visserij "een single-molecule tethering tussen een paar kralen.
    1. Plaats de dig-kraal verticaal boven de strep-bead (figuur 4).
    2. Beweeg de dig-kraal naar beneden richting de strep-kraal door het sturen van de val. Open een kracht-afstand plot venster op de computer aan kracht veranderingen te visualiseren.
    3. Bij contact van de twee kralen, verplaats de dig-kraal verticaal weg van de streptokokken-kraal.
    4. Als er geen specifieke contact wordt gemaakt, de kracht is bijna nul. Als de twee kralen zijn verbonden door moleculen, de kracht neemt sterk toe als de twee korrels scheiden. Deze procedure, bekend als "vissen", vaak perfORMED meerdere keren op elk paar kralen aan een effectieve single-molecule tether vinden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Beperkt door de ruimte, wordt Nanomanipulatie van enkelvoudige RNA-moleculen aangetoond door het tonen van alleen mechanische ontvouwen voorbeelden van RNA haarspelden en een RNA met een tertiaire structuur.

Manipuleren Single Haarspeld Moleculen

Zodra een ketting gelegd tussen de kralen, kan verlenging van en de kracht op de ketting worden gemanipuleerd met een door de gebruiker gedefinieerde protocol. Vier algemene manipulatie protocollen worde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Modificatie en probleemoplossing in voorbereiding van Uittrekkende Monsters

Keuze van Klonen Vector. Hoewel de opzet beschreven (figuur 3) geen speciale kloneringsvector vergen, de vector voorkeur intrinsieke T7 of T3-promotor te hebben voor het gemak van transcriptie, zodat een promoter via PCR kan worden geïntroduceerd op gewenste posities.

Volgorde en de lengte van de handgrepen. Er is geen specifieke s...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door een NSF-subsidie (MCB-1054449) en een collaboratieve interdisciplinaire Pilot Research Program-toekenning van The RNA Institute aan de University at Albany aan PTXL.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
MinitweezersSteven B. Smith Engineeringhttp://tweezerslab.unipr.it
Data acquisition cardNational InstrumentsUSB-6351
Video cardNational InstrumentsPCI-1407
Labview programming softwareNational Instruments
NI Vision BuilderNational Instruments
Laser engraverEpilogue laser systemsZing-16
PCR purification kitQiagen28104
MEGAscript T7 kitLife TechnologiesAM1334
MEGAclear kitLife TechnologiesAM1908
Biotin-11-UTPThermo FisherFERR0081
T4 DNA polymeraseNew England LabsM0203
Streptavidin coated microsphereSpherotechSVP-20-5
Antidigoxigenin coated microsphereSpherotechDIGP-20-2
Size standard microspheresSpherotechPPS-6K
Kapton tapeKaptontape.comKPPTDE-1
No. 2 cover glassThermo Fisher12-543D

Referenties

  1. Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4853-4860 (1997).
  2. Maier, B. Using laser tweezers to measure twitching motility in Neisseria. Current opinion in microbiology. 8, 344-349 (2005).
  3. Wang, S., Arellano-Santoyo, H., Combs, P. A., Shaevitz, J. W. Measuring the bending stiffness of bacterial cells using an optical trap. Journal of visualized experiments JoVE. , (2010).
  4. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA the elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. 271, Science. New York, N.Y. 795-799 (1996).
  5. Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. 271, Science. New York, N.Y. 1835-1837 (1996).
  6. Bryant, Z., et al. Structural transitions and elasticity from torque measurements on DNA. Nature. 424, 338-341 (2003).
  7. Liphardt, J., Onoa, B., Smith, S. B., Tinoco, I., J,, Bustamante, C. Reversible unfolding of single RNA molecules by mechanical force. 292, Science. New York, N.Y. 733-737 (2001).
  8. Li, P. T. X., Vieregg, J., Tinoco, I. How RNA unfolds and refolds. Annu Rev Biochem. 77 (27), 21-24 (2008).
  9. Woodside, M. T., Garcia-Garcia, C., Block, S. M. Folding and unfolding single RNA molecules under tension. Current opinion in chemical biology. 12, 640-646 (2008).
  10. Cecconi, C., Shank, E. A., Bustamante, C., Marqusee, S. Direct observation of the three-state folding of a single protein molecule. 309, Science. New York, N.Y. 2057-2060 (2005).
  11. Shank, E. A., Cecconi, C., Dill, J. W., Marqusee, S., Bustamante, C. The folding cooperativity of a protein is controlled by its chain topology. Nature. 465, 637-640 (2010).
  12. Morin, J. A., et al. Active DNA unwinding dynamics during processive DNA replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 8115-8120 (2012).
  13. Larson, M. H., Landick, R., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase one singular sensation every little step it takes. Molecular cell. 41, 249-262 (2011).
  14. Wen, J. D., et al. Following translation by single ribosomes one codon at a time. Nature. 452, 598-603 (2008).
  15. Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
  16. Pease, P. J., et al. Sequence-directed DNA translocation by purified FtsK. 307, Science. New York, N.Y. 586-590 (2005).
  17. Dumont, S., et al. RNA translocation and unwinding mechanism of HCV NS3 helicase and its coordination by ATP. Nature. 439, 105-108 (2006).
  18. Greenleaf, W. J., Woodside, M. T., Block, S. M. High-resolution, single-molecule measurements of biomolecular motion. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 36, 171-190 (2007).
  19. Serganov, A., Nudler, E. A decade of riboswitches. Cell. 152, 17-24 (2013).
  20. Breaker, R. R. Prospects for riboswitch discovery and analysis. Molecular cell. 43, 867-879 (2011).
  21. Wan, Y., et al. Genome-wide measurement of RNA folding energies. Molecular cell. 48, 169-181 (1016).
  22. Dalgarno, P. A., et al. Single-molecule chemical denaturation of riboswitches. Nucleic acids research. 41, 4253-4265 (2013).
  23. Wood, S., Ferre-D'Amare, A. R., Rueda, D. Allosteric tertiary interactions preorganize the c-di-GMP riboswitch and accelerate ligand binding. ACS chemical biology. 7, 920-927 (2012).
  24. Brenner, M. D., Scanlan, M. S., Nahas, M. K., Ha, T., Silverman, S. K. Multivector fluorescence analysis of the xpt guanine riboswitch aptamer domain and the conformational role of guanine. Biochemistry. 49, 1596-1605 (2010).
  25. Greenleaf, W. J., Frieda, K. L., Foster, D. A., Woodside, M. T., Block, S. M. Direct observation of hierarchical folding in single riboswitch aptamers. 319, Science. New York, N.Y. 630-633 (2008).
  26. Frieda, K. L., Block, S. M. Direct observation of cotranscriptional folding in an adenine riboswitch. 338, Science. New York, N.Y. 397-400 (2012).
  27. Neupane, K., Yu, H., Foster, D. A., Wang, F., Woodside, M. T. Single-molecule force spectroscopy of the add adenine riboswitch relates folding to regulatory mechanism. Nucleic acids research. 39, 7677-7687 (2011).
  28. Li, P. T. X., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Unusual Mechanical Stability of A Minimal RNA Kissing Complex. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15847-15852 (2006).
  29. Li, P. T. X., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Real-time control of the energy landscape by force directs the folding of RNA molecules. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 7039-7044 (2007).
  30. Tinoco Jr, I., Li, P. T. X., Bustamante, C. Determination of ther modynamics and kinetics of RNA reactions by force. Q Rev Biophys. 39, 325-360 (2006).
  31. Onoa, B., et al. Identifying kinetic barriers to mechanical unfolding of the T thermophila ribozyme. 299, Science. New York, NY. 1892-1895 (2003).
  32. Li, P. T., Tinoco Jr, I. Mechanical unfolding of two DIS RNA kissing complexes from HIV-1. J Mol Biol. 386, 1343-1356 (2009).
  33. Smith, S., Cui, Y., Bustamante, C. Optical-trap force transducer that operates by direct measurement of light momentum. Methods Enzymol. 361, 134-162 (2003).
  34. Stephenson, W., et al. The essential role of stacking adenines in a two-base-pair RNA kissing complex. J Am Chem Soc. 135, 5602-5611 (2013).
  35. Kaiser, C. M., Goldman, D. H., Chodera, J. D., Tinoco Jr, I., Bustamante, C. The ribosome modulates nascent protein folding. 334, Science. New York, NY. 1723-1727 (2011).
  36. Bizarro, C. V., Alemany, A., Ritort, F. Non-specific binding of Na+ and Mg2+ to RNA determined by force spectroscopy methods. Nucleic acids research. 40, 6922-6935 (2012).
  37. Bosaeus, N., et al. Tension induces a base-paired overstretched DNA conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 15179-15184 (2012).
  38. Berg-Sørensen, K., Power Flyvbjerg, H. spectrum analysis for optical tweezers. Rev Sci Instrum. 75, 594-612 (2004).
  39. Stephenson, W., et al. Combining temperature and force to study folding of an RNA hairpin. Phys Chem Chem Phys. 16, 906-917 (2014).
  40. Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophys J. 72, 1541-1555 (1997).
  41. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Intrinsic rates and activation free energies from single-molecule pulling experiments. Phys Rev Lett. 96, 108101(2006).
  42. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proc. Natl Acad Sci USA. 105, 15755-15760 (2008).
  43. Li, P. T. X., Collin, D., Smith, S. B., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Probing the Mechanical Folding Kinetics of TAR RNA by Hopping, Force-Jump and Force-Ramp Methods. Biophys J. 90, 250-260 (2006).
  44. Elms, P. J., Chodera, J. D., Bustamante, C. J., Marqusee, S. Limitations of constant-force-feedback experiments. Biophysical journal. 103, 1490-1499 (2012).
  45. Li, P. T. X. Analysis of Diffuse K+ and Mg2+ Ion Binding to a Two-Base-Pair Kissing Complex by Single-Molecule Mechanical Unfolding. Biochemistry. 52, 4991-5001 (2013).
  46. Wen, J. D., et al. Force unfolding kinetics of RNA using optical tweezers. I. Effects of experimental variables on measured results. Biophys J. 92, 2996-3009 (2007).
  47. Manosas, M., et al. Force Unfolding Kinetics of RNA using Optical Tweezers II. Modeling Experiments Biophys J. 92, 3010-3021 (2007).
  48. Vilfan, I. D., et al. An RNA toolbox for single-molecule force spectroscopy studies. Nucleic acids research. 35, 6625-6639 (2007).
  49. Li, P. T. X. Formation of a metastable intramolecular RNA kissing complex by nanomanipulation. Soft Matter. 9, 3246-3254 (2013).
  50. Chen, G., Chang, K. Y., Chou, M. Y., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Triplex structures in an RNA pseudoknot enhance mechanical stability and increase efficiency of -1 ribosomal frameshifting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 12706-12711 (2009).
  51. Chen, G., Wen, J. D., Tinoco Jr, I. Single-molecule mechanical unfolding and folding of a pseudoknot in human telomerase RNA. 13, RNA. New York, N.Y. 2175-2188 (2007).
  52. Tinoco, I., Chen, G., Qu, X. RNA reactions one molecule at a time. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2, a003624(2010).
  53. Dudko, O. K., Graham, T. G., Best, R. B. Locating the barrier for folding of single molecules under an external force. Physical review letters. , 107-208301 (2011).
  54. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489, 101-108 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

RNA-vouwingenkelvoudig molecuulkracht-extensieRNA-hairpinbead-tetheringflowkamermechanische ontvouwingtertiaire structuur
Nanomanipulatie van Single RNA-moleculen door een optisch pincet
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.