Kwantificeren Single microvessel permeabiliteit in Geïsoleerde-Blood geperfuseerde Rat Lung Voorbereiding

Samenvatting

De geïsoleerde bloed geperfundeerd long bereiding maakt het mogelijk om microvaatje netwerken visualiseren op het longoppervlak. Hier beschrijven we een aanpak om de permeabiliteit van enkele bloedvaten in geïsoleerde longen te kwantificeren met behulp van real-time fluorescentie beeldvorming.

Samenvatting

De geïsoleerde bloed geperfundeerd long preparaat wordt veel gebruikt visualiseren en definiëren signalering in enige microvaatjes. Door de koppeling van deze voorbereiding met real-time beeldvorming, wordt het mogelijk om de permeabiliteit in de individuele pulmonale bloedvaten te bepalen. Hierin beschrijven we stappen rattenlongen isoleren en perfuseren ze met autoloog bloed. Vervolgens schetsen we stappen om fluoroforen of agenten via een microkatheter bezielen in een kleine long regio. Met behulp van deze procedures beschreven, bepaalden wij permeabiliteit toename rattenlong microvaatjes in reactie op infusies van bacteriële lipopolysaccharide. De gegevens bleek dat lipopolysacharide toegenomen lek in zowel venular en capillaire microvessel segmenten. Dus deze methode is het mogelijk om de permeabiliteit antwoorden vergelijken tussen vasculaire segmenten en daarmee vast elke heterogeniteit in de respons. Terwijl gebruikelijke methoden longpermeabiliteit definiëren nabewerking vereisen longweefsel monsters, degebruik van real-time beeldvorming ondervangt deze eis zoals blijkt uit de huidige werkwijze. Zo is de gïsoleerde voorbereiding in combinatie met real-time beeldvorming biedt verschillende voordelen ten opzichte van traditionele methoden om long microvasculaire permeabiliteit te bepalen, maar is een eenvoudige methode te ontwikkelen en te implementeren.

Inleiding

Verhoogde microvasculaire permeabiliteit in de longen leidt tot ontwikkeling van alveolair oedeem evenals gemanipuleerde gasuitwisseling en is een belangrijk kenmerk van acute longbeschadiging (ALI) ^1-3. De ramingen van vasculaire permeabiliteit zijn belangrijk bij het bepalen van de omvang van longbeschadiging en effectiviteit van voorgestelde therapeutische interventies. Gravimetrische analyse zoals bloed vrij long nat-naar-droog-verhouding en microvasculaire filtratie coëfficiënt worden veel gebruikte methoden voor het schatten permeabiliteit ^4,5. Andere werkwijzen omvatten het kwantificeren het behoud van radioactieve of fluorescente probes in longweefsel ^6-8. De bovenstaande methoden vereisen postexperiment verwerking longweefsel monsters naar het ophelderen van de permeabiliteit gegevens. Aangezien een dier alleen kan worden gebruikt voor een behandelingsprotocol, kunnen grote aantallen dieren vereist voor volledige studie. Een gemeenschappelijk kenmerk van de bovengenoemde werkwijzen is dat zij bepalen de gemiddelde vasculaire permeabiliteit vooralle bloedvaten in het weefselmonster. Het is echter bekend dat long micro-en macro-vaartuigen fenotypisch verschillend ^9. Daarom kan permeabiliteit responsen heterogeen tussen de verschillende vlootsegmenten ook ^9,10. Zo kwantificeren gemiddelde permeabiliteit van alle longvaten in een weefselmonster kan onvoldoende rekening met deze heterogeniteit.

In de geïsoleerde-bloed doorbloed long voorbereiding, kan de bloedvaten op de long oppervlak worden gevisualiseerd door een rechtopstaande microscoop ^4,11,12. Hierdoor kunnen karakteriseren reacties in enkele schepen en dus de afhandeling van heterogeniteit in de antwoorden ^13. Bovendien, door gebruik van fluorescentie beeldvorming van microvaatjes, fluorescentie gebaseerde testen kunnen worden opgenomen. Verder kan een linker atrium microkatheter worden om middelen en fluorescentie probes leveren in bloedvaten ^11,14. De microcatheter beperkt de levering aan een kleine long regio, aldus exposeren alleen de bloedvaten in de regio om de toegediende agenten en fluoroforen. Hierdoor kunnen meerdere kleine gebieden binnen dezelfde longen te worden gebruikt voor afzonderlijke experimenten, wat leidde tot een vermindering dieren nodig voor een studie.

Real time beeldvorming maakt vangst van dynamische veranderingen in vasculaire en extravasculaire fluorescentie van enkele microvessels van de gïsoleerde voorbereiding. Zo moet in elk microvaatje in een afbeeldingsveld, veranderingen in fluorescentie gedurende infusie van fluoroforen en washoff kan worden geregistreerd en gekwantificeerd offline ^14. Met behulp van de waarden van de maximale en de resterende vasculaire fluorescentie, kan een permeabiliteit index voor elke microvaatje binnen het beeldveld worden bepaald. Om doorlaatbaarheid verandert in reactie op ontstekingen of schadelijke stoffen te bepalen, kan de gewenste middel eerst worden toegediend en dan bepaald de permeabiliteit index. Bovendien kan het beeldveld overal ingesteld worden longzone toegediend als demicrokatheter, waardoor een hoge mate van flexibiliteit in de gewenste vasculaire netwerk. Zo is de geïsoleerde bloed doorbloed long voorbereiding in combinatie met real-time beeldvorming biedt een aantrekkelijk experimenteel model om de permeabiliteit te kwantificeren in enkele long haarvaten.

Protocol

Alle experimenten uitgevoerd op dieren waren zoals goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Tennessee Health Science Center.

1. Tubing voor perfunderen Rat Lung Voorbereidingen

1. Bereid een buissysteem met Tygon-buis (# 18) voor bloed perfusie zoals getoond in figuur 1. Sluit drukopnemers (P23XL) en plaats de slang op de microscoop podium.
2. Stel waterbadtemperatuur tot 37 ° C.
3. Sluit de long en uitlaat tijdelijk met Tygon slang.

Figuur 1. Blood perfusieslang. Het schema toont de slang setup gebruikt voor het circuleren van bloed door de gïsoleerde voorbereiding. Ook geschikt zijn bijbehorende componenten waardoor de buis is gerouteerd. Een schema van het hart en de longen wordt opgenomen om gebieden van verbinding tussen de buis en pulmonale arterie (PA) vertonen en het linker atrium (LA) canule (blauwe stippellijnen).

2. Voorbereiding van Geïsoleerde Rat Longen

1. Verdoven ratten (mannelijke Sprague-Dawley ratten, 250-300 g) met ketamine (80-100 mg / kg) en xylazine (5-10 mg / kg). Na het veiligstellen van een chirurgische vlak van anesthesie, plaats het dier in rugligging.
2. Voer tracheostomie, plaatst u een tracheacanule (PE-90) en bevestig met chirurgische hechtdraad.
3. Bezielen heparine (100-200 U) in het hart van hartpunctie (21 G vlinder naald), wacht 60 seconden en exsanguinate bloed (~ 12-15 ml bloed).
4. Bereid twee canules (Tygon slang, 3 mm diameter, 4 cm lang, uitlopend aan de ene kant) en vul met een zoutoplossing.
5. Voer een thoracotomie. Maak een insnijding (3 mm) op de rechter ventrikel en schuif het uitlopende einde van een canule in de incisie naar de pulmonaireslagader. Secure canule longslagader met chirurgische hechtingen.
6. Incise (3 mm) de apex van de linker ventrikel en schuif het uitlopende einde van de tweede canule in de incisie. Leid de canule in het linker atrium. Bevestig canule naar de linker hartkamer met een navelstreng tape (2 mm breed).
7. Ontleden elke bindweefsel, en verwijder de longen en het hart samen met de bijgevoegde canules. Plaats long en hart op een petrischaal. Verplaats de longen, zodat het middenrif oppervlak is op de top. De drie canules moeten dezelfde richting gezicht.
8. Plaats de long voorbereiding op een podium dat kan worden gemanipuleerd in het XY richtingen. Elke fase die wordt geleverd met een microscoop kan worden aangepast aan de slang of een op maat gemaakte fasen gebouwd, indien nodig houden.

3. Doorbloeding van Geïsoleerde Rat Longen

1. Meng het verbloeden bloed met een gelijk volume albumine (5%) oplossing en voeg het reservoir. Start de peristaltische pomp aan en zet stroom rat 14 ml / min. Laat bloed om de slang te vullen.
2. Met de shunt open is, verwijdert u de tijdelijke long inlaat-uitlaat connector. Bevestig de longslagader en linker atrium canule aan de longen en uitlaat, respectievelijk. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de slang.
3. Sluit de tracheacanule aan een derde druk transducer (P23XL). Blaas longen met 30% zuurstof via de tracheacanule en de druk te handhaven op 5 cm H ₂ O.
4. Sluit de shunt met een klem aan longperfusie beginnen. Handhaaf longslagader en linker atrium druk op ~ respectievelijk 10 en 3 cm _H2O.

4. Voorbereiding Lung voor microvasculaire Infusion

1. Breng het achterste uiteinde van het verlengstuk van de katheter boven het niveau van de longen en veilig.
2. Bereid een infuuskatheter door het invoegen van ongeveer 30 cm van een 40 cm lange PE10 slang in een ~ 30 cm lang PE90 buis. Sluit het blootgestelde uiteinde van de PE10 slang aan een naald (30 G) opbevestigd aan een spuit (1 cc).
3. Plaats de katheter combinatie in het verhoogde achterste uiteinde van de verlenging buis. Leid de katheter combinatie op het linker atrium en in de longen totdat u weerstand voelt. Duw dan de PE10 katheter alleen verder in de longen totdat u weerstand voelt. Merk op dat het toepassen van buitensporig geweld tijdens het inbrengen van de katheter zal de long verwonden.
4. Vul het 1 cc spuit met Ringer-oplossing en hechten aan een injectiepomp. Stel infusiesnelheid tot 10 pl / min.
5. Infusie site zal bleke geworden in vergelijking met de rest van de long.
6. Bevochtig de long met zoutoplossing en bedekken de long met folie met een gat groot genoeg is om de infusieplaats onbedekt laten.
7. Wattenstaafje enkele kraan vet op de bodem van een O-ring (maat) en plaats een glazen dekglaasje (# 1.5, 22 mm diameter) op de bodem van de O-ring. Positie voorzichtig de O-ring met het dekglaasje op de infusieplaats. Zet de O-ring met een standaard test-tube holder. Het dekglaasje / O-ring combinatie bestaat niet de alveolaire structuren vervormen eronder, zoals onlangs gemeld ^15.
8. Plaats een objectief (20X) van een fluorescentiemicroscoop boven de O-ring gericht op het longoppervlak.

5. Imaging TL Dextraan doorvoer door microvessels

1. Bereid de microscoop voor beeldvorming FITC bloei.
2. Selecteer een regio af te beelden en het verwerven van beelden met een snelheid van 1/minuut met behulp van beeld acquisitie software.
3. Begin infusie van FITC-dextran 20 kD (0,5 mg / ml) met de spuitpomp. Fluorescentie in de bloedvaten zal geleidelijk toenemen en een maximum bereiken. Continue infusie gedurende 60 minuten.
4. Ga dan verder met Ringer's infuus te wassen luminale fluorescentie. Handhaaf infuus voor meer dan 10 minuten. Doorgaan beeldaanwinst bij 1/min tijdens wash-off.

6. Beeldanalyse

1. Open de afbeelding overname bestand.
2. Plaats regiovan rente over microvessels binnen het beeldkader.
3. Speel het beeldbestand frame-per-frame en noteer de fluorescentie-intensiteit bij elke regio van belang voor alle frames.
4. Plot de verandering in fluorescentie-intensiteit voor elk gebied van belang als een functie van de tijd.
5. Kwantificeren van de maximale fluorescentie-intensiteit en de resterende fluorescentie-intensiteit na 10 min. van washoff.
6. Bereken de verhouding van de maximale resterende fluorescentie intensiteit bij elk gebied van belang om de permeabiliteit index voor haarvaten verbonden met dat gebied plaats krijgen.

Resultaten

Geïsoleerd bloed geperfundeerd long preparaat verbonden met de perfusieslang en aanverwante apparatuur wordt getoond in figuur 2. Ter demonstratie, gebruikten we een Sprague Dawley rat, hoewel de hierin beschreven werkwijzen kunnen worden gebruikt met elke soort ratten. Infusions via een linker atrium microkatheter bereikt slechts een klein gebied van de long. De toegediende regio kan worden geïdentificeerd door de infusie veroorzaakte verkleuring (figuur 3). De long preparaat gepositio...

Discussie

De geïsoleerde-bloed doorbloed long voorbereiding in combinatie met real-time beeldvorming biedt een eenvoudig hulpmiddel voor het bepalen van de permeabiliteit veranderingen in enkele long haarvaten. Wij pasten deze methode doorlaatbaarheid verandert in reactie op infusies van LPS te bepalen. Onze gegevens suggereren duidelijk dat LPS infusie veroorzaakt een toename van de microvasculaire permeabiliteit. Verder, de gegevens blijkt ook dat permeabiliteit veranderingen geïnduceerd door LPS waren vergelijkbaar in beide ve...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Tygon Tubing	Fisher Scientific		#18
Pressure Transducer	Data Sciences International	P23XL	Hoeveelheid nodig 3
Butterfly Needle	Greiner Bio-One	450081	21 G
Peristaltische pomp	Cole Parmer	Masterflex L/S
PE-90 buis	Becton Dickinson	427421	30 cm nodig
PE-10 buis	Becton Dickinson	427401	40 cm nodig
Spuitpomp	Braintree Scientific	BS8000
O-ring			Op maat gemaakt met een gat van 20 mm diameter en een handvat om de O-ring op de houder te bevestigen
Rechtopstaande fluorescentiemicroscoop	Olympus America	BX61WI
Beeldverwervingssoftware	Molecular Devices	Metamorph
FITC Dextran 20KD	Sigma Aldrich		0,5 mg/ml (Een dextran van een andere moleculaire grootte kan worden geselecteerd, als proefexperimenten de geschiktheid aangeven op basis van de berekende permeabiliteitsindexwaarden)
Lipopolysaccharide	Sigma Aldrich		Serotype 0111:B4