Het ontdekken van eiwit interacties en karakteriseren Eiwit-functie gebruiken HaloTag Technology

Summary

HaloTag technologie is een multifunctionele technologie die heeft significante succes afzonderlijk van zowel kleine als grote eiwitcomplexen van zoogdiercellen. Hier hebben we aandacht voor de voordelen van deze technologie ten opzichte van bestaande alternatieven en demonstreren zijn nut op tal van aspecten van de functies van eiwitten in eukaryote cellen te bestuderen.

Abstract

Onderzoek in proteomics is geëxplodeerd in de afgelopen jaren met de vooruitgang in massaspectrometrie mogelijkheden die hebben geleid tot de karakterisering van tal proteomen, waaronder die van virussen, bacteriën en gist. Ter vergelijking, analyse van de menselijke proteoom achterblijft, mede door het grote aantal eiwitten dat moet worden onderzocht, maar ook de complexiteit van netwerken en interacties die aanwezig. Specifiek ingegaan op de uitdagingen van het begrijpen van de menselijke proteoom, hebben we HaloTag technologie ontwikkeld voor eiwitisolatie, bijzonder sterk voor isolatie van multiprotein complexen en een efficiëntere vangst van zwakke of voorbijgaande interacties en / of eiwitten in lage overvloed. HaloTag is een genetisch gecodeerd eiwitfusie tag, ontworpen voor covalente, specifieke en snelle immobilisatie of de etikettering van eiwitten met verschillende liganden. Gebruik te maken van deze eigenschappen, werden tal van toepassingen voor zoogdiercellen ontwikkeld om karakterize eiwit functie en hier presenteren we methodieken zoals: eiwit pull-downs gebruikt voor ontdekking van nieuwe interacties of functionele assays, en cellulaire lokalisatie. We vinden significante voordelen snelheid, specificiteit en covalente vangst van fusie-eiwitten aan oppervlakken voor proteoomanalyse in vergelijking met andere traditionele niet-covalente benaderingen. We tonen deze en de brede toepasbaarheid van de technologie met behulp van twee belangrijke epigenetische eiwitten als voorbeelden, de menselijke bromodomain eiwit BRD4 en histondeacetylase HDAC1. Deze voorbeelden tonen het vermogen van deze technologie waardoor de ontdekking van nieuwe interacties en karakteriseren van cellulaire lokalisatie in eukaryoten, die samen beter begrip van menselijke functionele proteomics wil.

Introduction

Begrip van cellulaire functie, reactie op stimuli, en veranderingen in de ontwikkeling en / of ziektetoestanden is onlosmakelijk verbonden met de-convolutie van het proteoom tijdens deze verschillende dynamische toestanden ^1,2. Er is veel gedaan om het proteoom van lagere organismen te begrijpen, echter, gezien het aantal eiwitten en alle mogelijke interacties, dit is zeer uitdagend geweest in de aanpak van het menselijk proteoom ^1,3-7. Vooruitgang in de massaspectrometrie zijn sterk staat het vermogen om deze onderzoeken uit te voeren, en hier geven we een bijkomende en belangrijke vooruitgang met de ontwikkeling van HaloTag technologie voor zowel efficiënte vangst van eiwitcomplexen en functionele karakterisering van menselijke eiwitten van zoogdiercellen ^8-10. Deze technologie is recentelijk verscheidene studies aangetoond dat een kritische factor voor ontdekking van belangrijke interacties, waardoor inzicht in nieuwe eiwitfunctie en understanding ziekte ^11-13.

De HaloTag eiwitfusie werd aanvankelijk ontwikkeld om een aantal uitdagingen van de traditionele affiniteit tags en ​​antilichamen als gerelateerd aan eiwit vastleggen, zuivering, en de etikettering ^8-10 pakken. In bijna alle methoden voor eiwit vangen en zuivering, er een niet-covalente interactie stap die wordt gebruikt voor de verrijking van een bepaald eiwit ^14. Tijdens deze stap kunnen de eiwitten en / of complexe scheiden door diffusie, vooral als het proces vereist uren in plaats van minuten. Om dit probleem aan te pakken, werd het fusie-eiwit speciaal ontworpen om snel en irreversibel interactie met de liganden, die hetzij deeltjes, oppervlakken of fluoroforen ^9. Daarom wanneer het is gebonden aan het ligand ervan, blijft gebonden, een van de meest onderscheidende factor in vergelijking met andere affiniteit tags. Ook hier blijkt, is de mogelijkheidverschillende biologische vragen te behandelen met een construct dat kan door afwisselende liganden ⁹ (figuur 1). Bijvoorbeeld, eiwit interacties of functie ondervragen oppervlak liganden worden gebruikt voor het vangen van eiwitten of complexen (figuur 1). In een apart experiment, kan hetzelfde fusie-eiwit fluorescent gelabeld zijn om cellulaire lokalisatie, handel, of eiwit omzet (figuur 1) te bestuderen. Het is belangrijk om te onthouden maar dat zodra een ligand gebonden is, of het nu een oppervlak of een fluorofoor is onomkeerbaar en daarom zijn andere liganden kan dan later in hetzelfde experiment gebonden.

Analyse van de bestaande technologieën om eiwit interacties in kaart onthullen de moeilijkheid om efficiënt isoleren specifieke interacties, inclusief die welke meer voorbijgaande zijn of in de lagere overvloed ^1,6,7,14,15. Ook recent werk van talrijke groepstentoonstellingentoont de zorg dat binnen de traditionele isolatiemethoden, met name op het gebied van menselijke proteomics, zijn er een groot aantal eiwitverontreinigingen welke signalen kunnen maskeren waar interactors in massaspectrometrie ^16. De vastgoed ontwikkeld voor de HaloTag eiwit en zijn mede-ontwikkeld hars adres goed deze bezorgdheid. In het protocol voor complexe pulldown (figuur 1), binding van complexen kan op 15 min, zowel bevordering complex vangen en het verminderen niveaus van niet-specifieke binding ^8. Bovendien irreversibel binden maakt efficiënte vangst van lage abundantie proteïnen en maakt het gebruik van veel minder cellen opnieuw reduceren achtergrond ^8. Zodra vangst van complexen is gevestigd, het protocol bevat milde wascondities om complexe integriteit te behouden. Elutie van de gevangen complexen kunnen worden uitgevoerd door twee werkwijzen en kiezen welke werkwijze wordt bepaald door het doel van de stroomafwaartse analelyse. Als de wens is om te analyseren of ontdek interagerende eiwitten door Western blot of massaspectrometrie, dan is het raadzaam om complexen elueren met denatureermiddelen zoals SDS of ureum (figuur 1). Dit is bijzonder voordelig voor massaspectrometrie als het oorspronkelijke eiwit gefuseerd aan HaloTag, zogenaamde aas eiwit zal achter gebonden aan het hars blijven en daarom zal de populatie van peptiden gedetecteerd in de massaspectrometrie niet domineren. Dit betekent echter ook dat het aas eiwit waarschijnlijk niet zichtbaar in de analyse met western-blot, een significant verschil in vergelijking met andere niet-covalente affiniteit zuivering of co-immunoprecipitaties. Als het doel is het zuiveren complex intact worden voor functionele studies, kan elutie worden uitgevoerd met TEV (Tobacco Etch Virus) protease, die de verwante splitsing wordt gecodeerd tussen het fusie-eiwit en het aas eiwit (Figuur 1) herkent. Teze monsters kunnen worden geanalyseerd door massaspectrometrie, maar zoals later getoond, zullen ze een aanzienlijke hoeveelheid lokaas eiwit dat detectie van lagere overvloed specifieke interactors kan verhinderen bevatten.

Hier presenteren we pulldown en imaging protocollen toegepast op twee belangrijke therapeutische proteïnen, de bromodomain eiwit BRD4 en een histonedeacetylase, HDAC1 ^17. Wij hebben aangetoond deze voorbeelden, interactie met verwachte partners zoals bepaald met massaspectrometrie, enzymatische activiteit na complexe isolement HDAC1 en goede cellulaire lokalisatie beide. Samen tonen deze resultaten de multifunctionele aard en de sterkte van de techniek voor de karakterisering van eukaryote eiwit interacties en functies.

Protocol

Opmerking: Het volgende protocol kan worden gebruikt met elke HaloTag fusie en elke cellijn naar keuze stabiel of transient getransfecteerd. Voor deze voorbeelden zullen we protocollen geven transiënte transfectie van HaloTag fusies in HEK293T of HeLa-cellen. Voor alle experimenten, raden wij het gebruik van het eiwit alleen controle.

1. Fusion Protein Expression Test

1. Verkrijgen fusie-eiwit construct:
   1. Krijgen vooraf gemaakte HaloTag fusievector of te construeren met behulp van bestaande vectoren. Voor meer informatie over de beschikbare constructies, zie Tabel van specifieke reagentia.
   2. Als het maken van een kloon, is het raadzaam om de sequentie controleren of de DNA.
2. Het testen van de expressie van fusie-eiwit en controle:
   1. Voor elk monster bereid 250 pi 1X SDS ladingskleurstof buffer (60 mM Tris HCl pH 6,8, 0,75 mM broomfenolblauw, 12,5% glycerol, 100 mM dithiothreitol, 0,5% SDS).
   2. Voor elke fusieproteïneen controle, plaat 0,5 ml HEK293T of HeLa cellen in hun respectievelijke media bij een dichtheid van 2-4 x 10 ⁵ cellen / ml in een standaard 24 wells plaat.
   3. Incubeer 18-24 uur bij 37 ° C en 5% _CO2, daarna transfecteren zoals aanbevolen.
   4. 24 uur na transfectie wordt 0,5 ul van 5 mM tetra-methyl rhodamine (TMR) ligand aan het medium van elk putje en meng plaat.
   5. Incubeer getransfecteerde cellen bevattende ligand voor 15 min bij 37 ° C en 5% _CO2.
   6. Aspireren off media die ligand en was elk putje van cellen voorzichtig met 1 ml RT PBS.
   7. Zuig uit PBS en voer een tweede maal spoelen met 1 ml RT PBS.
   8. Verwijder de PBS en voeg 200 ul 1X SDS geladen kleurstof buffer direct aan cellen.
   9. Pipet lysaat van plaat in 1,5 ml Eppendorf buis.
   10. Kook lysaat gedurende 5 min bij 95 ° C.
   11. Verwijder 5-10 ul van het reactiemengsel en de belasting op SDS-PAGE gel.
   12. Gebruik een fluorescerende detectie scanner(TMR Opwinding: 555 nm, emissie: 585 nm) om bands te detecteren. Gebruik fluorescente proteïne markers als standaarden.
   13. Als een fluorescentiedetectie scanner niet beschikbaar, western blots uitgevoerd met behulp van antilichamen tegen ofwel het aas eiwit of fusie-tag om expressie van het fusie-eiwit te detecteren.

2. Protein pulldowns

1. Bereiding van transient getransfecteerde cellen:
   1. Voor elke fusie of control bereiden een 15 cm schaal met 30 ml cellen bij 3-4 x 10 ⁵ cellen / ml of 1-1.2 x 10 ⁷ cellen totaal per construct.
   2. Incubeer 18-24 uur bij 37 ° C en 5% _CO2, daarna transfecteren construeren zoals aanbevolen.
   3. Na 24-48 uur na transfectie, verwijder de media en voorzichtig te wassen de cellaag met 20-25 ml ijskoude PBS.
   4. Verwijder PBS wassen, voeg dan 25-30 ml 4 ° C gekoeld PBS en voorzichtig schrapen cellen van de plaat.
   5. Verzamel cellen in conische buizen en gecentrifugeerdfuge gedurende 5-10 minuten bij 2000 xg en 4 ° C.
   6. Het supernatans en plaats celpellet bij -80 ° C gedurende ten minste 30 min of maximaal 6 maanden.
2. Equilibration van de HaloLink hars:
   1. Voor elke fusie of controlemonster, bereid 12 ml hars Equilibration / Wash buffer (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl en 0,005% IGEPAL CA-630). Opmerking: Het is zeer belangrijk en gebruik de hars Equilibratiebuffer binnen 12 uur zo verdund IGEPAL CA-630 is niet stabiel of effectief buiten dit tijdsbestek.
   2. Schud of meng hars om een ​​uniforme suspensie te verkrijgen.
   3. Voor elke pull-down experiment, afzien 200 ul van hars in een 1,5 ml microcentrifugebuizen.
   4. Centrifugeer gedurende 1 min bij 800 xg (bijvoorbeeld 3000 rpm in een microcentrifuge), dan voorzichtig te verwijderen en de supernatant (ethanol) verwijderen zonder het verstoren hars bij de bodem van de buis.
   5. Voeg 800 ul van Resin Equilibration / Wash buffer en meng door het buisje meerdere malen.
   6. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 800 xg, verwijder dan zorgvuldig en gooi het supernatant.
   7. Herhaal stap 2.2.5 en 2.2.6 twee keer voor een totaal van 3 wassingen.
   8. Heeft de laatste wasbeurt of supernatant tot klaar om cellysaten hieronder beschreven (stap 2.3.8) toe te voegen om te voorkomen dat de hars uitdroogt niet verwijderen.
3. Binding en wassen van fusie complexen:
   1. Voor elk monster bereid Mammalian 500 ui lysisbuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% Na-deoxycholaat) en 1 ml 1X TBS-buffer (100 mM Tris-HCl pH 7,5 en 150 mM NaCl).
   2. Ontdooi de celpellets en resuspendeer in 300 ul lysisbuffer zoogdieren door en neer te pipetteren of kort vortexen.
   3. Voeg 6 pl 50X proteaseremmercocktail (800 ug / ml benzamidine HCl, 500 ug / ml phenanthroline, 500 ug / ml aprotinine, 500 ug / ml leupeptine, 500 & #. 181; g / ml pepstatine A, 50 mM PMSF) Opmerking: protease cocktails die AEBSF omvatten kan niet worden gebruikt als deze functies eiwitfusie tag bindend.
   4. Voeg 3 ul RQ1 DNase en keer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
   5. Dounce met glashomogenisator 2,0 ml grootte; . 25-30 slagen op ijs, of pass cellen door een 25 of 27 G naald 5-10 keer tot lysis voltooien Opmerking: Sonicatie wordt niet aanbevolen als complexen kunnen uit elkaar vallen en oververhitting kan de eiwitfusie tag activiteit beïnvloeden.
   6. Centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C om het lysaat te wissen.
   7. Transfer duidelijk lysaat, ongeveer 300 ul totaal volume, nieuwe buis en leg ze op ijs.
   8. In ontruimen lysaat een extra 700 ul van 1X TBS-buffer en meng goed door en neer te pipetteren.
   9. Neem geëquilibreerd hars buizen bereid in stap 2.2.8 en verwijder laatste wasbeurt / supernatant van hars zonder verstoring hars bij de bodem van de buis.
   10. In elk tuzijn van hars, de 1 ml verdund lysaat.
   11. Incubeer onder mengen op een buis rotator (of zachte menger) gedurende 15 minuten bij 22 ° C. Opmerking: Bewoning hars gedurende deze periode vermindert bindingsefficiëntie. Indien binding bij 4 ° C is gewenst, doen door mengen gedurende 1 uur.
   12. Centrifuge hars buizen gedurende 2 min bij 800 xg en gooi supernatant.
   13. Voeg 1 ml van Resin Equilibration / Wash buffer gemaakt bij stap 2.2.1 en meng goed door het omkeren van de hars buis met de hand een paar keer.
   14. Centrifuge hars buizen gedurende 2 minuten bij 800 xg en de was gooi.
   15. Herhaal de stappen 2.3.12 gevolgd door 2.3.14 drie extra keer.
   16. Voeg 1 ml hars Equilibration / wasbuffer en incubeer bij 22 ° C gedurende 5 minuten met een constante rotatie.
   17. Centrifuge hars buizen gedurende 2 minuten bij 800 xg en de was gooi.
   18. Afhankelijk end applicatie (zie Inleiding voor meer uitleg), overgaan tot ofwel paragraaf 2.4 of 2.5.
4. SDS elutie voor denaturering gels, western blots, of massaspectrometrie:
   1. Resuspendeer de hars van elk monster in 50 pl SDS elutiebuffer (1% SDS en 50 mM Tris-HCl pH 7,5)
   2. Schud buizen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
   3. Centrifugeer gedurende 2 min bij 800 xg en overdracht eluaten verse buizen voor analyse.
   4. Voor western blot of zilver vlek gel, belasting 5-10 ui op een SDS denaturerende gel.
   5. Voor massaspectrometrie, slaan 40 pi van elk monster bij -20 ° C.
5. TEV protease elutie voor functionele testen, western blots, of massaspectrometrie:
   1. Na het verwijderen van de laatste wasbeurt, resuspendeer de hars in 50 ui ProTEV decollete buffer en 30 eenheden van TEV enzym.
   2. Incubeer bij 25 ° C onder schudden gedurende 1 uur.
   3. Centrifugeer gedurende 2 min. bij 800 x g.
   4. Transfer eluaat frisse buizen.
   5. WINKEL monster bij 4 ° C voor onmiddellijk gebruik in functionele testen.

3.Cellulaire Beeldvorming van fluorescent gelabelde fusie-eiwitten met behulp van een Cytoplasmic en Nucleaire Permeable Ligand

1. Transfecteren, label, en afbeelding cellen:
   1. In een 8 goed chambered dekglaasje elk fusie-eiwit of controle plaat 400 ul van HeLa-cellen in de betreffende media elk putje bij een dichtheid van 1-2 x 10 ⁵ cellen / ml.
   2. Incubeer 18-24 uur bij 37 ° C en 5% _CO2, daarna transfecteren zoals aanbevolen.
   3. 18-24 uur na transfectie, verdund 1:200 in TMR ligand geschikte cellulaire media, voeg 100 ul van deze oplossing in elk putje en meng.
   4. Incubeer getransfecteerde cellen bevattende ligand voor 15 min bij 37 ° C en 5% _CO2.
   5. Aspireren off media die ligand en te vervangen door 500 ul van geschikte media ontbreekt eiwitfusie tag ligand, die is voorverwarmd tot 37 ° C.
   6. Herhaal tweemaal voor een totaal van drie wassingen.
   7. Zet cellen terug in incubator (376, C en 5% _CO2) gedurende 30 minuten.
   8. Zuig uit media en te vervangen door 500 ul van geschikte media, die is voorverwarmd tot 37 ° C.
   9. Beeld op een microscoop met passende acquisitie parameters (TMR excitatie: 555 nm, emissie: 585 nm).

Results

Bij het werken met nieuwe fusie-eiwit, is het belangrijk om eerste test voor expressie van dat eiwit na transfectie en ook valideren dat een eiwit van de echte molecuulgewicht wordt geproduceerd. Zoals HaloTag fusieproteïnen fluorescent en covalent gelabeld met doorlaten afhankelijk lokalisatie, ondoordringbaar liganden zijn, is het mogelijk om snel te bepalen expressie door toepassing cellysaten aan denaturerende gelelektroforese gevolgd door scannen op een Fluorimager. Met behulp van de in punt 1.2, de expressie van Halo-BRD4 (189 kD) en de HaloTag alleen control (Ctrl) wordt waargenomen (34 kD, figuur 2A) beschreven protocol. Zoals vermeld in het protocol, kan de expressie van fusie-eiwitten ook worden gedetecteerd met behulp van traditionele Western blots met anti-HaloTag antilichamen, of als ze beschikbaar zijn, antilichamen tegen het aas eiwit. Indien mogelijk, is het raadzaam om de fluorescerende ligand te gebruiken in plaats zoals het is meer specifiek, sneller en eenvoudiger than antilichaamdetectie, en ook kwantitatieve ^10.

Na expressie van de echte volledige lengte fusieproteïne wordt gecontroleerd kunnen eiwit pulldowns worden uitgevoerd. Weergegeven in figuur 2B zijn de zilveren gekleurde gels van biologische herhalingen van Halo-BRD4 en Ctrl pulldowns geëlueerd door SDS (Protocol paragraaf 2.4) die een hoge reproduceerbaarheid te tonen. De zilverkleuring gels vertonen een groot aantal eiwitten in wisselwerking te staan ​​met de BRD4 eiwit en zeer lage achtergrond in de controlegroep (Figuur 2B). Zoals vermeld in de inleiding, in dit proces van elutie, Halo-BRD4 niet worden geëlueerd uit het hars zoals covalent gebonden blijft. Daarom is er geen significante band bij dit molecuulgewicht wordt gedetecteerd in de zilverkleuring (Figuur 2B) of western blot (gegevens niet getoond). Om te bepalen of deze eiwitten specifiek BRD4, vloeistofchromatografie massaspectrometrie (LC-MS/MS) werd uitgevoerd op de complex mengsel verkregen na SDS elutie. Weergegeven in figuur 2C zijn spectrale telt en genormaliseerde spectrale overvloed factor (NSAF) waarden voor bekende interactoren van BRD4 ^18-20 gevonden in de Halo-BRD4 massaspectrometrie-analyse. De hoge dichtheid van onderdelen uit pTEFb ^18,20 en ook de BRD9 ¹⁹ eiwit bevestigen specifieke vangst van BRD4 complexen. Zoals voorspeld door zilverkleuring gels (figuur 2B), werden talrijke andere eiwitten geïdentificeerd als mogelijke interactoren van BRD4 die niet werden waargenomen in de controle (gegevens niet getoond). Aangezien deze voorheen onbekende, moeten ze onafhankelijk worden geverifieerd door andere methoden om te bevestigen of het eiwit is een echte interactor, en zo ja, of het is direct of indirect verband houden met BRD4.

Geïsoleerde complexen kunnen ook worden bestudeerd voor de activiteit; Het is aan te bevelen om complexen elueren met behulp van TEV protease (Protocol paragraaf 2.5), zodat ze functionaliteiten behoudenty. In figuur 3A, een zilverkleuring gel Halo-HDAC1 pulldown complexen afgegeven uit de hars met TEV protease weergegeven. Zoals TEV protease zal splitsen in een linkergebied tussen de eiwitfusie tag en de fusiepartner, aanzienlijke hoeveelheden van het aas eiwit, in dit geval HDAC1, waargenomen (Figuur 3A). Om te bepalen of deze fractie bevatte HDAC1 activiteit werden geëlueerd TEV monsters getest in een luminescerend HDAC assay HDAC-Glo ^21. Zoals getoond in figuur 3B, HDAC1 pulldown vertoonden hoge HDAC1 activiteit (kolom 1), dat specifiek werd geremd door een bekende HDAC-remmer, SAHA ²² (kolom 2). Als controles verder specificiteit tonen werd geen HDAC remming waargenomen met een verwante familie sirtuin remmer, EX-527 ²² (kolom 3) en geen signaal werd gedetecteerd met alleen buffer zonder HDAC1 pulldown monster toegevoegd (kolom 4).

Een belangrijk onderdeel van de functieal proteomics en begrijpen complexen, wordt ook begrip eiwit lokalisatie en / of-handel. Aangezien deze zelfde fusieconstructen fluorescent kunnen worden geëtiketteerd in de cellen, we gevolgd hun lokalisatie via confocale beeldvorming. Volgens het protocol in hoofdstuk 3, werden HeLa-cellen tijdelijk getransfecteerd met Halo-BRD4 (Figuur 4A) en Halo-HDAC1 (Figuur 4B) fluorescent gelabeld met de TMR ligand en afgebeeld. Zoals getoond in figuren 4A en 4B, gelocaliseerd aan de kern ¹⁷ zoals verwacht. Deze gegevens tonen dat de aanwezigheid van label fysiologische cellulaire lokalisatie van de fusiepartners niet veranderde.

Figuur 1. Schematische eiwit pulldown en confocale imaging toepassingen. Gebruik als Ingle bouwen diverse toepassingen voor het begrijpen van de functies van eiwitten in zoogdiercellen zijn mogelijk. Voor al een Halo fusie construct ofwel stabiel of tijdelijk tot expressie gebracht in aanhechtende of suspensie zoogdiercellen. Voor eiwitcomplex pulldowns, worden de cellen vervolgens gelyseerd, complexen covalent vastgelegd op hars en geëlueerd door ofwel SDS elutie (links route) of TEV decollete (juiste weg). SDS elutie wordt aanbevolen voor u verder gaat met massaspectrometrie-analyse, terwijl TEV decollete is optimaal voor het uitvoeren van functionele analyse. Om uitdrukking, cellulaire lokalisatie, handel evenementen of eiwit omzet karakteriseren, worden live cellen die fusie-eiwitten fluorescent gelabelde en verder geanalyseerd op SDS-PAGE gels of met behulp van confocale beeldvorming. Beide celpermeabele of ondoordringbare fluorescerende liganden zijn beschikbaar, afhankelijk van de lokalisatie of de presentatie van het fusie-eiwit in de cel.

igure 2 "fo: content-width =" 6in "src =" / files/ftp_upload/51553/51553fig2highres.jpg "width =" 600 "/>
Figuur 2. Halo-BRD4 eiwit expressie, pulldown, en massaspectrometrie-analyse. (A) Een SDS-PAGE gels die de expressie van Halo-BRD4 fusie-eiwit, 189 kD, en Halo eiwitfusie tag alleen, 34 kD, control (Ctrl) binnen een HEK293T cellulaire lysaat gelabeld met TMR ligand (Protocol paragraaf 2.1). Gelen werden gescand met Fluorimager voor detectie en een fluorescerende molecuulgewichtsmerker werd gebruikt. (B) Zilver vlek gels van biologische herhalingen voor pulldowns van Halo-BRD4 en Ctrl monsters geëlueerd met SDS. Molecuulgewicht maten zijn aangegeven voor de gel. (C) Spectral tellingen (linker paneel) en genormaliseerde spectrale overvloed factoren (NSAF) waarden (rechter paneel) die goed zijn voor eiwit molecuulgewicht van eiwitten die in massaspectrometrie analyse van biologische replicaten van Halo- BRD4 en Ctrl. Getoond zijn bekende eiwitten interageren wet BRD4, inclusief componenten van pTEFb (CDK9 en cycline T) ^18,20, en BRD9 ^19. Geen peptiden uit deze eiwitten werden geïdentificeerd in de Ctrl.

Figuur 3. Halo-HDAC1 complex isolatie en activiteit analyse. (A) Silver vlek gels met de isolatie van de Halo-HDAC1 complexen en de achtergrond van de Ctrl na TEV decollete (Protocol paragraaf 2.5). De prominente HDAC1 band (55 kDa) en de TEV protease band zijn gelabeld. De vrije HDAC1 wordt gegenereerd door TEV klieving binnen een linker geoptimaliseerd tussen HaloTag en HDAC1 fusie-sequentie na het maken van de hars (Figuur 1). (B) Grafiek waarin de activiteit van HDAC1 complex isolaties monsters in een luminescerend histondeacetylase assay HDAC- Glo ^21. Kolom 1 van de grafiek toont een hoge levels van HDAC-activiteit opgenomen met de Halo-HDAC1 pulldown monsters (HDAC1). Kolom 2 toont deze activiteit kan specifiek worden verminderd door toevoeging van de HDAC-remmer, SAHA ²² het HDAC1 pulldown monsters. Als controles, Kolom 3 toont een deacetylaseinhibitor specifiek voor de sirtuin familie, maar niet HDAC's, EX-527 ^22, niet HDAC1 activiteit en in kolom 4 aan geen activiteit wordt waargenomen met behulp van alleen buffer remmen.

Figuur 4. Halo-BRD4 en H-HDAC1 confocale beeldvorming. Live cell confocale beeldvorming van HeLa cellen getransfecteerd met Halo-BRD4 (A) of halogeen-HDAC1 (B) fluorescent gemerkt met TMR ligand. (A) Halo-BRD4 expressie beperkt de kern en (B) Halo-HDAC1 expressie voornamelijk nuclear. Linkerkant van panelen is fluorescerend kanaal en rechts is een overlay van de tl-kanaal met de DIC-kanaal voor elk. Beelden werden verkregen op een confocale microscoop uitgerust met een 37 ° C + CO ₂ klimaatkamer met behulp van geschikte filter sets. Schaalbalken = 20 urn.

Discussion

Hier voorgesteld zijn twee fusie-eiwitten, Halo-BRD4 en H-HDAC1 kenmerk eukaryote zoogdiercellen voor expressie, eiwitcomplex isolatie en activiteit en cellulaire lokalisatie. In het werken door middel van deze verschillende protocollen, zijn er een aantal belangrijke stappen voor het succes van elk experiment. Zoals het geval is met een fusie-eiwit expressieniveau en plaatsing van de tag zelf kan cruciaal voor het handhaven fysiologie. Het is daarom belangrijk om te overwegen dat N-en / of C-terminale fusies moet worden ontworpen indien voorkennis of met andere label is niet aangetoond voor de specifieke gekozen eiwit. Wat expressie, als het te hoog is, verdunning van DNA kan worden tijdens transfectie of het gebruik van vectoren uitgevoerd met zwakkere promoters mogelijk het passend niveau is bereikt. Eerder werk heeft verricht waaruit blijkt efficiënte isolatie van macromoleculaire complexen aan endogene levels van meningsuiting ^8, waardoor het werk op zeer lage niveaus van meningsuiting. Indien mogelijk, zou cellulaire lokalisatie studies ook in staat om inzicht te verschaffen over de optimale tag plaatsing positie als relatieve expressie niveau nodig voor een goede fysiologie.

Wanneer de fusie-eiwitten zijn klaar voor pulldown experimenten maximale succes te verkrijgen met het protocol is het zeer belangrijk om de aanbevolen tijd frames in de lysis volgen binding en wassen secties, als een van de grootste voordelen is de snelheid van het complex isolatie proces. Als een van deze stappen worden verlengd in de tijd, zoals vereist is voor een antilichaam gebaseerde opnamemethode, bestaat het risico van complexe dissociatie of verhoogde niet-specifieke binding ^8. Ook als de tijden cellulaire lysis of bindende verkort, cellen niet volledig gelyseerd respectievelijk efficiënt gevangen. Als het aantal wasbeurten is decrverlicht en goed mengen van de hars niet tijdens de dwingende of wast vervolgens achtergrondniveaus van niet-specifieke eiwitten worden verhoogd. Ook de middelen lysis is zeer belangrijk in relatie tot de bindingsefficiëntie aan de hars. Pogingen om ultrasone trillingen de monsters, verwijder de aanbevolen wasmiddel toevoegen SDS of andere sterke oplosmiddelen en / of die de protease inhibitor AEBSF leidt tot verminderde of verlies van binding van fusie-eiwitten en hun complexen aan de hars.

Bestaande methoden voor complexe isolatie van zoogdiercellen en menselijk proteoom analyse worsteling met de uitdaging om de achtergrond in de analyse met behulp van massaspectrometrie ^16. Dit is zo omvangrijk dat een opslagplaats van verontreinigende proteïnen is gemaakt door tal van massaspectrometrie groepen ¹⁶ geweest. Achtergrond in massaspectrometrie pulldown monsters kunnen worden gedefinieerd als alles wat geïdentificeerd voorkomtware interactoren van het aas eiwit. Als zodanig kan achtergrond voortvloeien uit verontreinigend niet-specifieke eiwitten of ook grote concentraties van lokaas eiwitten of antilichamen gebruikt lokaas eiwitten precipiteren. Significante werk verricht optimaliseren zowel de pulldown protocol hier gepresenteerd als de hars op het niveau van de niet-specifieke verontreinigende proteïnen in het pulldown te minimaliseren. Dit blijkt uit de zilverkleuring gels en massaspectrometrie analyse van de controle (Figuur 2). De hoge niveaus van lokaas eiwit of antilichamen die even schadelijk als contaminanten en waarmee andere methodieken strijd kunnen aanpakken, is het pulldown met SDS elutie aanbevolen (Protocol paragraaf 2.4). Door de covalente hechting aan de hars, zal dit proces de meeste van de uitgangsmaterialen fusie-eiwit covalent aan de hars te verlaten. Een klein percentage van aas wordt waargenomen in de massaspectrometrische analyse, waarvan wordt aangenomenplaatsvinden door hydrolyse, maar het is geen probleem voor de detectie van andere zwakkere of transiënte interactie ^8.

Zoals vermeld in de inleiding, hebben aanzienlijke vooruitgang in proteomics ingeschakeld door aanzienlijke vooruitgang in massaspectrometrie ^1,7. Daarom is het belangrijk om belangrijke parameters voor de keuze van massaspectrometrie analyse wijzen aan het mengsel van eiwitten verkregen in de pulldown deconvolute. Instrumenten moeten robuust en kunnen routinematig en efficiënt analyseren van monsters met een kleine hoeveelheid eiwitten, vaak minder dan <1 ug zijn. Nanoscale chromatografie met 50-75 urn inwendige diameter HPLC kolommen met stroomsnelheden in het 100-300 nl / minuut en wordt typisch gebruikt voor compatibiliteit met de kleine steekproeven en de gevoeligheid van de massaspectrometer maximaliseren. Om de verworven in een enkele analyse staat o informatie te maximaliserenf de kunst massaspectrometers kunnen overnemen hoge resolutie massa spectra op een tijdschaal verenigbaar is met voornoemde nanoschaal scheidingen, ≥ 10 Hz, worden typisch gebruikt. Deze instrumenten hebben attomolar niveaus van gevoeligheid en kan routinematig gegevens met sub ppm voorloper en product ionenmassa foutenmarges verwerven. Deze prestatiekenmerken dienen om de opbrengst van het aantal geïdentificeerde eiwitten en het vertrouwen in verband met deze identificaties verhogen.

Met deze gegevens tonen we fysiologische cellulaire lokalisatie, goede eiwit: eiwit interacties met potentieel voor ontdekking van nieuwe interacties en isolatie van actieve complexen alle met een construct. Inderdaad alternatieve technologieën kunnen worden toegepast voor elk van deze verschillende aspecten, maar waarschijnlijk niet voor alle ^23,24. Met de HaloTag technologie, kan een multifunctionele benadering worden gebruikt, oprukkende proteoics studies en het verkrijgen van een meer volledig begrip van eiwitfunctie in zoogdiercellen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HeLa Cells	ATCC	CCL-2	Adherent
HEK293T Cells	ATCC	CRL-11268	Adherent
Cellular growth media	Invitrogen/Gibco
PBS - tissue culture certified	Invitrogen/Gibco
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311
HaloTag Control Vector	Promega	G6591
HaloTag-BRD4	Kazusa DNA Research Institute	FHC11882	N-terminal HaloTag fusion
HaloTag-HDAC1	Kazusa DNA Research Institute	FHC02563	N-terminal HaloTag fusion
HaloTag Clones containing content	Promega	Various	http://www.promega.com/FindMyGene/
HaloTag Flexi Vectors for cloning (N- or C-terminal)	Promega	Various	Choose based upon expression level and HaloTag orientation
HaloTag TMR Ligand	Promega	G8251
IGEPAL CA-630	Sigma	18896
HaloTag Mammalian Pull-Down and Labelling System	Promega	G6500	Contains HaloTag TMR ligand
HaloTag Mammalian Pull-Down System	Promega	G6504
Protease Inhibitor Cocktail, 50X	Promega	G6521
Mammalian Lysis Buffer	Promega	G9381
HaloTag Monoclonal Antibody	Promega	G9211
ProTEV Plus	Promega	V6101
RQ1 Dnase	Promega	M6101
HaloLink Resin	Promega	G1912
HDAC-Glo	Promega	G6420
PBS + 0.1% Triton X-100			For optional imaging
4% paraformaldehyde/0.2 M sucrose/PBS			For optional imaging
Ethanol
Tissue culture vessels and dishes
Cell culture incubator
Disposable cell lifter	Thermo Fisher Scientific	08-773-1
Glass homogenizer such as Kontes Dounce Tissue Grinder	Thermo Fisher Scientific	K885300-0002	25-27 G needle could also be used
Microcentrifuge
Tube rotator such as Labquake	Thermo Fisher Scientific	4002110Q	Ideal for binding and washing steps
Shaking platform such as Eppendorf Thermomixer	Thermo Fisher Scientific	05-400-200	Ideal for SDS elution and TEV cleavage steps
Chambered cover glass	Thermo Fisher Scientific	155409	For optional imaging
Fluorescent Microscrope (555 nm Ex/585 nm Em)			For optional imaging