Method Article

Isolatie van humane monocyten door Double gradiëntcentrifugering en hun differentiatie tot macrofagen in Teflon-coating Cell Culture Tassen

DOI:

10.3791/51554

⸱

September 9th, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology and Oncology, University Medical Center Göttingen, 2Microbial Interface Biology Group, Research Center Borstel

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij presenteren een eenvoudig en efficiënt protocol voor het genereren van humane macrofagen. Buffy coats worden door dubbele dichtheidsgradiënt centrifugatie en geïsoleerde monocyten worden vervolgens gedifferentieerd macrofagen in met Teflon beklede celkweek zakken. Dit maximaliseert macrofaag opbrengst en vergemakkelijkt cel oogsten voor volgende experimenten.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke macrofagen betrokken zijn bij een grote verscheidenheid aan pathologische processen gaande van infectieziekten kanker. Zo vormen zij een waardevol instrument om de onderliggende mechanismen van deze ziekten te begrijpen. Daarom presenteren een eenvoudig protocol voor de isolatie van humane monocyten uit buffy coats, gevolgd door een differentiatie procedure die leidt tot hoge opbrengsten macrofaag. De techniek berust grotendeels op algemeen beschikbare laboratoriumapparatuur, en derhalve een kosten en tijd efficiënte manier om grote hoeveelheden menselijke macrofagen verkregen. Kort buffy coats van gezonde bloeddonoren onderworpen aan een dubbele dichtheidsgradiënt centrifugatie monocyten oogsten uit het perifere bloed. De monocyten worden vervolgens gekweekt in gefluoreerd ethyleenpropyleen (FEP)-Teflon beklede celkweek zakken in aanwezigheid van macrofaag-kolonie stimulerende factor (M-CSF). Het gedifferentieerde macrofagen kunnen gemakkelijk worden geoogst en gebruikt voor verdere studies en functioneelzegt. Belangrijke methoden voor de validatie van de isolatie en differentiatie stappen zullen worden belicht in het protocol. Samengevat, de hier beschreven protocol kunnen wetenschappers routinematig en reproduceerbaar te isoleren menselijke macrofagen zonder dat kostenintensieve hulpmiddelen. Bovendien kan de ziekte van modellen worden bestudeerd in een syngenetische menselijk systeem te omzeilen het gebruik van muizen macrofagen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellen van de monocyt geslacht en de terminaal gedifferentieerde derivaten - macrofagen - vertonen een opvallende plasticiteit met betrekking tot hun biologische functie, waardoor hun betrokkenheid in zulke uiteenlopende processen ontwikkeling, weefselherstel en immuniteit 1. Dit laatste is te wijten aan hun fagocytaire en antigeen-presenterende capaciteit die macrofagen plaatst op het kruispunt tussen het aangeboren en adaptieve immuunrespons 2. Hun vermogen om cytokines, chemokines, groeifactoren en andere signaalmoleculen afscheiden 1 niet alleen verhoogt hun immuun modulerende functie maar ook dient als basis voor de aanvullende functies. Pogingen om deze verschillende activering stappen in de context van niet-microbiële gemedieerde aandoeningen hebben geleid tot de M1 en M2 categorieën 3 spiegelen. Hoewel deze indeling is niet compleet, het zorgt voor een fundamenteel begrip van macrofaag biologie.

Door deze veelzijdige mogelijkheden het komt niet als een verrassing dat macrofagen worden geassocieerd met vele voorwaarden die op een bepaalde manier te betrekken weefselremodellering of ontsteking. Naast hun fundamentele rol in de erkenning en goedkeuring van de binnendringende ziekteverwekkers 4-6, zijn macrofagen steeds meer op de nadruk in atherosclerose, fibrose, obesitas en kanker 7-10. Een reproduceerbare werkwijze voor het genereren van humane macrofagen is daarom cruciaal voor het begrijpen van deze pathologieën. Hier presenteren we een methode waarbij de isolatie van humane monocyten uit het perifere bloed van gezonde donoren door een dubbele dichtheidsgradiënt centrifugatie techniek zoals eerder 11 beschreven. Om differentiatie tot macrofagen bevorderen, worden de geïsoleerde monocytische cellen geïncubeerd in de aanwezigheid van lage concentraties van M-CSF en normaal humaan serum 12. Om verdere behandeling en cel oogst te vergemakkelijken, wordt de differentiatie in zuurstofdoorlatende FEP uitgevoerdTeflon-coating celcultuur zakken met een hydrofoob oppervlak 12-15. De resulterende rustende macrofagen kunnen worden onderworpen aan diverse testen zoals ze nog kan reageren in hetzij een M1 of M2-achtige manier. Alternatieve methoden monocyt isolatie en daaropvolgende differentiatie zoals magnetische geactiveerde celsortering (MACS) of tegenstroom centrifugale elutriatie (CCE) enkele beperkingen met betrekking tot de opbrengst, kosten en tijd vereist. De hierin beschreven protocol biedt het voordeel dat het met standaard laboratorium apparatuur kan worden uitgevoerd zonder de noodzaak van speciale reagentia (bijvoorbeeld MACS magnetische beads) of inrichtingen (bijvoorbeeld CCE inrichting) en maakt de verwerking van grote hoeveelheden cellen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 Bereiding van steriel menselijk AB serum

  1. Verzamel 4-5 zakken van vers bevroren plasma (FFP). WINKEL zakken bij -20 ° C totdat zijn voldoende zakken verzameld.
  2. Ontdooi zakken en incubeer gedurende 30 minuten bij 56 ° C in een waterbad om complement te inactiveren en verwijderen fibrine.
  3. Grondig ontsmetten de buitenkant van de zakken en breng het plasma tot 50 ml buizen.
  4. Centrifugeer bij 3000 xg gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur te ontdoen van precipitaten en plaatjesresten.
  5. Bundelen alle bovenstaande vloeistoffen en gooi de pellets.
  6. Aliquot serummonsters in 15 ml buizen en bewaar bij -20 ° C.
    OPMERKING: U kunt de handel verkrijgbare warmte geïnactiveerd normaal menselijk AB-serum worden gebruikt.

2 Isolatie van monocyten

Om in evenwicht brengen van de centrifuge te vergemakkelijken, is het raadzaam om twee buffycoats parallel verwerken. Echter, neem care afzonderlijke materialen voor elke donor en niet de cellen te mengen. Indien buffy coats niet gemakkelijk kan worden verkregen, kan 400 ml gehepariniseerd perifeer bloed worden gebruikt.

  1. Desinfecteren voorzichtig de plastic zakken met de buffycoats en breng de inhoud van elk buffycoat twee buizen van 50 ml.
  2. Per buffy coat vullen drie 50 ml buizen met 15 ml Ficoll-oplossing (1,077 g / ml). De Ficoll moet bij omgevingstemperatuur voor de bereiding.
  3. Layer 30-35 ml van de bufferlaag bloed bovenop de Ficoll oplossing voor de eerste dichtheidsgradiënt. Zorg er voor dit langzaam en voorzichtig doen om te voorkomen dat het mengen van beide lagen.
  4. Centrifugeer bij 400 xg zonder rem gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
  5. Voor elke gradiënt verzamel de witte ring van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) die zich tussen de twee fasen met een plastic Pasteur pipet overgebracht in een 50 ml buis.
  6. Vul elke buis met PBS-EDTA (1 mM) tot 40 ml in totaal.
  7. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min zonder rem bij kamertemperatuur.
  8. Zuig supernatant en was pellet opnieuw met 40 ml PBS-EDTA (1 mM).
  9. Voor elke donor zwembad de pellets in 20 ml RPMI-1640 zonder fenol rood + 10% FCS.
  10. Bereid de iso-osmotisch Percoll oplossing voor het tweede dichtheidsgradiënt: Twee donors meng 23,13 ml Percoll-oplossing (dichtheid: 1,131 g / ml) in een 50 ml buisje met 1,87 ml 10-voudig PBS. Vervolgens over 23 ml van deze oplossing tot een nieuwe buis van 50 ml en voeg 27 ml RPMI-1640 met fenolrood + 10% FCS tot een 46% iso-osmotisch Percoll oplossing. De Percoll moet bij omgevingstemperatuur voor de bereiding.
  11. Voor elke donor overdracht 25 ml van de bereide Percoll oplossing in een 50 ml buisje en laag het PBMC oplossing bereid 2.9) bovenop de Percoll oplossing. Wees voorzichtig om dit heel langzaam een ​​doend voorzichtig beide lagen de neiging om gemakkelijk mengen. Indien correct gedaan de twee fasen worden onderscheiden door hun verschil in kleur.
  12. Centrifugeer bij 550 xg zonder rem gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
  13. Voor elke gradiënt verzamel de witte ring van monocyten die zich tussen de twee fasen met een plastic Pasteur pipet overgebracht in een 50 ml buis.
  14. Vul elke buis met PBS-EDTA (1 mM) tot 50 ml in totaal.
  15. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min zonder rem bij kamertemperatuur.
  16. Zuig het supernatant en resuspendeer de pellets in 20 ml RPMI-1640 met fenolrood + 10% FCS.

3 differentiatie van monocyten tot macrofagen

  1. Bepaal het aantal geïsoleerde monocyten in een 1:10 verdunning in trypaanblauw. Tellen alleen de grote, vaak onregelmatig gevormde cellen, die monocyten zijn. Reken er maar niet de kleinere, ronde-vormige cellen die lymfocyten.
    NOTE: Monocyt nummers niet al te nauwkeurig bepaald omdat ze alleen een hint over hoeveel en welke FEP Teflon beklede zakken (kleine of grote) moeten worden gebruikt voor de differentiatie van de cellen bevatten.
  2. Voor 1,0-1,5 x 10 8 monocyten ve donor, zaaigoed de cellen in een grote FEP Teflon beklede celkweek bag. Voor elke zak bereiden kweekmedium bestaande uit 174 ml RPMI-1640, 2% humaan AB serum (zoals bereid in paragraaf 1), 1% penicilline / streptomycine, en 2,5 ng / ml M-CSF (totaal volume: 180 ml).
    1. Voor 3,0-5,0 x 10 7 monocyten ve donor, zaaigoed de cellen in een kleine Teflon beklede celkweek bag. Voor elke zak bereiden kweekmedium bestaande uit 28,5 ml RPMI-1640, 2% humaan AB serum (zoals bereid in paragraaf 1), 1% penicilline / streptomycine, en 2,5 ng / ml M-CSF (totaal volume: 30 ml).
      OPMERKING: Als bijvoorbeeld 8,0 x 10 7 monocyten worden verkregen, adviseren wij om ze te zaaien in two kleiner volume zakken 4,0 x 10 7 cellen per. In plaats van M-CSF, monocyten kan ook worden gedifferentieerd granulocyt macrofaag-kolonie stimulerende factor (GM-CSF) en dezelfde concentratie (2,5 ng / ml).
  3. Voeg de celsuspensie (20 ml) op de voorbereide medium en meng voorzichtig. Als twee zakken bereid uit een donor, voeg 20 ml RPMI-1640 aan de celsuspensie en voeg de helft van de suspensie aan elk medium bereiding.
  4. Optioneel: Om te bepalen of monocyt preparaat steriel gebleven, scheur een druppel van de celsuspensie op een bloed agar plaat en incubeer overnacht bij 37 ° C.
  5. Draai het omhulsel van een 50 ml perfusiespuit op de stekker van de FEP Teflon-coating celcultuur zak en vul het met de voorbereide celsuspensie.
  6. Haal de stekker van de spuit en druk de resterende lucht uit de zak. Sluit de zak met een afsluitende kegel.
  7. Incubeer de zakken voor 6-7 dagen bij 3776, C met 5% CO2.

4 Macrophage Harvest

  1. Plaats de FEP Teflon beklede celkweek zakjes gedifferentieerde macrofagen op ijs gedurende ten minste 1 uur tot onthechting van de cellen (een incubatietijd van maximaal 3 uur mogelijk) te vergemakkelijken. Zorg ervoor dat het gehele oppervlak van de zak is bedekt met ijs.
  2. Trek de zak met minimale druk 10x over de rand van een bureau / board.
  3. Desinfecteren voorzichtig de buitenkant van de verpakking en verwijder het sluiten kegel.
  4. Draai een 50 ml spuit op de stekker van de zak, verwijder de celsuspensie, en overbrengen naar 50 ml buizen.
  5. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur verminderde snelheid van de cellen.
  6. Zuig het supernatant en verzamel het pellets ve zak in 10 ml RPMI-1640 + 10% FCS in totaal.
  7. Bepaal het aantal cellen in een hemocytometer (1: 4-1: 10 verdunning in trypan blauw). Tellen alleen de grote ronde cellen.
    OPMERKING: Na differentiatie van macrofagen in de FEP Teflon beklede zakken, kan er residuele cellen bijvoorbeeld lymfocyten, afhankelijk van de donor en de kwaliteit van de monocyt isolatie.
  8. Om de FEP Teflon-coating zakken hergebruiken, was ze twee keer met 70% ethanol om de resterende cellen te verwijderen. Vul ze met 50 ml 70% ethanol en incubeer overnacht. Was de zakken 3x met steriel PBS, wikkel ze in sterilisatie papier, en steriliseren in een autoclaaf met behulp van standaard procedures.
    OPMERKING: De celkweek zakken kunnen meerdere malen hergebruikt worden zonder verlies van macrofagen opbrengsten. Echter, hebben we besloten om de zakken gooi deze na 10 gebruikt voordat ze beginnen te lekken.
  9. Voor vervolgexperimenten cultuur macrofagen in RPMI-1640 + 10% FCS. Als lagere serumconcentraties vereist, cultuur in RPMI-1640 met 1% FCS is ook mogelijk. Zaad en incubeer cellen voor 3-4 uur. Na deze periode mee dat macrofagen hechten aan het oppervlak van de celkweekschaal terwijleventuele contaminerende cellen (bijvoorbeeld erythrocyten, lymfocyten en dendritische cellen) blijven in suspensie. Was de cellen ten minste tweemaal met PBS om niet-hechtende cellen te verwijderen.
  10. Om macrofagen uit de celkweek schotel voor verdere experimenten los voorzichtig afkrabben van het oppervlak. Alternatief incubeer schotels voor 20 min op ijs, zuig het kweekmedium en voeg 1 ml enzymvrije celdissociatiebuffer. Na 5 minuten incubatie bij 37 ° C wordt 4 ml PBS en los cellen door pipetteren en neer ten minste 3 minuten.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De eerste dichtheidsgradiënt centrifugatie met Ficoll levert een witte interfase die de PBMC (figuur 1A) ie lymfocyten en monocyten. Dit kan worden bevestigd door een May-Grünwald kleuring (Figuren 1B en C) van de verzamelde cellen die zowel een hoge kern / cytoplasma-verhouding geeft (typisch lymfocyten) en Bean of ringvormige kernen (typisch monocyten). Wanneer deze cellen vervolgens op een tweede dichtheidsgradiënt middels Percoll geladen, kan de monocyten verder gescheiden van de lymfocyten en opnieuw verschijnen als witte interfase (figuren 1D-F). Per buffy coat beschreven dubbele dichtheid gradiënt centrifugatie routinematig levert 150 ± 40 x 10 6 monocyten die kunnen worden gedifferentieerd tot 70 ± 30 x 10 6 macrofagen (figuur 2) per buffy coat. De gemiddelde opbrengst van macrofaag20 onafhankelijke voorbereidingen was 47 ± 14% van het totaal geïsoleerde monocyten.

Na de Percoll gradiënt centrifugatie kan er nog geringe niet-monocytische cellen aanwezig in het preparaat die afhankelijk is van de bloeddonor en de nauwkeurigheid van het isolatieproces. Na de differentiatie fase van 6-7 dagen, de bereiding bestaat voornamelijk uit rijpe macrofagen (figuur 3) die verder kan worden verrijkt door hun hechting aan kunststof oppervlakken, een eigenschap die niet wordt gedeeld door de random contaminerende cellen (Figuren 4A en B). Eenmaal geplateerd, de meeste macrofagen tonen een klassieke "gebakken ei" morfologie terwijl er ook cellen met een verlengde as fenotype (figuren 4C en D). Dit wordt weerspiegeld door de F-actine distributie binnen het cytoplasma en de hechting clusters. De gedifferentieerde cellenworden gekenmerkt door de expressie van CD45, CD14, CD16, CD206 (mannose receptor), CD11b en CD11c die kenmerkend markers voor rijpe macrofagen (figuur 5) zijn. De aanwezigheid van CD11b pleit tegen een overwegend dendritische differentiatie die wordt ondersteund door het feit dat de cellen negatief voor de dendritische cel marker CD209 (DC-SIGN).

Na het differentiatieproces de cellen blijven functioneel en metabolisch actieve ongeveer 5-7 dagen (figuur 6) als het kan worden gevisualiseerd door calceïne AM kleuring en hun vermogen tot het nemen extracellulaire vesicles werpen van tumorcellen. Bovendien kunnen de cellen nog steeds geactiveerd zoals bijvoorbeeld voor de stimulatie met lipopolysaccharide (LPS) die resulteert in de expressie van verschillende pro-inflammatoire genen (figuur 7).

figure-results-1
Figuur 1 Uiterlijk en samenstelling van de PBMC- en monocyt-laag na verloop dubbele dichtheid centrifugatie.'s Toont (A) de PBMC-band na Ficoll gradiënt en (D) de monocyt-fase na de iso-osmotisch Percoll centrifugatie. May-Grünwald kleuringen van cytospin preparaten van de (B, C) ​​PBMC-fractie en de resterende (E, F) monocyten. Schaal bar = 200 urn B en E = 50 urn C en F.

figure-results-2
Figuur 2 Opbrengst van monocyten en macrofagen. Vertegenwoordiger cel tellingen van geïsoleerde monocyten en macrofagen van 20 buffycoat preparations.

figure-results-3
Figuur 3 Microfoto en celgrootte metingen van monocyten en macrofagen. Fase contrast microscopie van monocytische celsuspensie vóór (A) en na (B) macrofaag differentiatie. Overeenkomstige celgrootte histogrammen van monocyten (C) en macrofagen (D). Schaal bar = 100 urn.

figure-results-4
Figuur 4 morfologie en organisatie van het cytoskelet van hechtende macrofagen. Fasecontrastmicroscopie van hechtende macrofagen vóór (A) en na (B) verwijdering van niet-adherent cellen. (C, D) Phalloidin-TRITC kleuring van filamenteuze actine in hechtende, niet-gestimuleerde macrofagen. Schaal bar = 100 micrometer op AC, 20 pm in D. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5 immunofenotype van gedifferentieerde macrofagen. Flowcytometrieanalyse van macrofagen na 6 dagen van differentiatie in FEP Teflon-coating celcultuur zakken (aangegeven in rood). De overeenkomstige isotypecontroles worden grijs weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6 Opname van tumorcel microvesicles door macrofagen. Micrografen hechtende macrofagen na blootstelling aan PKH26-label (rood fluorescerend) tumor cel afkomstige microvesicles. Beelden worden overlay op de overeenkomstige (A) helderveld of (B) cytosolische kleuring met de levensvatbaarheid kleurstof calceïne AM. Schaalbalken = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7 opregulatie van IL-1 β, Wnt5a, TNFa, IL-6, MMP-2, MMP-7, en MT1-MMP na stining van macrofagen met LPS (100 ng / ml) gedurende 24 uur. Genexpressie werd bepaald door kwantitatieve RT-PCR van totaal RNA monsters (A) en genormaliseerd op HPRT1 en GNB2L1 expressie. De getoonde waarden zijn voudige veranderingen in vergelijking met de onbehandelde controle (gemiddelde ± SD, n = 5, p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). TNFa en IL-6 inductie onder LPS stimulatie werden verder bevestigd door ELISA (B) (gemiddelde ± SD, * p <0,05).

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macrofagen zijn belangrijke effectorcellen van het aangeboren immuunsysteem en belangrijke functies in immunomodulatie antigeenpresentatie en weefselhomeostase geven. Vanwege hun opmerkelijke plasticiteit, zij kunnen reageren op verschillende stimuli veranderingen van het fenotype. Tot dusver veel gegevens over macrofaag polarisatie worden verkregen in het systeem van muizen, hoewel er meldingen blijkt dat slechts ongeveer 50% van macrofaag polarisatie markers direct vertaald wordt uit muizen menselijke 16. Daarom presenteren we hier een methode om primaire humane macrofagen in voldoende aantal en zuiverheid te verkrijgen zonder de noodzaak van dure materialen, bijvoorbeeld MACS magnetische korrels of tegenstroom centrifugale elutriatie apparaat.

Onze werkwijze is gebaseerd op de isolatie van monocyten uit PBMC en de daaropvolgende differentiatie in macrofagen FEP Teflon beklede celkweek zakken in de aanwezigheid van lage concentrations van M-CSF 11-13. Hoewel monocyten vertegenwoordigen minder dan 5 tot 10% van perifeer bloed leukocyten in de mens, na stimuleren zij worden gerekruteerd perifere plaatsen waar ze differentiëren resident weefsel macrofagen of dendritische cellen 17. De cytokine M-CSF is belangrijk voor monocyt overleving en drijft hun differentiatie tot macrofagen 18,19. Tot dusver zijn de M-CSF-concentraties die werden gekozen voor monocyt differentiatie varieerde tot 100 ng / ml, echter in ons protocol kunnen wij voldoende aantallen rijpe macrofagen te verkrijgen met een M-CSF concentratie van slechts 2,5 ng / ml 12 , 20. Daarnaast worden cellen gekweekt in FEP Teflon beklede celkweek zakken die het losmaken van de macrofagen en de daaropvolgende zaaien in bepaalde celaantallen vergemakkelijken. Aangezien de zakken meerdere malen kan worden hergebruikt, dit verder vermindert de kosten voor de isolatie werkwijze.

De door deze procedure macrofagenzijn zeer positief voor CD45, CD14, CD 11, CD 11 c en tonen uitdrukking van de mannose receptor CD206, die pleit voor een bevolking van zuiver, volwassen macrofagen 21,22. Bijzonder hoge CD14 expressie is typisch voor gedifferentieerde macrofagen in de aanwezigheid van M-CSF 23. Na enten van de cellen, tonen zij een snelle hechting aan kunststof oppervlakken met een aantal cellen welke een typische spindel-achtige morfologie, terwijl anderen vertonen een gebakken ei fenotype. Dit is in overeenstemming met de waarnemingen van andere auteurs 18,22,24.

Er werd gemeld dat differentiatie van monocyten in de aanwezigheid van M-CSF leidt tot M2-gepolariseerde macrofagen 16,25. De macrofagen geïsoleerd door ons protocol nog steeds in staat om te reageren op diverse stimuli inclusief blootstelling aan tumorcel afgeleide microvesicles en co-kweek met tumorcellen 26,27 of blootstelling aan LPS waaraan zij reageren met inductie van pro inflammatoire genen zoals IL-1 en# 946 ;, TNFa, Wnt5a, of diverse matrixmetalloproteïnases die typisch worden beschouwd voor het M1-gepolariseerde macrofagen 3,5,28.

Concluderend, de isolatie van monocyten door dubbele dichtheidsgradiënt centrifugatie en daaropvolgende differentiatie tot macrofagen uit FEP Teflon beklede celkweek zakken resulteert in hoge aantallen macrofagen zonder dat technisch moeilijke of dure procedures. De verkregen macrofagen kunnen worden gebruikt voor daaropvolgende analyse van klassiek activatie door LPS op de co-kweek met tumorcellen.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen als er geen belangenconflict bestaat.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen graag mevrouw Meike Schaffrinski bedanken voor haar altijd een uitstekende technische assistentie tijdens de laatste paar jaar.

Dit werk werd gefinancierd door de Duitse Research Council (DFG) binnen de gezamenlijke onderzoeksgroep 942 (FOR942) en door het onderzoeksprogramma van de faculteit Geneeskunde, Georg-August-Universität Göttingen.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies for immunophenotypingBeckman Coulterfor example: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), IgG1-PE isotype control (A07796), IgG1-FITC isotype control (A07795)
BioLegendsfor example: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105)
Axiovert 200M microscopeZeiss
Calcein AMAnaSpec89201
Combi-stopper closing conesBraun4495101
1x PBS, w/o Ca and MgPan biotechP04-36500for PBS-EDTA (1 mM) add 1 ml 0.5 M EDTA per 500 ml PBS
10x PBS, w/o Ca and MgInvitrogen14200-067
EDTA (Titriplex III)Merck1084211000prepare a 0.5 M solution in H2O, use a sterile filter
Cell dissociation buffer (enzyme-free, PBS-based)Gibco13151-014
Fetal calf serum (FCS)Invitrogen10091148heat-inactivated
Ficoll (density 1.077 g/ml)Biochrom AGL6115
FACSCanto IIBD Biosciences
Goat anti-mouse FITCsanta cruzsc-2010
LPS from E.coliSigmaL8274final conc: 100 ng/ml
Multifuge 3 L-RHeraeus
Penicillin/streptomycinBiochrom AGA2213
Percoll (density 1.131 g/ml)GE Healthcare17-0891-02
Perfusor syringe 50 mlBraun8728844F
Phalloidin-TRITCSigmaP1951resuspend in methanol (c = 0.1 mg/ml)
[header]
Plastic disposable Pasteur pipettesLVL technologies2655181
rh M-CSFImmunoTools11343117Resuspend in 500 µl sterile H2O (c = 100 ng/µl), aliquot
RPMI-1640 with phenol redGibco21875-034
RPMI-1640 without phenol redGibco11835-063
Sterilization paperVP group3KFKFS230116
Trypan blue stain (0.4% w/v)SigmaT8154
FEP Teflon-coated cell culture bag, smallCellGenix72-C
FEP Teflon-coated cell culture bag, largeCellGenix197-C

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496, 445-455 (2013).">Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496, 445-455 (2013).
  2. Regulation of Adaptive Immunity by the Innate Immune System. Science. 327, 291-295 (2010).">Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of Adaptive Immunity by the Innate Immune System. Science. 327, 291-295 (2010).
  3. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. J Clin Invest. 122, 787-795 (2012).">Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. J Clin Invest. 122, 787-795 (2012).
  4. CX(3)CR1-dependent renal macrophage survival promotes Candida control and host survival. J Clin Invest. 123 (3), 5035-5051 (2013).">Lionakis, M. S., et al. CX(3)CR1-dependent renal macrophage survival promotes Candida control and host survival. J Clin Invest. 123 (3), 5035-5051 (2013).
  5. The Wingless homolog, WNT5A and its receptor Frizzled-5 regulate inflammatory responses of human mononuclear cells induced by microbial stimulation. Blood. 108, 965-973 (2006).">Blumenthal, A., et al. The Wingless homolog, WNT5A and its receptor Frizzled-5 regulate inflammatory responses of human mononuclear cells induced by microbial stimulation. Blood. 108, 965-973 (2006).
  6. Inflammasome-derived IL-1 beta production induces nitric oxide-mediated resistance to Leishmania. Nat Med. 19, 909-915 (2013).">Lima, D. S., et al. Inflammasome-derived IL-1 beta production induces nitric oxide-mediated resistance to Leishmania. Nat Med. 19, 909-915 (2013).
  7. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. Nat Rev Cancer. 4, 71-78 (2004).">Pollard, J. W. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. Nat Rev Cancer. 4, 71-78 (2004).
  8. Obesity, inflammation, and macrophages. Nestle Nutrition workshop series. Paediatric programme. 63, 151-159 (2009).">Subramanian, V., Ferrante, A. W. Jr Obesity, inflammation, and macrophages. Nestle Nutrition workshop series. Paediatric programme. 63, 151-159 (2009).
  9. Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance. Nat Rev Immunol. 13, 709-721 (2013).">Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance. Nat Rev Immunol. 13, 709-721 (2013).
  10. Hepatic macrophages but not dendritic cells contribute to liver fibrosis by promoting the survival of activated hepatic stellate cells in mice. Hepatology. 58, 1461-1473 (2013).">Pradere, J. P., et al. Hepatic macrophages but not dendritic cells contribute to liver fibrosis by promoting the survival of activated hepatic stellate cells in mice. Hepatology. 58, 1461-1473 (2013).
  11. Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation. J Immunol Methods. 288, 123-134 (2004).">Danciger, J. S., et al. Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation. J Immunol Methods. 288, 123-134 (2004).
  12. Mycobacteria-induced TNF-alpha and IL-10 formation by human macrophages is differentially regulated at the level of mitogen-activated protein kinase activity. J Immunol. 167, 3339-3345 (2001).">Reiling, N., Blumenthal, A., Flad, H. D., Ernst, M., Ehlers, S. Mycobacteria-induced TNF-alpha and IL-10 formation by human macrophages is differentially regulated at the level of mitogen-activated protein kinase activity. J Immunol. 167, 3339-3345 (2001).
  13. Primary Cultures of Human Blood-Borne Macrophages Grown on Hydrophobic Teflon Membranes. J Immunol Methods. 56, 295-304 (1983).">Andreesen, R., Picht, J., Lohr, G. W. Primary Cultures of Human Blood-Borne Macrophages Grown on Hydrophobic Teflon Membranes. J Immunol Methods. 56, 295-304 (1983).
  14. Culture of human bone marrow in the teflon culture bag: identification of the human monoblast. Journal of the Reticuloendothelial Society. 32, 355-369 (1982).">van der Meer, J. W., et al. Culture of human bone marrow in the teflon culture bag: identification of the human monoblast. Journal of the Reticuloendothelial Society. 32, 355-369 (1982).
  15. Characteristics of human monocytes cultured in the Teflon culture bag. Immunology. 47, 617-625 (1982).">van der Meer, J. W., et al. Characteristics of human monocytes cultured in the Teflon culture bag. Immunology. 47, 617-625 (1982).
  16. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression. J Immunol. 177, 7303-7311 (2006).">Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression. J Immunol. 177, 7303-7311 (2006).
  17. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat Rev Immunol. 5, 953-964 (2005).">Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat Rev Immunol. 5, 953-964 (2005).
  18. Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10. Blood. 89, 315-321 (1997).">Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10. Blood. 89, 315-321 (1997).
  19. Survival of Mononuclear Phagocytes Depends on a Lineage-Specific Growth-Factor That the Differentiated Cells Selectively Destroy. Cell. 28, 71-81 (1982).">Tushinski, R. J., et al. Survival of Mononuclear Phagocytes Depends on a Lineage-Specific Growth-Factor That the Differentiated Cells Selectively Destroy. Cell. 28, 71-81 (1982).
  20. Zoledronic acid inhibits macrophage/microglia-assisted breast cancer cell invasion. Oncotarget. 4, 1449-1460 (2013).">Rietkotter, E., et al. Zoledronic acid inhibits macrophage/microglia-assisted breast cancer cell invasion. Oncotarget. 4, 1449-1460 (2013).
  21. Identification of Markers that Distinguish Monocyte-Derived Fibrocytes from Monocytes, Macrophages, and Fibroblasts. Plos One. 4, E7475(2009).">Pilling, D., Fan, T., Huang, D., Kaul, B., Gomer, R. H. Identification of Markers that Distinguish Monocyte-Derived Fibrocytes from Monocytes, Macrophages, and Fibroblasts. Plos One. 4, E7475(2009).
  22. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. Plos One. 7, e42656(2012).">Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. Plos One. 7, e42656(2012).
  23. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am J Pathol. 172, 1112-1126 (2008).">Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am J Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
  24. The generation and properties of human M2-like macrophages: potential candidates for CNS repair? Cell Ther Transplant. 2, (2010).">Chernykh, E. R., et al. The generation and properties of human M2-like macrophages: potential candidates for CNS repair? Cell Ther Transplant. 2, (2010).
  25. Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).">Verreck, F. A., et al. Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).
  26. Wnt 5a signaling is critical for macrophage-induced invasion of breast cancer cell lines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 5454-5459 (2006).">Pukrop, T., et al. Wnt 5a signaling is critical for macrophage-induced invasion of breast cancer cell lines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 5454-5459 (2006).
  27. Macrophages induce invasiveness of epithelial cancer cells via NF-kappa B and JNK. J Immunol. 175, 1197-1205 (2005).">Hagemann, T., et al. Macrophages induce invasiveness of epithelial cancer cells via NF-kappa B and JNK. J Immunol. 175, 1197-1205 (2005).
  28. Wnt5A/CaMKII signaling contributes to the inflammatory response of macrophages and is a target for the antiinflammatory action of activated protein C and interleukin-10. Arterioscl Throm Vas. 28, 504-510 (2008).">Pereira, C., Schaer, D. J., Bachli, E. B., Kurrer, M. O., Schoedon, G. Wnt5A/CaMKII signaling contributes to the inflammatory response of macrophages and is a target for the antiinflammatory action of activated protein C and interleukin-10. Arterioscl Throm Vas. 28, 504-510 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human MonocytesDouble Gradient CentrifugationTeflon coated Cell Culture BagsMacrophage DifferentiationBuffy Coat IsolationPeripheral Blood Mononuclear CellsM CSF StimulationFlow Cytometry AnalysisCell Culture BagsDensity Gradient Centrifugation

Related Articles