Geautomatiseerde analyse van Dynamic Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signalen in reeksen afbeeldingen

Samenvatting

Hier een nieuwe regio van belang analyse protocol gebaseerd op het sorteren van best-fit ellipsen toegewezen aan regio's positief signaal binnen twee-dimensionale time beeld lapse sequenties wordt aangetoond. Dit algoritme kan onderzoekers in staat te stellen volledig kunnen onderzoeken fysiologische Ca ^{2 +-signalen} met een minimale input van de gebruiker en vooringenomenheid.

Samenvatting

Intracellulaire ^{Ca2 +} signalen worden vaak bestudeerd fluorescente ^{Ca2 +} indicator kleurstoffen en microscopische technieken. Echter, kwantitatieve analyse van Ca ^{2 +} beeldgegevens is tijdrovend en onder voorspanning. Geautomatiseerde signaalanalyse algoritmes gebaseerd op de regio van belang (ROI) detectie is geïmplementeerd voor een-dimensionale lijn scan metingen, maar er is geen stroom algoritme dat geoptimaliseerd identificatie en analyse van ROI in twee-dimensionaal beeld sequenties integreert. Hier een algoritme voor snelle acquisitie en analyse van ROI in beeld sequenties wordt beschreven. Het maakt gebruik van ellipsen passen aan lawaai gefilterde signalen om een optimale ROI plaatsing bepalen en berekent Ca ^{2 +-signaal} parameters van amplitude, duur en ruimtelijke spreiding. Dit algoritme werd geïmplementeerd als een vrij beschikbare plugin voor ImageJ (NIH) software. Samen met analyse scripts geschreven voor de open source statistische verwerking software R,Deze aanpak zorgt voor een hoge capaciteit pijpleiding voor het uitvoeren van snelle statistische analyse van de output. De auteurs suggereren dat het gebruik van deze analyse protocol leidt tot een meer volledige en onpartijdige karakterisering van fysiologische ^{Ca2 +-signalen.}

Inleiding

Ca ^{2 +} is een alomtegenwoordige tweede boodschapper signalering molecuul en cytosolische Ca ^{2 +} niveaus zijn sterk gereguleerd. Intracellulaire Ca ^{2 +-signalen} zijn complex en omvatten geïsoleerde transiënten, trillingen en golven propageren ^1-4. Ruimtelijke en tijdelijke besturing van ^{Ca2 +} wordt gedacht fysiologische signaal specificiteit ten grondslag liggen, en derhalve de analyse van ^{Ca2 +} signaal patronen van groot belang voor onderzoekers in meerdere velden ^5.

Ca ^{2 +-indicator} kleurstoffen zoals Fluo-4 en Fura-2 worden gewoonlijk gebruikt om intracellulaire ^{Ca2 +-signalen} meten met fluorescentiemicroscopie ^5-12. Meestal worden tijdelijke Ca ^{2 +-signalen} geëvalueerd als tijdsafhankelijke veranderingen in de gemiddelde fluorescentie binnen een door de gebruiker gedefinieerde gebied of regio van belang (ROI) ^{5,6,13 - 16.} Momenteel handmatige ROI-analyse is zowel tijdrovend en arbeidsintensief inSpannend, want het vereist dat gebruikers veel ROI's te identificeren en uit te voeren repetitieve berekeningen ^17-19. Deze technieken kunnen ook onderhevig zijn aan aanzienlijke fouten van gebruikers, met inbegrip van de invoering van kunstmatige signaal modes en uitsluiting van lage amplitude of diffuse signalen ^18,20.

Geautomatiseerde ROI detectie algoritmen eerder zijn uitgevoerd met verschillende statistische benaderingen optimale ROI plaatsing bepalen, maar over het algemeen beperkt tot de analyse van lijn scan of pseudo-line scans, die analyse beperkt tot een ruimtelijke dimensie tijd ^{17 19-22.} Daarnaast hebben veel bestaande algoritmen niet toereikend zijn om de diversiteit van de Ca ^{2 +} gebeurtenissen release die variëren van periodieke, gelokaliseerde transiënten op teeltmateriaal golven ^23,24 omvatten. Uitgebreide evaluatie van fysiologische Ca ^{2 +-signalen} wordt vaak verder gecompliceerd door de aanwezigheid van aanzienlijke image artifhandelen die verwart signaal om discriminatie ruis in veel experimentele systemen.

Voorheen, een geautomatiseerde ROI algoritme oplossing ^{Ca2 +} signaal transiëntdetectie, uitgevoerd als een plugin voor NIH ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD), werd ontwikkeld en gevalideerd ^25,26. Dit algoritme, genaamd LC_Pro, werd ontworpen om ROI allesomvattende Ca ^{2 +} transiënten signaal in twee-dimensionale time lapse beeld sequenties te identificeren en te analyseren. Hier een praktische experimentele protocol en representatieve demonstratie van een toepassing van het algoritme in varkens coronaire endotheel is voorzien, met extra postprocessing met behulp van de open source statistische verwerking software R bruikbare grafische output te genereren.

Protocol

1. Vessel Dissection en Imaging

1. Oogst weefsel van binnenlandse juveniele varkens zoals beschreven in Martens et al. ^27. Plaats geoogst varkens rechterventrikel in een polydimethylsiloxaan (PDMS) bodem dissectie schotel met HEPES gebufferde fysiologische zoutoplossing (PSS).
   1. Met behulp van een stereomicroscoop, ontleden en verwijderen van een segment van de linker anterieure dalende kransslagader (~ 8 mm lengte, 0,5 mm diameter) van omringende weefsel met behulp van een tang en veer schaar door het verwijderen van het segment vaartuig het omringende hartweefsel lagen. OPMERKING: Zorg ervoor dat de vaatwand niet doorboren.
   2. Plaats een PDMS blok (1 x 0,5 x 0,5 cm) in de dissectie schaal, en gebruik een naald om het vastmaken aan de bodem. Snij een ongeveer 40 micrometer diameter wolfraam draad in twaalf ~ 0,3 cm lengte segmenten, vormen micropins, en plaats deze in de schotel. Behulp van een tang, veilig ene uiteinde van het segment vaartuig naar het blok met een micropin.
   3. Steek kleine lente een schaar in het lumen van het vat, en snijd lengterichting langs een kant van het schip om het volledig te openen. Richt het geopende vat segment met de endotheel omhoog.
   4. Gebruik de resterende micropins de randen van de geopende bloedvatsegment veilig blokkeren zodat het vaartuig vormt een vlakke rechthoek. OPMERKING: Micropin toppen moeten worden gebogen tot 90 ° en ingebracht tot gelijk met het blok oppervlak. Zorg moeten worden genomen om de voorbereiding vat uitrekken zonder overstrekken; uiteindelijke breedte moet worden ~ 1,5 x het starten zonder rek breedte.
   5. Bereid een klein volume (~ 1 ml) van TL 04:00 beladingsoplossing door mengen Fluo-4 AM (10 uM) opgelost in DMSO met pluronic (0,03%) in een HEPES gebufferde PSS (die in mM: 134 NaCl, KCl 6 , 1 MgCl, 10 HEPES, 10 glucose) en plaats het gehele blok in de laad oplossing gedurende ongeveer 40 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
   6. Na het laden, was het blok in HEPES gebufferdPSS gedurende 5-10 minuten.
   7. Monteer het blok op 50-100 um dikke afstandhouders in een dekglaasje onderste kamer met HEPES gebufferd PSS. OPMERKING: Metalen kunnen worden gebruikt als afstandhouders en waarborgen het segment schip naar beneden en de afstandhouders niet raken.
   8. Plaats de ruimte op het podium van een omgekeerde microscoop uitgerust voor confocale beeldvorming en focus op de endotheliale cellaag.
   9. Capture time beeld lapse sequenties van basale relatieve fluorescentie voor ~ 3 min bij 20x vergroting en een beeldsnelheid van ~ 8 beelden per seconde met behulp van beeld confocale sequence acquisitie software.
   10. Na ca. 3 min. opnametijd basale fluorescentie vervangen HEPES gebufferde PSS oplossing met hetzelfde volume (~ 1 ml) van Substantie P (100 pM) opgelost in HEPES gebufferd PSS, en opnemen van een additionele 3 minuten.

2. Geautomatiseerde analyse

1. Render afbeelding sequentie (s) van fluorescente calcium activiteit van confocale acquisitie software als 8 bit, grayscale '. tif'-bestanden zonder schaal informatie.
2. Open ImageJ, klikt u op 'open' in het menu Bestand, en selecteer de juiste reeks beelden in de verkenner om het beeld sequentie (s) in ImageJ bekijken.
3. Bepaal een geschikte ROI diameter met het rechthoekige ROI gereedschap te schatten de bovenste en onderste grenzen van de ruimtelijke spreiding van activiteit in het beeld sequentie (s). OPMERKING: De gemiddelde rechthoekige doorsnede is een geschikte keuze voor ROI diameter.
4. Maak een nieuwe map op de harde schijf, en voeg het beeld sequentie (s) in de map directory.
5. In ImageJ, klikt het venster 'plugins', klik op 'LC_Pro' om de analyse te starten.
6. Voer de waarde diameter ROI en selecteer het filter drempelwaarde (ofwel 0,05 of 0,01).
7. Klik op het selectievakje 'medicamenteuze behandeling' en voer het tijdstip waarden onmiddellijk vóór en na de drug werd toegevoegd (in seconden).
8. Klik op 'ok', envoer de beeldsequentie directory in de file explorer venster.

3. Grafische uitvoer

1. Download R versie 3.0.2 van http://www.r-project.org/ .
2. Open de 32 bits versie van R.
3. Klik op "bestand", vervolgens 'open script' en selecteer de 'traceplot.R' R-script voor het genereren van grafische experimentele rapporten.
4. Installeer het kalibreren, en gplots pakketten door 'pakketten', 'install packages', en het selecteren van de dienstige pakketten.
5. Klik op 'file' en dan 'change directory' commando, en gebruik de Explorer-venster naar de map die overeenkomt met de LC_Pro analyse uitvoer te selecteren.
6. Klik op het script-venster en vervolgens de 'run all' commando om het script uit te voeren.

Resultaten

Een aangepaste algoritme, LC_Pro, werd ontwikkeld en geïmplementeerd om geautomatiseerde analyse van Ca ^{2 +} uitvoeren dynamiek op confocale afbeelding sequenties. Zoals weergegeven in figuur 1, het algoritme gebruikt sequentiële procesmodules A) detecteren en volgen plaatsen dynamische ^{Ca2 +} wijzigen hierboven statistisch (p <0.01) ruis, B) definiëren gebieden van belang (ROI) automatisch actieve plaats centra en C) bereken de gemiddelde fluorescentie-intensiteiten ROI specifiek...

Discussie

Decoderen van complexe Ca ^{2 +-signalen} op cellulair en meercellige niveau strenge experimentele en analytische benaderingen vereisen. Hier wordt een aanpak beschreven waarin tijdsopgeloste beeld confocale sequenties van ^{Ca2 +-afhankelijke} fluorescentie worden onderworpen aan een geautomatiseerde analyse die statistisch relevante ^{Ca2 +} signalen in intacte cellulaire domeinen In het specifieke geval gepresenteerd identificeert en kwantificeert, een slagader segment geïsoleerd van varken ha...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dissectiebakje	Fisher Sci	#08-772-70
Polydimethylsiloxaan (PDMS)	Fisher Sci	#NC9644388	elastomer kit, moet in bakjes worden gegoten
HEPES-gebufferd PSS	Sigma	#H3375-250G	HEPES-zuur
Stereomicroscoop	Nikon Inst.	#MNA42000
Pincet	Fine Science Tools	#11223-20
Verenschaar	Fine Science Tools	15003-08
Wolfraamdraad	Scientific Inst Svcs	#406
Fluo-4 AM	Life Tech.	#F-14201
Pluronic F-127	Life Tech.	#P3000MP
Metalen pinnen	Fine Science Tools	#26002-10
Kamer met glazen bodem			Op maat ontworpen
Spinning disc confocale microscoop	Perkin Elmer	RS-3
ImageJ software			downloaden op: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
LC_Pro plugin voor imageJ			downloaden op: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html
R software			downloaden op: http://www.r-project.org/
R traceplot script			downloaden op: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing