Electrospun Stapel Stellingen van Poly (glycerol-dodecanedioate) voor Engineering zenuwweefsel Van muis embryonale stamcellen

Samenvatting

Synthese en de fabricage van electrospun lange vezels verspreid over een grotere storting gebied via een nieuw ontworpen verzamelaar uit een roman biologisch afbreekbaar polymeer genoemd poly (glycerol-dodecanoaat) (PGD) werd gemeld. De vezels waren in staat de groei van cellen afkomstig van muizen pluripotente stamcellen ondersteunen.

Samenvatting

Voor tissue engineering toepassingen, de bereiding van biologisch afbreekbaar en biocompatibel steigers is het meest wenselijk, maar uitdagende taak. Van de verschillende fabricagemethoden, electrospinning is het meest aantrekkelijk door zijn eenvoud en veelzijdigheid. Daarnaast electrospun nanovezels na te bootsen de omvang van de natuurlijke extracellulaire matrix zorgen voor extra ondersteuning voor de overleving en groei. Deze studie toonde de levensvatbaarheid van de vervaardiging van lange vezels verspreid over een groter stortterrein voor een nieuw biologisch afbreekbaar en biocompatibel polymeer genoemd poly (glycerol-dodecanoaat) (PGD) ¹ met een nieuw ontworpen collector voor electrospinning. PGD ​​vertoont unieke elastische eigenschappen met vergelijkbare mechanische eigenschappen aan zenuwweefsel, dus het is geschikt voor zenuwweefsel technische toepassingen. De synthese en fabricatie set-up voor het maken van vezelige steigermateriaal was eenvoudig, zeer reproduceerbaar, en goedkoop. In biocompatibiliteittesten, kunnen cellen uit muis embryonale stamcellen hechten aan en groeien op de electrospun PGD vezels. Kortom, dit protocol voorzien in een veelzijdige vervaardigingswerkwijze voor het vervaardigen PGD electrospun vezels om de groei van muis embryonale stamcellen afgeleide neurale stam cellen ondersteunen.

Inleiding

Electrospinning is een van de effectieve verwerkingsmethoden micro naar nanometer vezel steigers produceren. Het basisprincipe van electrospinning omvat een Taylor kegel oplossing die bij de opening van de naald wordt vastgehouden door toepassing van hoge spanning tussen de punt van de naald en een geaarde collector. Wanneer de elektrostatische afstoting in de oplossing overwint de oppervlaktespanning, wordt een geladen fluïdumstraal uitgeworpen uit de naald tip, reizen door de lucht met oplosmiddel verdamping, en wordt uiteindelijk afgezet op de geaarde collector. De spuitpomp verschaft een continue stroom van de oplossing die uit de spindop en dus meerdere kopieën van de electrospun vezels kunnen worden vervaardigd binnen een korte tijd. Tijdens het verlaten van de spindop te komen tot de collector, zal de geladen jet ondergaan rekken en zweep volgens een aantal parameters die de viscositeit en oppervlaktespanning van de polymeeroplossing bevatten de elektrostatischc kracht in de oplossing, en de interactie van het externe elektrische veld, enz. ^2.

In het elektrospinproces, een collector fungeert als een geleidend substraat waarbij het micro-naar nanometer vezels kunnen worden afgezet. In deze studie werd een nieuw type vezel collector is ontworpen om vezelmatten verkrijgen met de gewenste afmetingen (lengte x breedte). Traditioneel wordt aluminiumfolie als verzamelaar maar het is moeilijk om de vezels te brengen van het vlakke oppervlak naar het andere substraat. De moeilijkheid van het oogsten van een intacte vezel mat van een traditionele verzamelaar was voornamelijk te wijten aan het feit dat de electrospun vezels hechten sterk aan het oppervlak van de collector's. Daarom pasten we de collector door het vouwen van een stuk aluminiumfolie in een rechthoekige strook en het bevestigen van het loodrecht op een vlakke metalen plaat. De electrospun vezels zijn uitgerekt over het gebied tussen het uiteinde van de strip en de metalen plaat, die gemakkelijk kunnen worden overgedragen naar andere Substrate.

Interesse in thermisch verknoopte elastomeerpolymeren groeit snel vanwege het baanbrekende werk van Robert Langer's groep, die poly (glycerol sebacaat) (PGS), een polyester dat analoog is aan gevulkaniseerd rubber in 2002 ^3. Net als bij PGS geïntroduceerd, hebben we met succes poly (glycerol-dodecanoaat) (PGD) door thermische condensatie van glycerol en dodecaandizuur en toonde haar unieke vormgeheugen eigendom ^1. Unlike stijvere kunststoffen poly (hydroxy butyraat) of poly (L-lactide) (Young's modulus van 250 MPa en 660 MPa, respectievelijk), PGD vertoont elastomere eigenschap rubber, met een Young's modulus van 1,08 MPa bij een temperatuur boven 37 ° C, hetgeen een goede overeenkomst met de in-situ perifere zenuwen (0,45 MPa). Bovendien PGD is biologisch afbreekbaar en degradatietijd kan worden afgestemd door het variëren van de verhouding van glycerol en dodecaandizuur. Dodecaandizuur is een twaalf-carbon subhouding met twee eindstandige carboxylgroepen, HOOC _{(CH2) 10} COOH. Zelfs genummerde dicarbonzuren zoals sebacinezuur en dodecaandizuur kunnen worden gemetaboliseerd tot acetyl-CoA en voer de citroenzuur (TCA) / (citroenzuur) cyclus. De metaboliet van dicarbonzuren, succinyl-CoA, een gluconeogenetic precursor en tussentijdse TCA cyclus ^4. Dus sommige studies gesuggereerd dat ze kunnen worden gebruikt als alternatieve brandstof substraat voor enterale en parenterale voeding, met name in de pathologische omstandigheden. Bovendien PGD vertoont unieke vormgeheugen omdat de glasovergangstemperatuur 31 ° C, waardoor toont verschillende mechanische eigenschappen bij kamertemperatuur en bij lichaamstemperatuur. Kortom, PGD is biologisch afbreekbaar, biocompatibel, vertonen unieke elastische eigenschappen met mechanische eigenschappen vergelijkbaar met zenuwweefsel; Daarom is een geschikt materiaal voor zenuwweefsel technische toepassingen. In dit protocol, de electrospunlange vezels verspreid over een grote storting gebied werden gefabriceerd via de nieuw ontworpen collector van PGD. De vezel steigers kan de groei en differentiatie muis pluripotente stamcellen te ondersteunen.

Protocol

1. Electrospinning Collector Setup

1. Snijd de aluminiumfolie in een rechthoekig stuk.
2. Vouw het rechthoekig stuk in een rechthoekige strook, en bevestig deze loodrecht op een vlakke metalen plaat met tape (Figuur 1). Opmerking: De grootte van de vezelmat afhankelijk van de lengte en breedte van de strook. Zo kan de strook afmetingen aangepast indien nodig.

2. Polymeer Oplossing Voorbereiding

1. Meng glycerol en dodecaandizuur (DDA) in 1:1 molverhouding in een beker bij 120 ° C gedurende 100 uur PGD polymeer te verkrijgen.
2. Los poly (ethyleenoxide) (PEO) en gelatine in 65% ethanol met een gewichtsverhouding van 1.5:3:95.5 in een 15 ml buis, draai de kap en verwarm het mengsel in een oven bij 60 ° C gedurende 1 uur onder roeren tot het een homogene oplossing (Basal oplossing).
3. Voor electrospinning, meng de PGD polymeer en de basale oplossing in 04:06 gewichtsverhouding. Opmerking: PGD concentratie heeft een big effect op glasvezel diameter. 30% -50% procent PGD aanvaardbaar vezels langer dan 5 cm diameter met meer vezels te produceren.
4. Voeg 0,1% riboflavine aan de polymere oplossing en meng.

3. Electrospinning

1. Voer de polymere oplossing in een 5 ml standaard spuit met een 18 G afgestompt roestvrijstalen naald.
2. Plaats de spuit in een injectiepomp.
3. Bevestig de geaarde leiding van een hoog voltage stroombron om de metalen plaat en de positief geladen leiden tot de naald.
4. Stel de afstand tussen de naald en de aluminiumfolie strip 15 cm.
5. Plaats de spuit pomp in een hoek van ongeveer 15 ° met de horizontale aggregatie van de vezels aan de voorzijde van de strip te voorkomen.
6. Schakel de spuitpomp en stel het debiet van de pomp tot 0,6 ml / uur.
7. Schakel de hoogspanning voedingsbron en zet de werkspanning tot 14,6 kV.

4.Vezelverwerking

1. Nadat het verzamelen is voltooid, bloot de vezel mat aan UV-licht gedurende 60 min voor cross-linking.
2. Breng de vezel mat van de aluminiumfolie strip om een ​​100 mm petrischaal en bloot aan UV-licht voor nog eens 20 minuten voor sterilisatie.
3. In een bioveiligheid kast, snijd de vezel mat in ronde stukken van dezelfde grootte met een chirurgisch mes en leg de stukken in een 24-well plaat.
4. Voor cellen pre-seeding behandeling onderdompelen vezelmonsters in 1 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en incubeer bij 37 ° C geïncubeerd.
5. Op de volgende dag, aspireren PBS voorzichtig, voeg 1 ml van differentiatie medium (DMEM/F12, N2, en FGF2) (zie recept in Materials tabel) aan elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 3 uur.
6. Zuig differentiatiemedium voorzichtig, voeg 0,2 ml Matrigel elke vezel monster en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Opmerking: laminine kan ook worden gebruikt voor vezels coating. Voeg 0,2 ml van 20 ug / ml lamininede vezel en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 uur.
7. Verwijder overtollig matrigel zorgvuldig uit elk putje. Spoelen met 2 ml van differentiatie medium eenmaal. Opmerking: De vezel monsters zijn klaar voor celkweek.

5. Cel zaaien op Fibers

1. Voeg 1 ml van Accutase de MES celkweekschaal en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
2. Na 10 min worden de MES cellen losgemaakt van de kweekschaal. Voeg 4 ml differentiatiemedium aan de plaat. Verzamel de drijvende MES cellen in een 15 ml buis en pipet cellen op en neer om kolonies (ongeveer 15x) breken.
3. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer cellen in 4 ml differentiatiemedium.
4. Tel de cellen met een hemocytometer. Breng 200 pi van de celsuspensie in een 15 ml buis en verdunnen 10x met differentiatiemedium. Transfer 15 pi van de verdunde celsuspensie om een ​​kamer op de hemocytometer met een cover-slip op zijn plaats. Tellende cellen in de 1 mm midden plein en de vier hoeken vierkantjes van de hemocytometer onder de microscoop. Opmerking: Mobiele per ml = het gemiddelde aantal per vierkante x de verdunningsfactor x 10 ⁴
5. Plaats ongeveer 5 x 10 ⁴ MES cellen op elk putje. Langzaam vallen de celsuspensie op het midden van de vezel monsters, in plaats van glijden aan de zijkant van de put, om de oplossing te voorkomen aftappen van de vezelmat.
6. Voeg 1 ml differentiatiemedium aan elk putje, en houdt de plaat in een incubator bij 37 ° C en 5% CO ₂ cellen hechting, groei en differentiatie mogelijk.
7. Zuig het oude medium uit elk putje en vervangen door 1 ml verse differentiatie medium elke andere dag.

6. Levensvatbaarheid van de cellen

1. Zuig het oude medium uit elk putje.
2. Meng 1/10 ^ste hoeveelheid Resazurin fluorescentie reagens met kweekmedium en voeg 1 ml in elk putje.
3. Incubaten bij 37 ° C en 5% CO ₂ voor 4 uur, beschermd tegen direct licht.
4. Na 4 uur, overdracht 100 ul 3x van het reagens uit elk putje van een 96-well plaat, en vervolgens de monsters zijn klaar om te worden gemeten op een fluorescentie spectrofotometer met behulp van 560EX nm/590EM filter instellingen.

7. Real Time PCR

1. Na 14 dagen kweken voeg lysisbuffer de monsters en isoleren totaal RNA uit de cellen op de vezelmonsters.
2. Gebruik 4 pi totaal RNA in cDNA synthetiseren in 20 ul reactie schalen door reverse transcriptie.
3. Maak de PCR mengsel in beide optische buis: 10 pi Master Mix (2x), 0,2 pl kleurstof, 8 pi Nuclease-vrij water, 1 ui cDNA, en 1 pi primer (Primers die in deze studie worden in Tabel 1).
4. Het opzetten van de PCR-programma: een. 95 ° C 2:20 min, 1 cyclus b. 95 ° C 3 sec → 60 ° C 1 min, 40 cyclus c. 95 ° C 15 sec, 1 cyclus d. 60 ° C 1min, 1 cyclus e. 95 ° C 15 seconden, 1 cyclus. Kies vergelijkende _CT methode om relatieve genexpressie te bepalen.
5. Na PCR is voltooid, analyseert de real-time PCR resultaten StepOne software en de resultaten exporteren naar Excel.

Resultaten

De belangrijkste componenten van de electrospinning worden getoond in Figuur 1. Een groot formaat vezelmat werd meestal verkregen via loodrecht bijgevoegde aluminiumfolie strippen en een vlakke metalen plaat. Figuur 2 toont het ontwerp en de collector electrospinning vezelmat. De breedte en lengte kan worden aangepast voor verschillende toepassingen. De lengte van de vezel die met PGD polymeer en basale oplossing mengsel wordt tot 10 cm. De morfologie van electrospun vezels wordt getoon...

Discussie

De beperkingen van collectoren of de complexiteit van roterende verzamelaars die momenteel worden gebruikt voor elektrospinning verhogen de beperking van het verkrijgen van de gewenste lengte en grootte vezelmat voor sommige toepassingen. Bovendien, het overbrengen van vezels van de grond collector naar de cultuur schotel of andere substraten is een uitdaging ^5. In dit verslag, een nieuw ontworpen verzamelaar eenvoudig gemaakt door het aanbrengen van een aluminium foliebaan de geaarde collector, kon vergroot ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
Dodecanedioic acid	Sigma-Aldrich	D1009
Gelatin	Sigma-Aldrich	D1890
Poly(ethylene oxide) (PEO)	Sigma-Aldrich	182028
Riboflavin	Sigma-Aldrich	132350250	0,10%
Mouse embryonic stem cells	GlobalStem	GSC-5002
Matrigel	Becton Dickinson	356234
DMEM/F12	Thermo Scientific	SH30272.02
N2 supplement	Invitrogen	17502048	1%
FGF2	Stemgent	03-0002	10 ng/ml
Accutase	Invitrogen	A11105-01
Phosphate buffered saline (PBS)	Invitrogen	10010-031
Resazurin fluorescence dye	Sigma-Aldrich	62758-13-8
SV Total RNA Isolation System	Promega	Z3100
GoScript Reverse Transcription System	Promega	A5000
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6001
Syringe pump	Fisher scientific	14-831-200
High voltage power source	Spellman High Voltage Electronics Corporation		SL30
UV light	Philips	308643	15W/G15T8
Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader	BioTek
Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600	Perkin Elmer	8488
StepOne Real-time PCR System	Applied Biosystems	4376357