Reverse Genetische Morfolino benadering met behulp van de cardiale ventriculaire Injection naar meerdere Moeilijk-to-target weefsels in de zebravis Larve Transfecteren

Samenvatting

Een flexibel omgekeerde genetische methode voor zebravis over gen-functie te beoordelen tijdens de latere stadia van ontwikkeling en fysiologische homeostase zoals weefselregeneratie behulp intraventriculaire injecties van gen-specifieke morpholinos.

Samenvatting

De zebravis is een belangrijk model voor de cel-en moleculaire biologie van orgaan-en aanhangsel regeneratie begrijpen. Echter, moleculaire strategieën reverse genetics dienst nog niet voldoende ontwikkeld om genfunctie in regeneratie of weefsel homeostase in larvale stadia na de zebravis embryogenese beoordelen en verscheidene weefsels in het zebravis larven zijn moeilijk te richten. Intraventriculaire injectie van genspecifieke morfolino een alternatieve werkwijze voor de huidige onmogelijkheid om genomisch doel zebravis genen in een tijdelijk geregelde wijze naar deze fasen. Deze methode zorgt voor volledige dispersie en daaropvolgende verwerking van de morfolino in verschillende weefsels in het lichaam, waaronder structuren die voorheen onmogelijk te bereiken als die in de larvale staartvin een structuur vaak gebruikt om niet-invasief onderzoek weefselregeneratie waren. Verschillende genen tijdens de larvale finfold regeneratie geactiveerd worden ook presentatiet in regenererende volwassen gewervelde weefsels, zodat de larve is een bruikbaar model voor regeneratie begrijpen bij volwassenen. Deze morfolino dispersie methode maakt een snelle en gemakkelijke identificatie van genen die vereist zijn voor de regeneratie van larvale weefsels en andere fysiologische verschijnselen reguleren weefsel homeostase na embryogenese. Daarom deze levering methode een nog nodig strategie voor tijdelijke controle van de evaluatie van genfunctie na embryogenese.

Inleiding

Regeneratie van organen en appendages is van fundamenteel belang voor de overleving en fitness; hebben echter een aantal gewervelde dieren, inclusief de mens regeneratieve vermogens beperkt. Terwijl verschillende diermodellen bestaan ​​die uitgebreide regeneratieve capaciteit hebben, omgekeerde genetische technieken om gen-functie te beoordelen tijdens orgel en aanhangsel regeneratie blijven zeer beperkt of niet aanwezig. Daarom zijn nieuwe benaderingen nodig om de moleculaire biologie van regeneratie ontleden in deze modelorganismen.

De zebravis is een goed uitgewerkt model voor het begrijpen van de cellulaire en moleculaire biologie van orgaan-en aanhangsel regeneratie ^1, niet alleen vanwege de belangrijke mogelijkheid om meerdere organen, weefsels en appendages regenereren, maar ook omdat een aantal transgene vis lijnen bestaan ​​om cellen te volgen en Gene overexpressie constructen ^{2, 3.} Echter remming gen larvale zebravis grotendeels beperkt tot de overexpression van dominant-negatieve constructen, die niet voor alle genen van belang of waarvan transgen product gain-of-function effecten die niet weergeven endogene activiteit van het gen te verwerven. Aldus wordt een alternatieve methode om specifiek verwijderen genexpressie door knockout of knockdown nodig om deze problemen te overwinnen.

Gen-specifieke sturing met TALENS bestaat als een reverse genetische middel om genfunctie knockout; Maar dit knockout strategie is zeer vaak beperkt tot functionele evaluaties tijdens vroege embryogenese omdat basisvereisten van het gen voorkomen verdere progressie van de embryonale ontwikkeling. Zo bestuderen later verschijnselen zoals regeneratie of orgaan homeostase na ontwikkeling met behulp van TALENS uitgesloten ^{4, 5.} Daarom is een alternatieve strategie voor de verwijdering gen nodig die genfunctie richt na de vroege ontwikkeling gen eisen volledig gevormd organen en structuren beoordelen.

Morfolino injectie is effectief gebleken in het richten genen in een aantal volwassen organen en de volwassen regenereren vin ^6-8 zijn, maar deze methoden elektroporatie en vele interne organen zijn moeilijk te electroporate hetzij als gevolg van hun locatie of vanwege hun gevoeligheid voor elektrische verstoring. Bovendien zijn sommige weefsels in de larve zijn moeilijk direct te injecteren, omdat directe injectie de structurele integriteit kan verstoren of omdat hun omvang is beperkt. De staartvin van de larve is een dergelijke structuur, omdat directe injectie in de finfold niet mogelijk. Dus een alternatief voor elektroporatie en directe injectie noodzakelijk om genen te richten in weefsels die ofwel te klein om te injecteren of kan niet worden geëlektroporeerd.

Om richten en remmen de functie van specifieke genen tijdens de regeneratie van de larvale staartvin, hebben wij bestaande technologieën morfolino gemodificeerd zodat het eenEOORDELING van gen-functie tijdens staartvin regeneratie in late-geënsceneerde larve. Deze methode maakt gebruik van intraventriculaire aflevering ⁹ van fluoresceïne-gelabeld morpholinos samen met Endo-Porter transfectiereagens ^10. Eenmaal in het ventrikel, de morfolino-Endo-Porter mengsel verspreidt zich snel gedurende de larve via de vasculatuur en gaat weefsels die voorheen onmogelijk te richten zijn. Deze injectie werkwijze kan worden gemodificeerd om genen te richten op specifieke weefsels en mogelijk kan ook in diermodellen die nog onvoldoende omgekeerde genetische methoden om genfunctie te remmen worden toegepast. Zo, het biedt een snelle en eenvoudige methode met het potentieel voor brede waaier gebruik onmiddellijk te bestuderen gen-functie tijdens algemene orgel homeostase en regeneratie bij larvale stadia.

Protocol

1. Voorbereiding van de Glass Naalden (figuur 1)

1. Gebruik glazen capillairen met een 0,75 mm diameter injectienaalden (Figuur 1A) te bereiden.
2. Plaats de glazen capillair in een naald trekker en trek de naald met de volgende parameter: verwarming cyclus waarde: 463; trekken cyclus waarde: 230; snelheid: 150 msec; tijd: 150 msec (Figuur 1B).
3. Breek het getrokken glas capillair met horlogemaker pincet om een ​​20 micrometer diameter naald produceren onder een stereoscoop met een micrometer oculair.
4. Gebruik een draaibank met een natgemaakte rubber spinnewiel om de naald te scherpen en produceren een 20 urn afschuining (figuren 1C en 1D). Opmerking: Sharp, schuine naalden verbeteren het gemak van inbrengen in de hartkamer en daarmee het minimaliseren van de schade aan het weefsel en laat de geperforeerde spier sluit na verwijdering van de naald (fig. 1E-G).

2. Preparatie van de morfolino oplossing

1. Bereid de morfolino voorraad door oplossen van het gelyofiliseerde morfolino in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) tot een eindconcentratie van 7,5 mM. [Zie de instructies van de fabrikant voor meer informatie (Materialen tabel)].
2. Bereid de morfolino injectieoplossing door menging 2,5 ul morfolino voorraadoplossing (7,5 mM) 2,8 pl Endo-Porter voorraadoplossing (1 mM) (zie Materialen tabel) voor een uiteindelijke concentratie van 3,5 mM en 0,5 mM morfolino Endo-Porter.

3. Bereiding van de morfolino injectie (figuur 2)

1. Laad de schuine glazen naald met 5 ul van deze oplossing met behulp van een micropipet met een 10 ul microloader pipet tip.
2. Plaats de glazen naald in de naald houder van de micromanipulator verbonden met de pneumatische pico pomp (Figuren 2A-C).
3. Plaats de naald houder naast de microscoop zodat de naald alleen behoeftenin een vlakke richting te verplaatsen om het in de ventrikel van de larve (Figuur 2A).
4. Pas de hoek van de injecties rond de 45 °.
5. Stel de microinjector waarden als volgt: hold druk: £ 20 per vierkante inch (psi); uitwerpen druk: 15 psi; 100 msec bereik van gating, periode-waarde van 1,9 (komt overeen met 10,9 msec).
6. Smelt agarose in 1x PBS met een standaard magnetron tot 20 ml van een 1,5% (w / v) gel produceren. Giet gesmolten gel in een 10 cm Petrischaal. Plaats een gegroefde injectie vorm in de warme agarose zodat eenmaal verhard, zal de agarose groeven waarin de gesedeerd larve ¹¹ (figuren 2D en 2E) zal worden geplaatst hebben.

4. Injecties (figuur 3)

1. Verdoven larve in 100 ml aquarium water met 20 mg / L tricaïne (L-Ethyl-m-amino-benzoaat-methaansulfonaat) tot ze niet meer reageert op aanraking.
2. Gebruik een plastic Pasteur pipette om de verdoofd larve voorzichtig over in een groef van de natte agarose mal zodat de buikzijde is gericht tegen de verticale agarose wand van de groef (figuur 3A).
3. Plaats de agarose plaat onder de stereomicroscoop zodat het ventrikel niet gericht is op de injectienaald (figuur 3A).
4. Zet de naald om te plaatsen in de hartkamer. Steek de naald slechts 1-2 micrometer in het ventrikel het verzorgen van de naald te diep (Figuren 3B en 3C) niet in te voegen.
5. Zodra de naald wordt ingebracht, injecteer de morfolino oplossing in het ventrikel met 4-6 pulsen, leveren elk 3 nl van de oplossing, met wachten intervallen tot vereffening van het hart (figuren 3D en 3E) mogelijk te maken.
6. Na injectie, verwijder de naald (evenwijdig aan het vlak van insertion) en vervolgens de larve zorgvuldig over te dragen met behulp van een plastic Pasteur pipet gevuld met E3 medium back in een petrischaal met vers medium E3.
7. Plaats de naald in een petrischaal met 1x PBS om het drogen van de naald bij het overbrengen van de geïnjecteerde larve voorkomen.
8. Herhaal stap 4.1-4.6 elke 12-24 uur gedurende de duur van het experiment. Opmerking: Herhaling van de injecties zorgt de opname en het onderhoud van de morfolino in cellen.

5. Analyses van injecties (figuur 4)

1. Verdoven van de vissen in 100 ml aquarium water met 20 mg / L tricaïne totdat ze niet meer reageert op aanraking.
2. Plaats de larve lateraal op een vlakke natte 1,5% (w / v) agarose plaat bedekt met E3 medium.
3. Afbeelding larven met behulp van een stereomicroscoop met helderveld en fluorescentie beeldvorming. Opmerking: Als de larven transparant dient de fluoresceïne gelabeld morfolino zichtbaar fluorescent groen in het bloedvat door het dier direct na injectie. Deze fluorescentie zal verder verspreiden in de gevasculariseerde weefsels door15 min (Figuren 4A-4C).

6. Beoordeling van Regeneratieve uitgroei

1. Beoordelen gemaakte opnamen met behulp van Fiji Afbeelding J vrije software (http://fiji.sc/Fiji). Voor het onderzoeken van de regeneratie, gebruik maken van de lijn tracing tool om het bedrag van regeneratieve groei die heeft plaatsgevonden op de controle en-morfolino geïnjecteerd larve bepalen.
2. Om afbeeldingen te kalibreren, opent een van de originele beeldbestanden in Fiji door te slepen en het bestand in de belangrijkste Fiji venster.
3. Om de schaal voor alle volgende beelden ingesteld, gaat u naar "Analyze" in het hoofdmenu.
4. In het drop-down menu, klik op "Set schaal".
5. In dit venster, zet de 'Global' optie door te klikken op het vakje.
6. Open nu de afbeelding om het bedrag van de regeneratieve groei weer meten met slepen en neerzetten (zie stap 6.1).
7. Kies de "vrije hand selecties" tool in de werkbalk.
8. Omcirkel het gebied dat moet worden gemeten (Figuren 4J-4L).
9. Druk op Ctrl + M. Dit zal een nieuw venster "resultaten" van de waarde van het omcirkelde gebied in vierkante pixels openen.

Resultaten

De scherpe, schuine injectienaald wordt gemakkelijk geplaatst in de cardiale ventrikel van de zebravis larve wanneer dorsally benaderd (figuur 3A). Het hart blijft pompen en de bloedstroom wordt gehandhaafd ondanks de aanwezigheid van de naald (Figuren 3B en 3C). Voorzichtig injecties niet de morfologie van de hartkamer of cardiale samentrekkingen (figuur 3D) ondanks de injectie van morfolino naar het hart (Figuur 3E) verstoren.

Discussie

De intraventriculaire injectie zorgt voor een snelle en betrouwbare beoordeling methode voor het testen van gen-functie in latere stadia van ontwikkeling of van het lichaam homeostase zonder dat de functie van een gen tijdens de embryogenese. Om het succes van deze techniek te waarborgen, moet men zich bewust zijn van de vier kritische punten: 1) met nld, 2) uitdrogen van de naald, 3) een minimaal volume en 4) minimale blootstelling tijd in de sedatie oplossing. Naalden die te klein zijn zal vaak verstoppen, terwijl de ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Morpholino met 3´fluoresceine label	Gene Tools Inc.	Aangepast	Meer informatie op www.gene-tools.com
Endo-Porter	Gene Tools Inc.		Meer informatie op www.gene-tools.com
Agarose	Serva	120623	Voor het gieten van platen om de vissen tijdens injecties en beeldvorming te plaatsen
Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzeëzuur-methaan sulfonaat)	Applichem		Voor anesthesie
E3 medium (5 mM NaCl; 0,17 mM KCl; 0,33 mM CaCl2; 0,33 mM MgSO4)			Voor larvale veehouderij
Petri-schalen	Sarstedt	821.472	Voor het plaatsen van de vissen tijdens injecties en beeldvorming
Dunwandige glazen capillaire buisjes	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-3	Voor het maken van injectienaalden
Microloader pipettentips	Eppendorf	5.242.956.003	Voor het laden van de naald
Pasteur Pipetten (3 ml/1 ml)	Brand	747760/ 74775	Voor het overbrengen van larven
Flaming/Brown naaldtrekker	Sutter		Meer informatie op www.sutter.com
Horlogemaker (Dumont) Pincetten (maat 5)	World Precision Instruments, Inc.	501985	Om de naald te breken voor het slijpen
Dissectiemicroscoop	Olympus, Leica, Zeiss	Varieert per fabrikant	Onderdeel van de volledige injectieopstelling
Fluorescentiecamera	Olympus, Leica, Zeiss	Varieert per fabrikant	Om de fluorescentie na injectie te beeldvormen
PicoNozzle kit (microinjectorhouder)	World Precision Instruments	5430-12	Voor micro-injecties
Pneumatische PicoPump (micro-injector)	World Precision Instruments	SYS-PV820	Voor micro-injecties