Ontwikkeling van Amelogenine-chitosan Hydrogel voor<em&gt; In Vitro</em&gt; Emaille Hergroei met een dichte Interface

Samenvatting

In dit artikel beschrijven we een protocol voor het vervaardigen van een amelogenin-chitosan hydrogel voor oppervlakkige glazuur wederopbouw. Georganiseerd in situ groei van apatiet kristallen in de hydrogel gevormd een dicht email restauratie-interface, die de doeltreffendheid en duurzaamheid van restauraties verbeteren.

Samenvatting

Biomimetische glazuurreconstructie is een belangrijk onderwerp in de materiaalkunde en tandheelkunde als een nieuwe aanpak voor de behandeling van tandbederf of erosie. Amelogenine is bewezen als een kritiek eiwit voor het controleren van de georganiseerde groei van apatietkristallen. In dit artikel presenteren we een gedetailleerd protocol voor oppervlakkige glazuurreconstructie door het gebruik van een nieuwe amelogenine-chitosan hydrogel. In vergelijking met andere conventionele behandelingen, zoals topische fluoride en mondwater, heeft deze methode niet alleen het potentieel om de ontwikkeling van tandbederf te voorkomen, maar bevordert ook significante en duurzame glazuurrestauratie. De georganiseerde glazuurachtige microstructuur gereguleerd door amelogenine-assemblages kan de mechanische eigenschappen van geëtst glazuur aanzienlijk verbeteren, terwijl de dichte glazuurrestauratie-interface gevormd door een in situ hergroei van apatietkristallen de effectiviteit en duurzaamheid van restauraties kan verbeteren. Verder is chitosan-hydrogel gemakkelijk te gebruiken en kan bacteriële infectie onderdrukken, wat de belangrijkste risicofactor is voor het optreden van tandbederf. Daarom toont deze biocompatibele en biologisch afbreekbare amelogenine-chitosan hydrogel belofte als een biomateriaal voor de preventie, restauratie en behandeling van defect glazuur.

Inleiding

Tandglazuur is het harde gemineraliseerde oppervlak van menselijke tanden. Het bestaat uit talrijke naaldachtige apatietkristallen, die zijn gebundeld in georganiseerde, parallelle prisma's om de unieke mechanische sterkte en biologische bescherming die glazuur biedt te garanderen^1-2. In tegenstelling tot andere gemineraliseerde weefsels, zoals bot en dentine, is volwassen glazuur acellulair en kan het zichzelf niet regenereren na aanzienlijk mineraalverlies^1-2, wat vaak optreedt als cariës of erosie. Commercieel verkrijgbare producten zoals fluoridebevattende vernis, tandpasta's en mondwater zijn effectief in het remineraliseren van glazuur, maar geen van hen heeft het potentieel om de vorming van georganiseerde apatietkristallen te bevorderen. Klinisch gezien omvat de conventionele behandeling voor glazuurreparatie een vulprocedure met kunstmatige materialen zoals amalgaam, keramiek of composiethars ³. Deze materialen sluiten echter meestal niet goed aan op het natuurlijke weefsel rond de laesie, omdat hun structuren, componenten en eigenschappen verschillen van het natuurlijke glazuur. Als gevolg hiervan ontwikkelt zich vaak na verloop van tijd secundaire cariës op de grens tussen de tand en vreemde materialen. Daarom is in situ hergroei van glazuur met een dichte interface een aantrekkelijk doelwit voor de vakgebieden materiaalwetenschap en stomatologie. Een bijzonder veelbelovende manier om dit doel te bereiken is de biomimetische synthese van glazuur-achtig materiaal op het glazuuroppervlak. Onlangs zijn er talrijke in vitro pogingen gedaan om glazuurachtige materialen te bereiden met behulp van biomimetische systemen die nano-apatieten of verschillende organische additieven bevatten ^4-12. Het ontwikkelen van de optimale biomimetische strategie om remineralisatiekristallen te bevorderen om een perfect dichte interface te bereiken, is echter nog steeds een uitdaging.

Tijdens de glazuurmineralisatie wordt de georiënteerde groei en verlenging van apatietkristallen gereguleerd door een amelogeninerijke matrix ^1,13-14. Om de organische matrix in zich ontwikkelend glazuur na te bootsen, beschrijven we hier een gedetailleerd protocol voor het fabriceren van een amelogenine-chitosan (CS-AMEL) hydrogel voor in situ glazuurhergroei op een zuurgeëtst glazuuroppervlak dat als model wordt gebruikt voor erosieve laesies. Als "het meest veelzijdige groeimedium" voor kristallen ¹⁵ hebben hydrogelmatrices een voordeel boven een oplossingssysteem, aangezien ze klinisch gemakkelijker te hanteren zijn. Bovendien is CS-AMEL biocompatibel, biologisch afbreekbaar en heeft het unieke antimicrobiële en hechteigenschappen die gunstig vergelijkbaar zijn met andere biomimetische systemen voor tandheelkundige toepassingen ¹⁶. Belangrijk is dat de in situ mineralisatie van apatietkristallen op het glazuuroppervlak een dichte interface biedt tussen de gerepareerde laag en het natuurlijke glazuur, wat mogelijk de duurzaamheid van restauraties kan verbeteren en de vorming van nieuwe cariës aan de rand van de restauratie kan voorkomen.

Protocol

Het menselijk molaren werden geëxtraheerd volgens de standaardprocedures voor afzuiging aan de Ostrow School voor Tandheelkunde van de Universiteit van Zuid-Californië en behandeld met goedkeuring van de Institutional Review Board.

1. Voorbereiding van geëtst Tooth Slice

1. Selecteer een mens derde kies zonder hersteld cariës.
2. Verwijder het basisgedeelte van de molaire en snijd de kroon van de molaire langsrichting in plakjes 2 mm dikte met een watergekoelde lage snelheid diamantzaag. Ultrasoon reinigen van deze schijfjes gedurende 2 minuten en spoel ze met gedemineraliseerd water 3 keer.
3. Erosieve laesies simuleren, etsen de tand plakjes met 30% fosforzuur gedurende 30 seconden dan ze onmiddellijk spoelen met gedemineraliseerd water.
4. Ultrasoon reinigen van de geëtst plakjes gedurende 2 minuten en spoel ze met gedemineraliseerd water 3 keer.

2. Bereiding van Amelogenine-chitosan Hydrogel

1. Preparation van chitosan stockoplossing
   1. Los 1% (w / v) chitosan (gemiddeld molecuulgewicht, 75-85% gedeacetyleerd) in 1% (v / v) azijnzuur oplossing, gevolgd door roeren bij 80 ° CO / N.
   2. Na afkoelen van de oplossing tot kamertemperatuur, filtreer de chitosanoplossing met een 0,45 pm filter. Stel de pH-waarde van 5,0 door toevoeging van 1 M NaOH-oplossing.
2. Bereiding van calcium en fosfaat stockoplossing (0,1 M)
   1. Weeg calciumchloride _(CaCl2) en stelt een 0,1 M oplossing, meng met een vortex totdat de oplossing helder is. Stel de pH tot 11 door toevoeging van 1 M NaOH-oplossing.
   2. Weeg dibasisch natriumfosfaat (Na ₂ HPO ₄₎ en stelt een 0,1 M oplossing, meng met een vortex totdat de oplossing helder is.
3. Expressie en zuivering van recombinant amelogenin ^17-18
   Het recombinante volledige lengte varkens amelogenin (rP172) hier gebruikt heeft 172 aminozuren en is een analoog van volledigeLengte natieve P173 varkens, maar niet de N-terminale methionine en een fosfaatgroep op Ser16 ^18.
   1. Voeg 20 g lysogenie bouillon (LB) agar poeder in 500 ml gedeïoniseerd water, autoclaveren de oplossing bij 121 ° C (vloeibaar instelling) gedurende 20 minuten. Laat agar afkoelen tot ~ 55 ° C, voeg ampicilline (100 ug / ml) in agaroplossing.
   2. Breng de agar oplossing voor petrischaaltjes, laat elke plaat afkoelen tot hij is solide, dan flip om condensvorming aan de agar te voorkomen. WINKEL platen in plastic zakken bij 4 ° C.
   3. Streak de LB-agar plaat met recombinante cellen (E.coli-BC21) uit de glycerol voorraad (-80 ° C). Incubeer de platen O / N bij 37 ° C.
   4. Bereid 50 ml NZCYM media en media autoclaaf bij 121 ° C gedurende 30 minuten. Laat het materiaal afkoelen, voeg 50 ul van 100 ug / ml ampicilline aan de 50 ml media.
   5. Inoculeren een enkele kolonie van de LB-agar plaat in de 50ml NZCYM media aangevuld met ampicillIncubeer de cellen in O / N in een schudincubator bij 37 ° C.
   6. Bereid 1 liter autoclaaf NZCYM media en media bij 121 ° C gedurende 30 minuten. Voeg 1 ml van 100 mg / ml ampicilline aan 1000 ml media. Neem een ​​optische dichtheid (OD) lezen als een leeg met behulp van een UV-Vis spectrofotometer. OPMERKING: Gebruik dit niet weg na de eerste lezing.
   7. Inoculeren 10 ml van de celkweek uit stap 2.3.5 tot 1000 ml media uit stap 2.3.6. Lees de optische dichtheid bij 595 nm onmiddellijk na inoculatie. Neem de optische dichtheid lezen periodiek bij te houden van de groei te houden. OPMERKING: Lees de lege elke keer de OD wordt genomen.
   8. Veroorzaken met 700 pl isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG, 1M) wanneer de bacteriële groei reikt tot ongeveer 0,75 ~ 0,8 OD bij 595 nm.
   9. Oogst de cellen wanneer de OD bereikt 1.1. Giet de inhoud van de kolf tot 6 plastic flessen. Evenwicht te brengen en wegen van de flessen voordat u de centrifuge. Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 8554 xg bij 4 ° C.Houd de celpellet in het -20 ° CO / N.
   10. Haal de cel pellets en combineer ze in een 50 ml buis. Voeg 3,5 ml 4M Guanidine HCl per L van de gisting. Sonicaat 2-3 keer op het ijs, 30 seconden per keer, met 1 min. intervallen.
   11. Maak 6x verdunningen van cell volume met 0,5% mierenzuur en laat het roer in de koude kamer voor 2 uur. Centrifugeer gedurende 30 min, 8554 xg bij 4 ° C. Houd de bovenstaande vloeistof. Voeg 20% ​​verzadigd ammoniumsulfaat behulp van de verzadigde stock-oplossing en beroering in de koude kamer, O / N.
   12. Centrifugeer gedurende 30 min, 8554 xg bij 4 ° C en houd de pellet. Reconstitueer de pellets in 0,1% trifluorazijnzuur (TFA), lading op een C4-kolom (10 x 250 mm, 5 pm) en fractioneren met een lineaire gradiënt van A = 0,1% TFA en B = 60% acetonitril in TFA bij een debiet van 1,5 ml · min ^-1.
   13. Bevries de eiwit-oplossing op droog ijs en lyofiliseren het bevroren monster O / N.
4. Voorbereiding van amelogenin-chitosan (CS-AMEL) HYDROGel (Figuur 1A)
   1. Voeg 200 ug rp172 in een buis met 960 ui 1% chitosan-oplossing, meng met een vortex totdat de oplossing helder is.
   2. Voeg 25 ul van 0,1 M _{CaCl2-oplossing,} gevolgd door 15 pi van 0,1 M Na ₂ HPO ₄ oplossing voor het amelogenin bevattende chitosan oplossing, meng met een vortex gedurende 5 minuten.
   3. Stel de pH van de CS-AMEL oplossing 6,5 door voorzichtig toevoegen van 1 M NaOH-oplossing. CS-AMEL hydrogel zal vormen wanneer de pH-waarde bereikt 6,5.

3. Emaille hergroei in Amelogenine-chitosan Hydrogel

1. Voorbereiding van kunstspeeksel oplossing
   1. Los een bepaalde hoeveelheid magnesiumchloride _(MgCl2, 0,2 mM), calciumchloride _(CaCl2, 1 mM), kaliumdiwaterstoffosfaat (KH _{2PO 4,} 4 mM), kaliumchloride (KCl, 16 mM) en ammoniumchloride ( _NH4Cl, 4,5 mM) in 20 mM HEPES(4 - (2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethaansulfonzuur) buffer ^12.
   2. Breng de pH op 7,0 met 1 M NaOH en bewaar de kunstmatige speeksel oplossing bij 4 ° C.
   3. Voordat u de oplossing, voeg natriumfluoride (NaF, 300 ppm).
2. Toepassing van CS-AMEL hydrogel
   1. Solliciteer ongeveer 20 ul CS-AMEL hydrogel op de geëtste tand slice met een spuit (Figuur 1B).
   2. Droog het hydrogel bedekte tanden schijfje in een exsiccator bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
   3. Breng de tand segment een bekerglas met 30 ml kunstmatig speeksel oplossing. Bedek het bekerglas met aluminiumfolie, en houd de beker in een oven bij 37 ° C gedurende 7 dagen.
   4. Verwijder de tand plak en drogen in een exsiccator bij kamertemperatuur.

4. Karakterisering van Interface tussen pas gegroeide Layer en Enamel

De microstructuur van de interface tussen de pas gegroeide laag en glazuur was opmerved door scanning elektronenmicroscopie (SEM) en hoge revolutie transmissie-elektronenmicroscopie (HR-TEM). De TEM monster werd bereid met behulp van een gefocusseerde ionenbundel (FIB), de stappen die zijn als volgt.

1. Plaats het monster in een FIB-SEM instrument en afwerking van alle groeperingen volgens de gebruiksaanwijzing. OPMERKING: Fijn Z aanpassing moet minstens 2 keer worden uitgevoerd.
2. Deponeer een koolstoflaag (15 x 3 urn) op het monster om de onderliggende structuur (Figuur 2A) beschermen.
3. Molen het monster goed naar de boven-, onder-en rechterkant van koolstof laag op een dun stukje van het monster te bereiden, en snijd de onderkant van deze dunne stuk. OPMERKING: Controleer de Ionenbundel uitlijning voor elke maalstap (Figuur 2B).
4. Las een Pt tip over het dunne stuk en snijd de linker kant naar de proefstuk (Figuur 3C) te scheiden. OPMERKING: Controleer de Ionenbundel uitlijning voordat het lassen stap.
5. Til thij Pt tip met het monster langzaam, en monteer de gelamelleerde monster op een lift-out TEM rooster.
6. Maak de tip van het monster, en dun het monster totdat de dikte minder dan 100 nm (Figuur 3D). Verwijder het monster van het instrument naar de TEM observatie uitvoeren. OPMERKING: Controleer de Ionenbundel uitlijning voor elke dunner proces.

Beoordeling van Binding en mechanische eigenschappen van recent Grown Layer 5.

1. De bindingssterkte wordt beoordeeld door ultrasone behandeling. Houd het gerepareerde tand slice in een ultrasone reiniger (42 kHz, 100 W) gedurende 10 minuten, en vervolgens observeren de interface tussen de herstelde laag en natuurlijke glazuur met een teruggekaatste elektron SEM-analyse.
2. Meet de hardheid en de elasticiteitsmodulus bij 20 meetpunten op elk gerepareerd glazuuroppervlak (n = 3) door een nano-indenter met een Berkovich tip.

6. Immunofluorescentiekleuring

1. Was de tand slice met Tris buffer zoutoplossing (TBS) gedurende 15 minuten.
2. Blok met 1% runderserumalbumine (BSA) in TBS gedurende 15 minuten.
3. Verwijder de vloeistof en incubeer het monster O / N met 1 ° Ab (1:500 kip anti-Amelogenine) verdund in TBS (0,1% BSA, 0,3% Triton X-100).
4. Was het monster met TBS gedurende 30 minuten en incubeer O / N met 2 ° Ab (1:100 Anti-kip FITC) verdund in TBS.
5. Was het monster met TBS gedurende 30 minuten en laat het drogen nog 30 minuten.
6. Observeren door fluorescentiemicroscoop.

Resultaten

De doeltreffendheid van de hier beschreven protocol wordt aangetoond door scanning elektronenmicroscopie (SEM), opgegeven elektronendiffractie (SAED) en röntgendiffractie (XRD) analyse. Na reparatie door amelogenin-chitosan (CS-AMEL) hydrogel voor 7 dagen, werd een emaille-achtige laag met een dikte van 15 micrometer gevormd op het geëtste glazuur oppervlak. De nieuw gekweekt laag werd gemaakt van sterk geordende arrays van kristallen met een diameter van ~ 50 nm, bij voorkeur groeien langs de c-as loodrecht op het oppe...

Discussie

Hoewel het mineraalgehalte van glazuur hoog waardoor het de moeilijkste gemineraliseerde weefsel in het menselijk lichaam, dit biokeramische gevoelig voor demineralisatie processen die vaak als cariës en erosie. Gen mutaties kunnen ook leiden dun of zacht email leiden tot een reeks van erfelijke ziekten emaille misvorming genoemd amelogenesis imperfecta ^20. Orale gezondheidszorg producten met fluoride of CPP-ACP hebben op de markt voor meerdere jaren (dat wil zeggen, vernissen, tandpasta'...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Human third molar	Ostrow School of Dentistry of the University of Southern California	N/A	De menselijke kiezen werden geëxtraheerd volgens de standaardprocedures voor extractie aan de Ostrow School of Dentistry van de University of Southern California en werden behandeld met goedkeuring van de Institutional Review Board.
Recombinant pocine amelogenin	Expressie en zuivering  in lab	N/A	rP172, full-length
Chitosan	Sigma-Aldrich	448877	Gemiddeld moleculair gewicht, 75-85% gedeacetyleerd
Fosforzuur	VWR	AA033266
Azijnzuur	VWR	A036289
Natriumhydroxide	VWR	BDH9292
Calciumchloride	Sigma-Aldrich	223506
Dibasisch natriumfosfaat watervrij	VWR	BDH0316
BL21-CodonPlus (DE3)-RP	Agilent Technologies Inc.	230255
Ammoniumsulfaat	VWR	BDH8001
Trifluorazijnzuur	VWR	AAAL06374
Acetonitril	VWR	BDH1103
Magnesiumchloride	VWR	BDH0244
Kaliumdiwaterstoffosfaat	VWR	BDH9268
Kaliumchloride	VWR	BDH0258
Ammoniumchloride	VWR	AAAA15000
HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethaan-sulfonzuur)	VWR	AAA14777
Natriumfluoride	VWR	AA11561
Tris-gebufferde zoutoplossing	Bio-Rad	170-6435	10× TBS
Rundserumalbumine	EMD Millipore	12659	CalBioChem, Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals
Triton X-100	EMD Millipore	TX1568-1
Chicken Anti-Amelogenin	N/A	N/A	Een geschenk van Prof. Malcolm Snead, University of Southern California
Rund Anti-Chicken IgY-FITC	Santa Cruz Biotechnology	Sc-2700
Hoge Prestatie Vloeistof Chromatografie Systeem	Agilent Technologies Inc.	Varian Prostar 210
C4 kolom	Phenomenx	Jupiter 5μ 300A
Scanning Elektronen Microscopie	JEOL	JSM-7001
FIB-SEM	JEOL	JIB-4500
Transmissie Elektronen Microscopie	JEOL	JEM-2100F
Digitale lage snelheid diamantzaag	MTI Corporation	SYJ-150
Fluorescentie microscopie	Leica	DMI3000 B
Ultrasoon gereinigde	Branson	2510	42 kHz, 100 W
Nano-indenter	Agilent Technologies Inc.	MTS XP