Proton Transfer en eiwitconformatie Dynamiek in lichtgevoelige eiwitten door Tijdsgeresolveerde Step-scan Fourier-Transform Infrared Spectroscopy

Samenvatting

Belangrijke stappen van eiwitfunctie, met name conformationele veranderingen in de ruggengraat en protonoverdrachtreacties, vinden vaak plaats op de microseconden tot milliseconden tijdschaal. Deze dynamische processen kunnen worden bestudeerd door middel van tijdopgeloste step-scan Fourier-transform infraroodspectroscopie, met name voor eiwitten waarvan de functie wordt geactiveerd door licht.

Samenvatting

Toezicht op de dynamiek van protonatie en eiwithoofdketen conformatie veranderingen tijdens de functie van een eiwit is een essentiële stap om het mechanisme. Protonering en conformationele veranderingen de vibratie patroon van aminozuurzijketens en de peptidebinding, respectievelijk, die beide kunnen worden gesondeerd door infrarood (IR) spectroscopie verschil. Voor eiwitten waarvan de functie kan herhaaldelijk en reproduceerbaar veroorzaakt zijn door het licht, is het mogelijk om infrarood verschil spectra te verkrijgen met (sub) microseconde resolutie over een breed spectraal bereik met behulp van de stap-scan Fourier transform infrarood techniek. Met ~ 10 ² -10 ³ herhalingen van de fotoreactie, het minimum aantal om een scan tegen redelijke spectrale resolutie en bandbreedte te voltooien, kan het geluidsniveau in de absorptie verschil spectra zo laag zijn als ~ ^10-4, voldoende om de kinetiek van volgen protonering wordt van een enkel aminozuur. Lagergeluidsniveaus worden bereikt door meer gegevens middelen en / of wiskundige bewerking. De hoeveelheid eiwit vereist voor optimale resultaten is tussen 5-100 ug, afhankelijk van de sampling techniek. Wat aanvullende eisen, moet het eiwit eerst worden geconcentreerd in een lage ionensterkte buffer en vervolgens gedroogd om een ​​film te vormen. De eiwit film wordt gehydrateerd voorafgaand aan het experiment, hetzij kleine druppeltjes water of onder gecontroleerde luchtvochtigheid. Het bereikte hydratatie niveau (g water / g eiwit) wordt afgeleid uit een IR-absorptiespectrum. Om de techniek te laten zien, hebben we de fotocyclus van de licht-aangedreven bacteriorhodopsin proton-pomp in zijn native paars membraan milieu, en van de licht-gated ionkanalen channelrhodopsin-2 opgelost in detergent.

Inleiding

Om volledig te verhelderen hoe eiwitten hun functie uit te voeren, is het nodig om deze te meten als ze werken, dat wil zeggen langs een reactie pad dat vaak gepaard gaat met een reeks van tussenproducten en breidt verschillende ordes van tijd. Belangrijke stappen van eiwit functie vinden vaak plaats in het microseconde tot tijd bereik ^{van 1} milliseconde, in het bijzonder backbone vormveranderingen en proton overdracht reacties in membraaneiwitten. X-ray kristallografie, misschien wel de pijler van structurele biologie, biedt statische (tijd-gemiddelde) elektron dichtheden uit goed diffracterende eiwitkristallen, notoir moeilijk om te groeien met membraaneiwitten ^2. Een 3D atoom model kan worden gebouwd gebaseerd op elektronen dichtheden, hoewel zelden waaronder de locatie van waterstofatomen. Opmerkelijke vooruitgang in-time-resolved X-ray kristallografie, die respectievelijk gebaseerd zijn op Laue diffractie ³ of op femtoseconde X-ray pulsen ^4, voegt de dimensie tijd om de hoge structurele informatie inherent aan X-ray kristallografie ^5. Maar afgezien van technische en analytische uitdagingen, kan het kristalrooster ruggengraat conformationele veranderingen schaden en eiwit dynamiek, een onvermijdelijke tekortkoming van methoden op basis van eiwitkristallen ⁵ veranderen. Bijgevolg dynamische aspecten van eiwitten nog steeds het beste onder optische werkwijzen, zoals ontwikkeld door flitsfotolyse ^6,7, hoewel de algemene nadeel van beperkte structurele inzicht.

Fourier getransformeerde infrarood spectroscopie (FT-IR) combineert de temporele resolutie van de optische spectroscopie met een waardevolle gevoeligheid voor eiwitstructuur, de laatste functie in talloze statische structurele en functionele onderzoeken naar membraaneiwitten ^8-11 uitgebuit. Met name FT-IR spectroscopie verschil bewezen een ideaal hulpmiddel om kleine spectrale veranderingen als eiwit doorvoer studie ve metastabiele toestand naar de andere ^12-19 zijn.

Studies op eiwitdynamica, anders dan bij de single molecule niveau ^20,21, vereisen een triggering proces voor synchronisatie. Een reactie wordt bij voorkeur snel en niet invasief geïnitieerd middels licht trigger, zoals gedaan in de studie van eiwitten met cyclische photoreactions. Een belangrijke uitdaging verbonden tijdsopgeloste studies is het bereiken van voldoende tijdresolutie behoud goede spectrale resolutie en geschikt signaal-ruisverhouding. Ook van essentieel belang is om een ​​voldoende brede spectrale en temporele bereik dekken. Tijdopgeloste stap-scan FT-IR spectroscopie blinkt uit in al deze aspecten ^22, met gepubliceerde voorbeelden mbt spectrale bereiken zo breed als 3,900-850 cm ^-1 en dynamiek uitbreiding ~ 9 bestellingen van de tijd, met maximaal 3,5 cm ^-1 spectrale en 30 ns temporele resolutie ^23-28.

Fourier-transformatie IR spectrometers tonen minder geruis en bevordert fotometrische nauwkeurigheid over dispersieve degenen ^29. However in de normale snelle scan opnamemodus FT-IR spectrometers last hebben van tijdsresolutie beperkt tot ≥ 5-10 msec als gevolg van de minimale tijd dat de mobiele spiegel van de interferometer vereisen om een ​​scan te voltooien. Met de stap-scantechniek daarentegen de tijdsafhankelijkheid van de dynamische gebeurtenis wordt ontkoppeld van de scan duur van de interferometer. In het kort, de mobiele spiegel beweegt in discrete stappen in plaats van continu te scannen om een ​​scan te voltooien. Bij elk van deze stappen de (mobiele) spiegel vast wordt gehouden en een voorbijgaande wordt opgenomen. Aldus wordt de tijdsresolutie beperkt door de stijgtijd van de kwik-cadmium-telluride (MCT) detector, die typisch in het gebied van 10-100 ns. In de praktijk, het grote dynamische bereik van het interferogram (die een intense signaal in het centerburst en kleine signalen in de vleugels), vereist voor een goede digitalisering een analoog / digitaalomzetter (ADC) met wel 16-24 bits, waardoor bemonstering tarieven niet hoger dan ~ 200 kHz(5 msec) ^30. Nanoseconde tijdsresolutie kan gebeuren door meting alleen de wijzigingen in de interferogram, waarvoor 8-12 bit ADC voldoende ^23,31-33. Technische aspecten ^30,34,35 en toepassingen ^36-38 van tijdopgeloste stap-scan zijn elders in detail besproken.

Het doel van de huidige bijdrage is aan een protocol beschrijft de praktische aspecten van tijdopgeloste stap-scan FT-IR spectroscopie van een lichtgevoelige membraaneiwitten bieden. Hier wordt de prestatie van de techniek getoond voor twee bemonsteringsmethoden: transmissie en verzwakte totale reflectie (ATR). Het gebruik van ATR maakt het werken in aanwezigheid van overmaat water, die niet alleen zorgt voor een volledige hydratatie voorwaarden voor het eiwit, maar ook kan acute regeling van het monster pH en ionsterkte ^49,50. Stap-scan experimenten zijn weergegeven op twee geselecteerde systemen: bacteriorhodopsin en channelrhodopsin-2.

Het licht-aangedreven proton pomp bacteriorhodopsin (BR) is het onderwerp van talrijke biofysische studies al meer dan veertig jaar ^39,40, waardoor het de best-begrepen membraaneiwit nu toe. Onder de talrijke technieken toegepast op de studie van bR functionaliteit FT-IR spectroscopie aantoonbaar uitgeoefend een van de grootste effecten. Namelijk, heeft FT-IR spectroscopie om de betrokken proton overdracht over het membraan groepen lossen zo elders ^13,41,51 verantwoord zijn.

Channelrhodopsin (CHR) is het eerste licht gated ionkanalen in de natuur gevonden ^42,43. Licht excitatie van ChR leidt de voorbijgaande opening van een ionkanaal. De ontdekking geregeld de weg voor de ontwikkeling van optogenetics, waarbij moleculaire processen gestuurd door licht ^44,45. ChR behoort, als bR, de familie van microbiële rhodopsins maar in tegenstelling tot bR, veel minder bekend over het werkingsmechanisme ^52. ChR2 combineert zijn functie als ion kanaal met proton-pompactiviteit ^46,47. Onlangs, pasten wij tijdsopgeloste stap-scan FT-IR spectroscopie intra-eiwit protonenoverdracht reacties en de dynamiek van eiwitten hoofdketen conformatie veranderingen ChR2 ⁴⁸ lossen.

Protocol

1. Algemene aspecten van het Monster en Instrument Voorbereiding

1. Gebruik een commerciële FT-IR spectrometer uitgerust voor tijdopgeloste stap-scan metingen. Voor het beste resultaat plaatst de FT-IR spectrometer op een vibratie ontkoppelde tafel.
2. Evacueren de optiek compartiment om een ​​paar mbar. Spoel de steekproef compartiment met droge lucht of stikstof.
3. Een IR transparant materiaal ondoorlatend voor zichtbare straling voor de MCT detector van de FT-IR spectrometer. Deze voorzorgsmaatregel is essentieel om voorwerpen uit de spannende laserpuls tijdens stap-scan experimenten te voorkomen. Opmerking: We maken gebruik van een germanium (Ge) venster van 25 mm diameter. Zijn hoge brekingsindex veroorzaakt ongewenste intensiteit verliest, grotendeels vermeden met behulp van een Ge filter met anti-reflecterende coating.
4. Afkoelen van de MCT detector dewar met vloeibare stikstof. Opmerking: Het gebruik van fotovoltaïsche MCT detectoren voorkeur boven photoconductives vanwege hun lineaire respons en dus superieur photometric nauwkeurigheid en betrouwbaarheid uitgangswaarde ^31,53.
5. Pre-concentraat gebruikt voor de experimenten ten minste 2 mg eiwit / ml in een buffer van lage (<20 mM) ionsterkte vorming van zoutkristallen te voorkomen tijdens drogen van de eiwitsuspensie tot een homogeen eiwit film te vormen monster. Voor monsters die sediment, wassen / concentraat hen door het toepassen van ultracentrifuge (bijv. membraaneiwitten in een liposomen of in celmembraan pleisters). Gebruik centricons van de juiste cutoff voor eiwitten die niet sediment (bijvoorbeeld afwasmiddel opgeloste membraaneiwitten).
6. Voor een optimaal resultaat gebruik: a) eiwit preparaten als zuiver en actief mogelijk; b) lipide / eiwit verhoudingen ≤ 3 gewichtsprocent voor eiwitten in het celmembraan patches of gereconstitueerd in liposomen; c) detergent / eiwit verhoudingen ≤ 1 in gewicht voor detergent opgelost eiwitten. Vermijd het gebruik van detergenten of lipiden die vibrationele banden overlappen met die van het eiwit (bijv. CHAPS).

2. Voorbereiding van de gedempte totale Reflectie Experimenten bacteriorhodopsin

1. Monteer de ATR-accessoire in de steekproef compartiment van de FT-IR spectrometer. Opmerking: We maken gebruik van een ZnSe / diamant ATR met 5 actieve reflecties. Vermijd halfgeleidermaterialen zoals germanium of silicium als interne reflectie-element (IRE) van de ATR accessoire, zoals hun optische eigenschappen worden beïnvloed door de spannende zichtbare laser.
2. Meten een breed bereik (ca. 4,000-800 cm ^-1) energie spectrum bij 4 cm ^-1 resolutie van de schone IRE oppervlak door conventionele snelle scan-FT-IR spectroscopie. Gebruik dit spectrum als referentiespectrum absorptie spectra berekenen later.
3. Bedek het IRE oppervlak van het ATR met 20 ul van de buffer later gebruikt voor het monster (bijvoorbeeld, 4 M NaCl en 100 mM NaPi pH 7,4) rehydrateren. Meet de IR absorptie van de buffer.
4. Verwijder de buffer, en spoel het IRE oppervlak with water. Het oppervlak vermijdt. Verwijder restvloeistof uit het IRE oppervlak door een krachtige luchtstroom.
5. Spreid ~ 3 pl bacteriorhodopsin (BR) in paars membranen (~ 6 mg eiwit / ml in gedeïoniseerd water) bovenop het IRE oppervlak (~ 0,2 cm ² oppervlakte). Droog de eiwitsuspensie onder een zachte stroom van droge lucht tot er een film wordt bereikt.
6. Meet de absorptie-spectrum van de droge film (zie figuur 1).
7. Voeg voorzichtig 20-40 ul van een buffer van hoge ionensterkte met de droge film (bijv., 4 M NaCl en 100 mM NaPi pH 7,4) rehydrateren. Opmerking: De hoge ionensterkte voorkomt overmatige zwelling van het membraan film, waardoor zoveel eiwit behouden mogelijk dichtbij het ​​getaste vlak (figuur 2).
8. Bedek de ATR houder met een deksel om verdamping te voorkomen. Eventueel plaatst cover-mantel verbonden bloedsomloop bad ingesteld op 25 ° C voor de temperatuurregeling. Voor eiwitten met een lange photocycles (& #62, seconden), kan temperatuurcontrole basislijn stabiliteit te verhogen.
9. Meet een absorptie spectrum. Schat het percentage resterende monster nabij het ​​oppervlak na rehydratatie van de film door het aftrekken van het absorptiespectrum van de buffer (Figuur 3).
10. Bevestig stabilisatie van de film zwellen door opname absorptiespectra 5-20 minuten tijdstippen na rehydratatie (figuur 4). Deze stap is optioneel, maar aanbevolen.

3. Uitvoeren Transmissie Experimenten Wasmiddel-opgeloste Channelrhodopsin-2

1. Voeg 10 ul van ChR2 (~ 10 mg eiwit / ml) opgelost in 5 mM NaCl, 5 mM HEPES (pH 7,4) en decyl-maltoside (DM) in het midden van een _BaF2 venster van 20 mm. Spreid met behulp van de micropipet tip naar een 6-8 mm (eiwit oppervlaktedichtheid van ~ 200 ug / cm ^2).
2. Vormen een film using een zachte stroom van droge lucht. Voor de beste resultaten zorgen dat de film homogeen en heeft een diameter ongeveer overeenkomt met de grootte van de infraroodstraal op de grootste opening.
3. Hydrateren de film door het toevoegen van 3-5 pi van een mengsel van glycerol / water verdeeld 3-5 drops rond de droge film, en strak dicht het met een tweede venster met een platte siliconen O-ring van ≥ 1 mm dikte. Opmerking: De verhouding van de glycerol / watermengsel regelt de relatieve vochtigheid tussen de vensters ^54. Voor hygroscopisch samples 3/7 en 2/8 glycerol / water-verhouding (w / w). De glycerol / water drops nooit in direct contact met het eiwit film.
4. Plaats de _BaF2 ingeklemd ramen in een houder. Voorkom direct licht de detector bereikt door het bedekken van het monster venster met IR ondoorschijnend materiaal, zoals papier, met een gat overeenkomt met de grootte van de gehydrateerde film. Plaats de houder in de steekproef compartiment.
5. Regel de temperatuur van de houder 25 °C door een thermostatische mantel verbonden met een temperatuur gecontroleerde bloedsomloop bad.
6. Meet een absorptiespectrum. Zorg ervoor dat de maximale absorptie in het amide I-regio (~ 1,700-1,620 cm ^-1) is in het bereik van 0,6-1,0.
7. Schat de massa en molaire verhouding van eiwit / detergent / water van het absorptiespectrum van de gehydrateerde film (figuur 5) met referentie extinctiecoëfficiënt spectra water, DM, en representatieve membraaneiwitten (figuur 6).
8. Wacht tot de hydratatie niveau stabiliseert alvorens stap-scan experimenten (≥ 1 uur).

4. Aanpassing en synchronisatie van de spannende Laser

Voor experimenten bR gebruik de tweede harmonische emissie van een gepulste Nd: YAG laser (λ = 532 nm) aan de fotocyclus activeren. Voor experimenten met ChR2, gebruik een excitatie van λ = 450 nm, zoals bepaald door een optische parametrische oscillator (OPO) aangedreven door de derde harmonische (λ = 355 nm) van een Nd: YAG laser. Zorg ervoor dat de laserpuls voldoende korte (~ 10 nanoseconden) naar secundair foto-excitatie te minimaliseren. Opmerking: De energie van de laserpulsen moet zo constant mogelijk zijn. In onze opstelling, de laserintensiteit fluctueert ≤ 10% rond de gemiddelde waarde, zoals bevestigd door het meten van een reflex van de laser door een fotodiode verbonden met een registreerinrichting en combineren oplossingen (figuur 8).

1. Paar de laser het monster. Pas de energiedichtheid van de laser op het monster 2-3 mJ / cm ² per puls een bekrachtigde-meter.
   1. Voor de ATR setup, gebruik een optische vezel geplaatst op de hoogte van de ATR deksel.
   2. Voor transmissie experimenten gebruikt spiegels om de laser aan het monster te brengen en, indien nodig, lenzen of collimeren of divergeren de laserbundel een diameter die een weinig boven het monster filmformaat.
2. Synchroniseer de LÄSEr puls met gegevensregistratie met de spectrometer. Gebruik de Q-switch sync-out TTL puls van de elektronica van de Nd: YAG laser om de spectrometer te activeren. Stel de excitatie snelheid van de Nd: YAG laser 10 Hz voor bR en 0,25 Hz voor ChR2 respectievelijk.
3. Gebruik een puls vertragingsgenerator (PDG) naar de laser excitatie te regelen wanneer de herhalingsfrequentie van de Nd: YAG laser niet gemakkelijk instelbaar.
   1. Sluit de lamp sync-out van de Nd: YAG laser om de PDG externe trigger ingang. De PDG verschaft een ~ 190 psec vertraagde TTL pulsuitgang de Q-schakelaar sync-in ingang van de Nd: YAG laser om de laserwerking activeren. Poort de PDG een externe trigger pas na bepaalde tijd sinds de laatste geaccepteerde trekker (100 msec voor Br of 4 seconden voor ChR2) accepteren.

5. Tijdsgeresolveerde Step-scan voorbereidingen en instellingen

1. Plaats een laagdoorlaat optisch filter in de optische baan. Om tijdopgeloste stap-scan metingen uit te voeren in de 1,800-850 cm ^-1 spectrum, gebruik een filter ondoorzichtige boven 1950 cm ^-1 en met goede transmissie (> 50-80%) in 1800 cm ^-1 (figuur 7).
2. Wijzig de detector van AC naar DC-gekoppelde modus. Opmerking: Na deze aanpassing de interferogram signaal niet langer zal oscilleren rond de nul, maar rond een waarde bekend als de DC-niveau.
3. Met de grootste mogelijke bundel apertuur van de spectrometer hogere foton flux en dus betere signaal-ruis, maar binnen de grenzen lineariteit van de detector.
4. Breng het DC-niveau van de interferogram op nul en stel de elektronische versterking om beter gebruik te maken van dynamisch bereik van de analoge digitale geconverteerde (ADC) te maken. Bereiken DC-waarden worden door een spanning voorspanning om het signaal door de voorversterker. Opmerking: Deze optie is opgenomen in de moderne FT-IR spectrometers. Anders kan een zelfgemaakte extern apparaat in plaats daarvan worden gebruikt, geplaatst tussen de voorversterker en de ADC ^38. Zorg is danom ervoor te zorgen dat de elektronica van deze inrichting zijn snel en lineair.
5. Start het menu stap-scan van de FT-IR spectrometer. Stel het doel spectrale bandbreedte voor het meten van de stap-scan 1,975.3-0 cm ^-1. Stel de spectrale bandbreedte tot een fractie van de He-Ne laser golfgetal (1/8 ^ste in casu) licht boven de afsnijfrequentie van de optische filter.
6. Schakel alle high-pass elektronisch filter om verstoringen van de kinetiek voorkomen op latere tijdstippen. Een low-pass filter elektronische gunstig kan zijn wanneer de cutoff frequentie in de orde of boven de bemonsteringsfrequentie van het ADC (reduceert ruis aliasing).
7. Stel de spectrale en fase resolutie tot 8 cm ^-1 en 64 cm ^-1, respectievelijk. Stel de interferogram overname modus om enkelzijdige vooruit. Met deze opties een interferogram vereist ongeveer 500 punten.
8. Stel de bemonsteringsfrequentie van het ADC om de hoogste in de spectrometer (bijv. 160 kHz, of 6,25 psec). Stel de "trigger voor experiment" op "External", dat wil zeggen, de laser is de meester. Stel het aantal lineair-spaced datapunten worden geregistreerd: 7000 BR (tot 42 msec) en 20.000 voor ChR2 (maximaal 125 msec). Opmerking: langere tijdschalen kunnen vallen, zonder overlopen de ADC geheugen met een quasi-logaritmische tijd verdeelde externe TTL pulsen van een golf generator gegevensverwerving ³⁸ veroorzaken, of door twee parallelle transient recorders als vervangers van de interne ADC ^{31, 32.}
9. Sparen ongeveer 100 pre-trigger points als referentie voor de donkere toestand van het monster. Opmerking: In de milliseconde tijdschaal de kwaliteit van de gegevens is vaak beperkt door schommelingen in de mobiele spiegel. Het verhogen van de pre-trigger boven 100 is dus niet te verwachten aanzienlijke verbetering van de kwaliteit van de gegevens.
10. Stel het aantal co-toevoegingen, dat wil zeggen, het aantal gemiddelden van de fotoreactie per spiegel ponerenion. BR, gebruiken 20 co-toevoegingen (20 min. van het meten van de tijd bij 10 Hz excitatie tarief). Voor ChR2 gebruik 2 co-toevoegingen (70 min van de tijd te meten op 0,25 Hz excitatie tarief)
11. Herhaal het experiment 10x voor Br en 35x op drie verschillende monster films voor ChR2, om eindelijk ~ 200 co-toevoegingen per spiegel positie.

6. Data Processing

1. Controleer de status van het monster door het licht-geïnduceerde IR verschilspectrum verkregen uit de eerste en de laatste meting vergeleken. Overweeg waarbij een eventueel metingen waarbij de intensiteit van het verschilspectrum beneden 60% van de eerste meting.
2. Het gemiddelde van de opgenomen interferogrammen.
   1. Met behulp van de OPUS software van de FTIR spectrometer selecteer de time-resolved interferogrammen tot gemiddeld en voeg ze toe aan de "Spectrum Calculator".
   2. Instructies "=" naar het gemiddelde van de interferogrammen verkrijgen.
      Opmerking: Wanneer de fase van de interferogramconstant is tijdens de meting is onverschillig voor gemiddeld interferogrammen of single-channel spectra. Een constante fase kan worden bevestigd door het berekenen en de fase spectrum voor de eerste en de laatste opgenomen interferogram vergelijken.
3. Voer de Fourier-transformatie van de gemiddelde time-resolved interferogrammen tot gemiddeld tijdopgeloste enkel kanaal spectra te verkrijgen.
   1. Met behulp van dezelfde software als in stap 6.2.1, selecteert de gemiddelde time-resolved interferogram en klik op het pictogram voor "interferogram om spectra". Gebruik de Mertz fase-correctie methode, een zero-vulling factor 2 (twee digitale punten per instrumentale resolutie), en een masker dat (bijvoorbeeld, driehoek, Blackmann-Harris 3-termen, enz.).
   2. Klik op de onderste "Convert" om de time-resolved interferogram transformeren tot tijdsopgeloste spectra.
4. Gegevens van de time-resolved enkel kanaal exporteren als een "data point tafel" of een "; Matlab "bestand met de" opslaan als "icoon in de OPUS software. Ga verder met de verwerking van gegevens in een extern programma.
   1. Het gemiddelde van de single channel spectra voor de laser, en de gegevens van de time-resolved enkel kanaal te converteren naar tijdopgeloste absorptie verschil spectra.
   2. Bereken een vector voor de verwachte ruis standaarddeviatie van het verschil spectra als functie van de golfgetal (figuur 12), met het geluid standaarddeviatie, ε en gemiddelde S ₀ (ν), van 100 kanaal spectra vóór de laser: ε / S ₀ (ν). De waarde van ε geschat aftrekken opeenvolgende kanaal spectra en berekening van de standaarddeviatie gecorrigeerd √ 2.
   3. Verwijder spectrale gebieden te lawaaierig gebruiksomstandigheden (bijvoorbeeld boven 1825 cm ^-1 en 850 cm ^-1 hieronder).
   4. Voer een quasi-logaritmisch gemiddelde (bijv. 20 spectra / tijd decennium). De appearance van de gegevens te verbeteren en het aantal spectra wordt verlaagd van 10 ~ ⁴ tot 10 ~ ² zonder belangrijke informatie verloren (fig. 9).
   5. Verhoog vier keer de spectrale dichtheid van de punten (1 punt / cm ^-1) met behulp van Fourier interpolatie (plaatsen nul-vulling).
      Opmerking: Wij voeren stappen 6.4.1 tot en met 6.4.4 in een zelfgemaakt programma dat draait in MATLAB.
5. Verwerk de verkregen tijdopgeloste spectra (Figuur 10A) met singuliere waarden ontbinding, SVD, (figuur 13). Bereiken gegevens denoising door het reconstrueren van de gegevens met een beperkt aantal belangrijke SVD componenten (Figuur 10B). Opmerking: Wij voeren SVD in MATLAB, met behulp van de ingebouwde functie "SVD".

Resultaten

Figuur 1 toont een absorptiespectrum van een droge film van bR afgezet op het oppervlak van de diamant interne reflectie-element voor ATR-spectroscopie. Karakteristiek bands uit trillingen van de peptidebinding (amide A, amide I en amide II) zijn duidelijk te onderscheiden. De dikte van de droge film kan aan geschat ~ 1 micrometer, gezien de hoeveelheid toegevoegde eiwit (18 ug) en het oppervlak van het ATR (~ 0,2 cm ^2), en waarbij de dichtheid van eiwit ~ 1,4 g / cm ^{3, 58} en lipiden zoals 1,0 g / cm ^{3, 59} en een lipide / eiwit verhouding van 1/3 (w / w) in paars membraan ^60.

De droge film werd gehydrateerd met een overmaat 4 M NaCl, 100 mM NaPi bij pH 7,4 (Figuur 3). De hydratatie en effectieve eiwitconcentratie in het volume gepeild door de uitdovende golf kan worden afgeleid uit de schaalfactor die nodig digitaal verwijderen absorptiebandenuit het water. De optimale schaalfactor 0,87, wat betekent dat in dit geval de buffer beslaat 87% en het monster 13% van het volume bij het oppervlak. Rekening houdend met eiwitten en lipiden dichtheid en de lipiden / eiwitverhouding in paars membranen (zie hierboven), kunnen we een effectieve eiwitconcentratie van 125 mg / ml afleiden van de omvang gepeild door de uitdovende golf. We kunnen afleiden uit de hydratatie niveau, in dit geval, het monster laagdikte uitgebreid ~ 6 tijden na rehydratatie, van ~ 1 tot ~ 6 urn. Voor een 45 ° invalshoek, typisch voor onze en voor de meeste ATR regeling, de penetratiediepte van het verdwijnende veld _(dp) een gehydrateerde eiwit film varieert tussen 0,3 en 0,6 micrometer in de 1,800-850 cm ^-1 interval ^61. Omdat het verdwijnende veld nagenoeg ongevoelig voor de sample zich tweemaal boven _dp ^61, concluderen wij dat de hoeveelheid eiwit in de ATR experiment kan in beginsel verminderd 5x without enig significant verlies van signaal.

Bij gebruik van buffers van lage ionische sterkte van de film meer uitzet en de hoeveelheid eiwit in het volume gesondeerd door het transversaal afvallende veld wordt (figuur 2). De precieze afhankelijkheid tussen film zwelling en de ionische sterkte van de buffer hangt onder meer af van de aard van de lipiden. Bijvoorbeeld, een soortgelijke film zwelling hier verkregen bR paars membraan met 4 M NaCl werd verkregen voor een membraaneiwit gereconstitueerd in polaire E. coli lipiden met slechts 0,1 M NaCl ^62. Als het monster neemt minder dan 5% van het volume gesondeerd eens opnieuw doen hydratatie stap met een buffer met hogere ionensterkte. Film zwelling na hydratatie enige tijd nodig om te stabiliseren (figuur 4) te bereiken. BR in paars membraan het proces is monoexponential, met een tijdconstante van 12 min: het duurt niet langer dan 30-60 minuten om een ​​stabiele gerehydrateerd film hebben

Figuur 5 toont een IR absorptiespectrum van een gehydrateerde film ChR2 verkregen transmissie. Hier werd hydratatie bereikt door het blootstellen van de droge film aan een atmosfeer van gecontroleerde vochtigheid door een mengsel van glycerol / water. Het spectrum kan worden ontleed in bijdragen van water, wasmiddel en eiwit. We konden het bedrag van elk van hen met behulp uitdovingscoëfficiënt spectra schatten, geschaald naar de experimentele spectrum passen. Voor water namen we de extinctiecoëfficiënt spectrum uit de literatuur ^63, en voor DM meten we het van een 100 mg / ml oplossing (Figuur 6). Wij gebruikten ook extinctie coëfficiënten voor twee representatieve membraaneiwitten: het mitochondriale ADP / ATP drager ⁶⁴ en bR (figuur 7). De schaalfactor geeft een water DM massa oppervlakte dichtheid van 260 ug / cm ² en 200 ug / cm ² in de film, respectievelijk. De overblijvende absorptie (Figure 5, rode lijn) bestaan ​​voornamelijk uit eiwit, geschat op een oppervlaktedichtheid van 250 ug / cm ² met het amide II extinctiecoëfficiënt van twee verschillende membraaneiwitten (zie figuur 6). De molaire verhouding van eiwit / detergent / water werd berekend op 1/60/2000 met een molecuulmassa van 35 kDa, 480 Da en 18 Da, respectievelijk.

Een 3D-plot van de typische tijdopgeloste stap-scan FT-IR experiment op bR is weergegeven in figuur 10A, verkregen door ATR en waarbij 200 min van data-acquisitie. Spectra worden geëxtraheerd op bepaalde tijden, bijvoorbeeld wanneer de L, M en N tussenproducten van de bR fotocyclus verwachting hun hoogste populatie (figuur 11) te bereiken. Hun spectrale eigenschappen zijn uitgebreid ^13,41,65 beschreven en zal hier verder niet worden besproken. Figuur 12 toont tijd-sporen op een aantal geselecteerde golfgetallen. Namelijk, de opkomst van de kinetiek bij 1762 cm ^-1 (t _1/2 ~ 60 psec) rapporten over de dynamiek van Asp85 protonering van de retinale Schiffse base ⁶⁶ en het verval nul voor de deprotonering op grond-sate herstel ^67. De negatieve opkomst van de kinetiek bij 1740 ^cm-1 (t _1/2 ~ 1 msec) verslagen over de deprotonering van Asp96 zijketen, de proton donor van de Schiff-base ^68. Het verval van de intensiteit op nul rapporten over de reprotonation uit het cytoplasma ^67. De dynamiek van eiwit conformationele veranderingen kunnen worden gesondeerd door absorptie veranderingen in de amide I en amide II-regio, een maximale verandering op ~ 3 msec bij kamertemperatuur ^67,69 bereikt.

De toepassing van SVD om problemen spectroscopische is beoordeeld voor ^55,56. Kort SVD factorizes de experimentele gegevens, gerangschikt in een matrix A als A = U S ^VT. Deze factorisatie kan worden gewijzigd om rekening te houden met het lawaai afhankelijkheid van golfgetal en bestraffen schommelingen / afwijkingen in de uitgangssituatie ^57. De kolommen van U en V orthogonale bevatten spectra en tijd-sporen vectoren per SVD component resp. S een diagonale matrix met de zogenaamde singuliere waarden. De (abstract) spectro-temporele componenten U en V weergegeven afnemende relevantie voor de experimentele gegevens beschrijven de kleinste kwadraten zin gekwantificeerd door bijbehorende singuliere waarde. Figuur 13A toont de singuliere waarden als functie van het onderdeel nummer, en reproduceert de eerste acht kolommen / onderdelen van de U (abstracte spectra, figuur 13B) en V (abstract tijd-sporen, figuur 13C). Het signaal wordt geconcentreerd in de eerste vijf componenten (zoals verwacht voor een photocycle met vijf tussenliggende staten), met componenten hierboven grotendeels gedomineerd door ruis en andere bronnen van fouten. De experimentele gegevens werden gereconstrueerd met alleen de eerste vijf kolommen van U en V, en de eerste vijf kolommen en rijen S. De gereconstrueerd door SVD gegevens de beste kleinste kwadraten aanpassing van de experimentele gegevens naar een matrix van rang vijf. De gereconstrueerde gegevens blijkt verbeterde kwaliteit (Figuur 10B). Namelijk wordt het geluid sterk verminderde evenals enkele nauwelijks waarneembare schommelingen en afwijkingen in de basislijn (gebruikelijk in tijdsopgeloste stap-scan spectroscopie ^25). SVD verwerking is vooral gunstig voor de verbetering van de kwaliteit van de experimentele tijd-sporen in milliseconden (rode lijnen in figuur 12).

Tijdsopgeloste stap-scandata voor het ChR2 fotocyclus werden verkregen volgens de hierboven beschreven protocol voor transmissie Sion experimenten (figuur 14A), waarbij ongeveer 120 uur van de geaccumuleerde metingen. De time-resolved data voor stap-scan verzameld strekt zich uit van 6,25 msec tot 125 msec. De fotocyclus van ChR2 vereist ongeveer 60 s voor volledig herstel. Het laatste deel van de fotocyclus kan worden gedekt met behulp van rapid-scan FT-IR, en beide stap-scan en snelle scan datasets samengevoegd zoals elders ⁴⁸ gepresenteerd. De spectrale veranderingen van ChR2 zijn ~ 10 maal kleiner dan die verkrijgen van BR, waardoor de metingen meer uitdagend. Speciaal, oscillaties in de uitgangswaarde in milliseconden worden duidelijk zichtbaar bij deze lage veranderingen absorptie. Dit wordt veroorzaakt door kleine schommelingen in de mobiele spiegel in de milliseconde tijdschaal ^25. De oscillaties, samen met een deel van het geluid, kan worden grotendeels verwijderd door SVD, opmerkelijk verbeteren van het uiterlijk van de gegevens (Figuur 14B).

guur 1 "fo: content-width =" 5in "src =" / files/ftp_upload/51622/51622fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 1. Absorptiespectrum van bR in paars membraan gedroogd boven het oppervlak van een diamant ATR accessoire. Bands trillingen van de peptidebinding (amide I, II en A) aangegeven.

Figuur 2. Absorptiespectrum van een film van bR na rehydratatie met buffers van verschillende ionische sterktes (verdunningen van 4 M NaCl, 100 mM Na ₂ HPO ₄ / NaH ₂ PO ₄ bij pH 7,4). Let op de vermindering van het amide II band, dwz verhoogde film zwelling, met afnemende ionensterkte van de buffer. (Invoegen) Relatieve hoeveelheid eiwitten aan de oppervlakte, gekwantificeerd door de intensiteit van de absorptie bij 1541 ^cm-1 (amide II maximum) na subtractiop de absorptie bijdrage van de buffer.

Figuur 3. Absorptiespectrum van een film van bR gerehydrateerd met volume buffer (4,3 M ionsterkte) en na aftrek van de bijdrage buffer. Het aftrekken factor 0,87, werd gekozen om de sterke wateropname tussen 3,700-3,000 cm ^-1 verwijderen en een vlakke basislijn tussen 2,700-1,800 cm ^-1 te verkrijgen.

Figuur 4. Absorptiespectrum van bR na rehydratatie met een buffer van 4,3 M ionsterkte (buffer absorptie werd afgetrokken voor duidelijkheid in figuur 3). Het inzetstuk toont de evolutie van de film zwelling na rehydration, gevolgd door de eiwit amide II absorptie bij 1541 cm ^-1. Een passend op een exponentiële geeft een tijdconstante voor film zwellen stabilisatie van 12 minuten.

Figuur 5. Absorptiespectrum van een gehydrateerde film van ChR2 gemeten door transmissie (blauwe lijn). De extinctiecoëfficiënt spectrum van water (gestippelde oranje lijn) en DM (gestippelde cyaan lijn) werd geschaald en afgetrokken (rode lijn).

Figuur 6. Overgenomen massa-extinctie coëfficiënt spectra bij 25 ° C voor vloeibare water (http://www.ualberta.ca/ ~ jbertie / JBDownload.HTM # Spectra) en voor een gehydrateerde film van het ADP / ATP carrier (AAC) ⁶⁴ . trong> De massa extinctiecoëfficiënt spectrum werd gemeten in oplossing DM (100 mg / ml) en in een gehydrateerde film voor bR.

Figuur 7. Transmissie van de optische filter in de tijdsopgeloste scannen scan FT-IR metingen.

. Figuur 8 Prestaties van de laserpulsen door de tweede harmonische (532 nm) van een Nd:. YAG laser Histogram van de variatie van de relatieve energie van 1000 laserpulsen, en geschikt om een Gaussische verdeling met een standaarddeviatie van 0,05.

1622/51622fig9highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 9. Licht-geïnduceerde absorptieveranderingen Br bij drie representatieve golfgetallen op uniforme tijd tussenruimten (groen, zwart en blauwe lijnen) en na quasi-logaritmische middeling tot ~ 20 punten / decennium (rode lijnen). Let op de geluidsreductie na logaritmische middeling, onthullen trilling van de tijd sporen in milliseconden.

Figuur 10. 3D weergave van licht-geïnduceerde veranderingen absorptie BR opgenomen door ATR bij pH 7,4 (4 M NaCl, 100 mM NaPi). A) Ruwe data. B) gegevens gereconstrueerd met vijf SVD componenten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 11. FT-IR verschil absorptiespectra van de bR fotocyclus drie geselecteerde tijdstippen waarbij de L (12,5 psec), M (300 usec) en N (6 msec) tussenproducten zijn zeer verrijkt.

Figuur 12. Proton overdracht en eiwithoofdketen dynamiek in de BR fotocyclus als opgelost door tijdopgeloste stap-scan FT-IR spectroscopie verschil. De absorptie veranderingen op 1762 cm ^-1 verslagen over de protonatie / deprotonering dynamiek van Asp85, en bij 1741 cm ^-1 op de deprotonering / reprotonation dynamiek van Asp96 (inclusief H-binding veranderingen voor 300 msec). De tijd-sporen bij 1670 en 1555 cm ^-1verslag veranderingen amide I en II trillingen, zowel gevoelig zijn voor de conformatie van het peptide hoofdketen. De achterkant sporen komen overeen met de ruwe data, en de rode aan SVD-behandelde gegevens. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 13. Singular waarde ontleding (SVD) van de experimentele tijdsopgeloste stap-scan FT-IR-gegevens van de bR fotocyclus (zie figuur 10A). SVD uitgevoerd na afweging van de experimentele gegevens met inachtneming van het lawaai standaardafwijking afhankelijkheid golfgetal (Figuur 15); gecombineerd met het 1 ^ste derivaat statistische gewicht van basislijn fluctuaties, zoals eerder beschreven ^57. A) & #160, Plot van de relatieve singuliere waarden van de eerste 50 componenten (zwarte cirkels). De eerste vijf bestanddelen worden toegewezen aan componenten (rode cirkels) signaal. De rest van de componenten exponentieel zoals verwacht voor geluid-componenten (zie gestippelde grijze lijn). B) Eerste acht abstract spectra (U ₁ tot U _8). C) Eerste acht abstract tijd-sporen (V ₁ tot en met V _8). De abstracte spectra en tijd-sporen toegewezen signaal zijn afgebeeld in rode lijnen, en met zwarte lijnen anders. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 14. 3D-weergave van licht-geïnduceerde IR absorptieveranderingen voor ChR2 opgenomen door stap-scanin de transmissie-modus. De stap-scangegevens, verlengd tot 125 msec, slechts betrekking hebben op een deel van de fotocyclus. A) Ruwe data. B) gegevens gereconstrueerd met vijf SVD componenten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 15. Geschatte geluidsniveau in een FT-IR. Verschil absorptiespectrum op 6,25 usee temporele en 8 cm ^-1 spectrale resolutie voor een experiment met 1 co-addition/mirror positie (500 photoreactions) of ~ 200 co-addition/mirror positie (10 photoreactions ^5). Waarden weergegeven voor de verzwakte totale reflectie (ATR) en de instelling voor verzending.

Discussie

Een van de eerste aspecten die aandacht moet bij het uitvoeren van tijdsopgeloste stap-scan FT-IR experimenten op een eiwit is de bereiding van een monster in een geschikte vorm voor IR spectroscopie. De IR absorptie van andere dan het eiwit van interesse stoffen worden verkleind, vooral uit water. De meest gebruikte aanpak is om het grootste deel water van het monster verdampen om een ​​film te vormen. De film kan worden gerehydrateerd hetzij door toevoegen van enkele druppels van een waterige oplossing of door het blootstellen van de film aan een atmosfeer van gecontroleerde vochtigheid. Wij hebben laten zien hoe in beide gevallen is het mogelijk om de door middel van IR-absorptie spectroscopie hydratatie (zie figuur 3 en figuur 5) te schatten. Hoewel de verkregen hydratatie niveaus laag kan lijken in vergelijking met die in oplossing, ze eigenlijk dicht bij die in levende cellen ^70, waardoor de studie van gehydrateerde films eiwitten functioneel relevant. Naast water, hetis ook belangrijk om te weten en de hoeveelheid lipide of detergens in het monster regelen. Beide moet zo klein zijn minder effect spectroscopische hebben de IR absorptie bewaard, maar hoog genoeg om de integriteit en functionaliteit van het eiwit van belang te behouden.

Tijdopgeloste stap-scan spectroscopie is alleen ronduit toepassing op eiwitten waaruit omkeerbare reacties die reproduceerbaar kan worden geactiveerd door licht (maar zie de vooruitgang in het koppelen van stap-scan met een snelle uitwisseling van buffer) ^71. In stap-scan de reactie moet reproduceerbaar te zijn voor ten minste ~ 500x, het minimum aantal om een interferogram over de 1,800-850 cm ^-1 regio voltooien op 8 cm ^-1 resolutie. In de praktijk, additionele data middeling algemeen moet het geluidsniveau beneden duwen. Voor 200 co-additions/mirror positie (10 ⁵ herhalingen van de reactie) een 6.25 usee resolutie extinctieverschil spectrum kan een geluid sta weerndard afwijking tussen 2 x 10 ^-5 en 2 x 10 ^-4 voor een ATR en tussen 5 x 10 ^-6 en 3 x 10 ^-5 voor transmissie experiment (figuur 15). Dankzij de hoge foton doorvoer, transmissie zorgt voor ~ 7 lagere geluidsniveaus dan ATR, een belangrijk aspect voor het succesvol bestuderen van monsters die zwakke absorptie veranderingen zoals ChR2. Anderzijds, ATR vereist 5 tot 25 keer minder monster tot uitzending experiment.

De toepassing van tijdopgeloste stap-scan FT-IR spectroscopie is problematisch voor eiwitten weergeven van trage photocycles: het opnemen van een interferogram stap-scan kan onpraktisch lang worden. Sommige oplossingen zijn gepresenteerd voor het omgaan met dergelijke gevallen ^72,73, vaak gebaseerd op het gebruik van meerdere verwisselbare monsters te versnellen metingen ten koste van een verhoogde eiwitconsumptie en experimentele complexiteit ^27,74. In sommige gevallen is het mogelijk om dit probleem te omzeilen door exonder verwijzing naar het monster voor de fotocyclus strikt is voltooid. Voor ChR2, met een fotocyclus die na foto-excitatie 60 sec voor 99% herstel, het herstel op 4 sec is al van 80% ^48. Met een excitatie rendement van 10% per laserpuls, 98% van ChR2 moleculen in het duister toestand 4 seconden na foto-excitatie waardoor het mogelijk experimenten op een laser herhalingssnelheid 0,25 Hz.

Gegevensverwerking is een definitief technisch aspect nodig om de best mogelijke resultaten te bereiken. Logaritmische gemiddelde ruis en, belangrijk, vermindert de grootte van de gegevens zonder vervormingen, een functie essentieel voor latere analyse met behulp singuliere waarden ontbinding of globale fitting. Logaritmische gemiddelde is echter niet erg succesvol gemiddeld schommelingen in de tijd sporen door schommelingen in de mobiele spiegel en andere 1 / f ruis bronnen tijdens de metingen (figuur 9). Deze schommelingen in de basislijnkan de ruis in milliseconden en corrupte de kwaliteit van de gegevens te overschrijden. Singuliere waarden ontbinding maakt gebruik van de redundantie van de gegevens aan de ruis, en met enkele wijzigingen ⁵⁷ het ook kan verminderen schommelingen van de basislijn.

Tenslotte, de harder en meest tijdrovende deel van tijdsopgeloste stap-scan FT-IR experiment overeen met de toewijzing van banden en de spectrale en kinetische interpretatie van de gegevens. Voor bacteriorhodopsin veel van de bands die in de IR spectra verschil zijn toegewezen of geïnterpreteerd dankzij de opgebouwde werk van veel onderzoeker groepen over decennia. Voor een veel minder bestudeerd eiwit, zoals channelrhodopsin-2, hebben de hierboven vermelde tijdsopgeloste IR experimenten vergezeld door parallelle experimenten plaatsgerichte mutanten en gecombineerd met informatie uit complementaire technieken een mechanistische interpretatie ⁴⁸ bereikt.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
FT-IR spectrometer	Bruker	Vertex 80v	Uitgerust met fotovoltaïsche-MCT detector, een externe globale, en een olievrije pomp. Firmware 2.3.
BaF2 vensters	korth Kristalle
Diamond ATR accesory	Smiths detection		Negen-reflectie DuraDisk
Thermostaatbad	Julabo	F25
Vibratie gekoppelde tafel	OPTA
Gepulseerde Nd:YAG laser met een tweede harmonische generator	Continuum electro-Optics	Minilite
Optische parametrische oscillator (OPO)	OPTA	BBO-355-VIS/IR S/N 1009
Digitale vertraging/pulsgenerator	Stanford Research Systems	DG535
Gepulseerde Nd:YAG laser met een derde harmonische generator	Spectra-Physics	Quanta-Ray
Verschillende optische spiegels en lenzen	ThorLabs
OPUS 7.0	Bruker		Software om Vertex 80v spectrometer te bedienen
MATLAB run time	Mathworks		Wordt gebruikt om zelfgemaakte uitvoerbare programma's te runnen om de gegevens voor te verwerken