Kwantificering en Maat-profilering van extracellulaire blaasjes behulp Melodieuze Resistive Pulse Sensing

Summary

Extracellulaire vesicles spelen een belangrijke rol in fysiologische en pathologische processen, zoals coagulatie, immuunresponsen en kanker of als potentiële therapeutische middelen bij geneesmiddelafgifte of regeneratieve geneeskunde. Dit protocol geeft methoden voor de kwantificering en de grootte karakterisering van geïsoleerde en niet-geïsoleerde extracellulaire blaasjes in verschillende vloeistoffen met behulp van instelbare weerstand puls detectie.

Abstract

Extracellulaire blaasjes (EV's), met inbegrip van 'microvesicles' en 'exosomen', zijn zeer overvloedig in lichaamsvloeistoffen. De afgelopen jaren is een enorme toename van de belangstelling voor EV's getuige. EV bleken belangrijke rol in verscheidene fysiologische en pathologische processen, zoals coagulatie, immuunresponsen en kanker. Bovendien EV hebben potentieel als therapeutische middelen, bijvoorbeeld als drug delivery vehicles of regeneratieve geneeskunde. Door hun kleine formaat (50 tot 1000 nm) accurate kwantificering en grootte profilering van EV's is technisch uitdagend.

Dit protocol beschrijft hoe afstembare resistieve pulse sensing (TRP) technologie, waarbij het qNano systeem kan worden gebruikt om de concentratie en de grootte van EV bepalen. De methode, die berust op de detectie van EV op de overdracht door een nano sized poriën, is relatief snel, volstaat het gebruik van kleine monstervolumes en niet de pur vereisenification en concentratie van EV's. Naast de reguliere werking protocol een alternatieve aanpak wordt beschreven met behulp van monsters verrijkt met polystyreen parels van bekende grootte en concentratie. Deze real-time calibratie kunnen worden gebruikt om technische obstakels overwinnen ondervonden bij meting EV direct in biologische vloeistoffen.

Introduction

Blaasjes van cellulaire oorsprong zijn zeer overvloedig in lichaamsvloeistoffen ^1. Deze zogenaamde extracellulaire blaasjes (EV's) (50 - 1000 nm groot) worden gevormd door een fusie van multi-vesiculaire lichamen met de celmembraan of door directe uiterlijke ontluiken van de celmembraan. De laatste jaren heeft wetenschappelijke belangstelling EV sterk toegenomen, wat resulteert in een overvloed aan-EV gerichte publicaties waarop nieuwe functies en eigenschappen van EV beschreven ^1. EV's zijn nu geloofd te worden betrokken bij een breed scala aan fysiologische en pathologische processen zoals signaaltransductie, immuunregulatie, en bloedstolling ^1-4. Bij kanker EV lijken een rol in de vorming van premetastatic niches ^5,6, overdracht van pro-kanker gehalte ^{7,8 tot} stimulatie van angiogenese ⁸ spelen. Daarnaast worden EVs onderzocht als levering agenten van therapeutische middelen ^9.

Ondanks deze dekelingen, betrouwbare kwantificering van EVS blijft uitdagend. Traditioneel worden indirecte kwantificering methoden, die berusten op de kwantificering van totaal eiwitgehalte specifieke eiwitten. Hoewel in grote lijnen gebruikt, zijn deze technieken niet goed voor eiwit-per-EV verschillen, en geen onderscheid maken tussen vervuilende eiwit aggregaten en eiwitten in EV's. Bovendien vereisen deze technieken isolatie van EV, die in veel gevallen maakt vergelijking van EV concentraties in biologische monsters mogelijk.

Daarom zijn pogingen ondernomen om nieuwe methoden die het mogelijk maken voor meer nauwkeurige en directe meting EV ¹⁰ te ontwikkelen. Dit rapport beschrijft het gebruik van afstembare resistieve puls sensing (TRP) voor een betrouwbare kwantificering en grootte profilering van EV's.

Momenteel is de qNano instrument (figuur 1a) is de enige commercieel beschikbare platform voor TRP. In TRP, een niet-geleidend elastisch membraan doorspekt wiste een nano-sized porie is het scheiden van twee vloeistof cellen. Een van de vloeistof cellen is gevuld met het monster van belang, terwijl de andere cel is gevuld met deeltjes vrij elektrolyt. Door een spanning, wordt een ionische stroom / elektrische stroom ingesteld, dat wordt gewijzigd bij de overdracht van deeltjes door de poriën (Figuur 1b). De grootte van deze stroom blokkade (resistief pulse ") komt overeen met het volume van het deeltje ¹¹ (figuur 1c). De duur blokkade kan worden gebruikt om de zeta-potentiaal van deeltjes, die berust op deeltjeseigenschappen zoals lading of vorm ¹² bepalen. Grootte profilering van onbekende deeltjes kan worden uitgevoerd door vergelijking van de resistieve pulsen veroorzaakt door onbekende deeltjes met het resistieve pulsen door kalibratie deeltjes met een bekende diameter. Naast de omvang van een blokkade gebeurtenis, wordt de snelheid waarvan deze zich voordoen gemeten. Dit teltempo relies de deeltjesconcentratie. Aangezien de concentratie en blokkades lineair evenredig ¹³ met een calibratie monster met deeltjes met een bekende concentratie en deeltjesgrootte maakt het meten van de concentratie ¹⁴ en grootteverdeling ¹¹ van een onbekend monster.

De beweging van deeltjes door de nanopore wordt bepaald door electro met kinetische (elektroforese en elektro-osmotische) en vloeibare krachten ^15. Via de variabele druk module (VPM) een drukverschil tussen het fluïdum cellen worden geïnduceerd als een extra kracht. Toepassing positieve druk verhoogt de stroomsnelheid van deeltjes, die van nut kunnen zijn bij de deeltjesconcentratie laag is. Ook kan aangedrukt worden om het effect van elektro-kinetische krachten verminderen. Dit is vooral belangrijk bij het gebruik nanoporiën met een relatief kleine poriediameter (NP100, NP150 en eventueel NP200) zo vaak gebruikt voor de detectie van EV.Om deze nanoporiën, zelfs bij toepassing van aanzienlijke druk, de elektro-kinetische krachten, afhankelijk deeltjesoppervlak wordt, blijft niet te verwaarlozen ^16. Door het meten van het deeltje snelheid meervoudige drukken, een elektro-kinetisch gecorrigeerd, en dus meer accuraat, kan EV concentratie berekend worden.

Hier worden gedetailleerde protocollen verschaft om de grootteverdeling en concentratie van EV bepalen. Naast de reguliere werking protocol, wordt een alternatieve aanpak beschreven waarbij monsters worden verrijkt met polystyreen parels van bekende grootte en concentratie ^17. Deze real-time calibratie kan worden aangewend om bepaalde technische problemen ondervonden bij het meten EV direct in biologische vloeistoffen, zoals urine, plasma en celkweek supernatant, of wanneer de stabiliteit van de nanopore gedurende een lange meettijd kan zijn verzekerd.

Protocol

1 Standard Operating Protocol

1.1 Instrument Setup en Monstervoorbereiding

1. Sluit het instrument aan op een computer met de Izon Control Suite-software geïnstalleerd.
2. Kies de nanopore grootte te gebruiken: voor de omvang en concentratie meting van EVS een NP150 (beoogde omvang range 85-300 nm) of NP200 (beoogde omvang 100 - 400 nm) worden het meest gebruikt. Bij het werken met EV die geïsoleerd zijn volgens een protocol dat verwijdering van grotere EV, bijvoorbeeld omvat door het monster door een 220 nm filter, een NP100 poriëngrootte (doelgrootte 70 - 200 nm) worden gebruikt. Bij het werken met EV in een biologisch monster of EV geïsoleerd met gebruikmaking van een ander protocol, kan het NP200 worden gebruikt, zoals zal verstopt raken minder vaak. Andere nanoporiën zoals NP300 (doelgrootte 150 - 600 nm) of NP400 (doelgrootte 200 - 800 nm) of zelfs groter nanoporiën kunnen worden gebruikt voor grotere soorten EV.
3. Kies het polystyreen calibratie deeltjes die het in stap 1.1.2 nanopore aanvullen. Voor een NP100, NP150 en NP200 nanopore gebruik de CPC100, CP100 en CPC200 deeltjes, respectievelijk. Voor een nauwkeurige grootte schatting, ervoor te zorgen dat de kalibratie deeltjes hebben een vergelijkbare grootte als de onbekende deeltjes.
4. Om de homogeniteit van de kalibratie deeltjes, vortex kort (30 sec) te waarborgen. Eventueel toepassing sonicatie aggregaten te verwijderen.
5. Verdun de kalibratie deeltjes in PBS om de doelconcentratie in een volume van ten minste 40 pl. Opmerking: Het doel concentratie varieert op basis van het in stap 1.1.2 nanopore. Doelconcentraties worden geleverd met de nanoporiën.
6. Toepassen en is rechtstreeks verwijderen 78 ul van PBS op de onderste vloeistof cel; deze bevochtiging van het onderste fluïdum cel vermindert het risico van luchtbelvorming onder nanopore bij de toepassing van een elektrolyt aan het onderste fluïdum cel wanneer de nanoporiën in stand.
7. Plaats de nanopore op de 4 armen van het instrument. Gebruikde digitale schuifmaat de afstand tussen twee verschillende armen meten en voer de afstand in mm in de "Stretch" invoerveld en klik "kalibreren stretch" om de nanoporiën rek kalibreren.
8. Rek de nanopore tot 47 mm, aan de zijde te draaien en dus de afstand tussen de tegenoverliggende armen van het instrument, voordat opnieuw aanbrengen 78 pl PBS om de onderste vloeistof cel.
   Opmerking: Elektrische interferentie kan de kwaliteit van de metingen aanzienlijk beïnvloeden. Bij het gebruik van een laptop op de Izon Control Suite software te draaien, zorg ervoor dat de laptop is aangesloten op het elektriciteitsnet via een geaard stopcontact en de stekker. Mobiele telefoons dicht op het instrument kan ook een elektrische interferentie. Elektrische interferentie wordt waargenomen als steeds herhaalde pieken in de basislijn huidige, vaak met root mean square (RMS) geluid> 10 Pa.
   Opmerking: Bijna elke buffer kan worden gebruikt voor de kalibratie deeltjes en EVs voor TRPS karakterisering verdunnensatie. De aanwezigheid van zouten is een voorwaarde voor instelling van een elektrische stroom. Voor EV metingen gebruiken PBS als een buffer. Kalibratie deeltjes moet altijd worden verdund in dezelfde buffer als de EV om nauwkeurige metingen te garanderen.

1.2. Bepaal de optimale instellingen voor de meting

Opmerking: Voordat u gaat opnemen, is het belangrijk om een ​​optimale meting instellingen vast te stellen. De blokkade magnitude door een deeltje dat door de nanopore is afhankelijk van de uitgeoefende rek en spanning. Voor betrouwbare metingen moet de RMS ruis <10 pA en de modus blokkade magnitude moet> 0,1 nA.

1. Plaats de bovenste fluïdum cel en afscherming kooi op de nanoporiën en 40 gl verdunde kalibratie deeltjes introduceren in het bovenste fluïdum cel. Gebruik de VPM te ≥0.8 kPa overdruk van toepassing.
2. Verlaag de uitgeoefende rek langzaam naar 44 mm terwijl analyseren blokkade gebeurtenissen door de kalibratiedeeltjes. Opmerking: Bij het verminderen van de porie diameter van de beweging van deeltjes door de nanopore zullen minder snel en dus het deeltje tempo zal afnemen. Vanwege verhoogd relatief blokkade van de poriën een grotere blokkade gebeurtenis plaatsvindt, resulteert in verbeterde signaal-ruisverhouding. Het verhogen van de spanning kan verder de blokkade grootte maar ook de RMS ruis.
3. Verminder het traject tot geschikte blokkade gebeurtenissen (figuur 1c) worden waargenomen in de "Signal Trace"-paneel. (Mode> 0,1 nA) en de bijbehorende deeltje bedraagt> 100 / min. Opmerking: Het deeltje bedraagt ​​minder strenge cut-off, maar zoals metingen van ten minste 500 deeltjes ideaal zal deeltje snelheden van <100 / min opnemen duur van ten minste 5 min veroorzaken. Deeltjes groter dan in 2000 / min kan resulteren in minder nauwkeurige metingen (indien aanwezig, dient monsterverdunning worden uitgevoerd).

1.3 Meting van de kalibratieDeeltjes, Wassen van de Uper Fluid Cell en Sample Measurement

1. In dit gedeelte EV uit de celkweek supernatant van de glioblastoma multiforme cellijn U87-MG / EGFRvIII kenmerken. De isolatie en bereiding van deze EV is eerder beschreven en gevisualiseerd ^18.
2. Plaats de kalibratie deeltjes in de bovenste fluïdum cel. Oefen druk (bijvoorbeeld 0,8 kPa) met behulp van de VPM en opnemen> 500 deeltjes.
3. Bij het uitvoeren van een multi-drukmeting, verhogen de uitgeoefende druk (bijvoorbeeld tot 1,0 kPa) en registratie van een tweede kalibratiebestand. Opmerking: Een minimum van 0,2 kPa verschil vereist.
4. Verwijder het kalibratiemonster van de bovenste fluïdum cel. Was de bovenste fluïdum cel 3 maal met 100 pi PBS om resten te verwijderen. Vóór de invoering van het monster in de bovenste vloeistof cel, gebruikt niet-pluizende tissue om eventueel resterende PBS van de bovenste vloeistof cel verwijderen.
5. Introduceer het monster op de bovenste vloeistof cel. Zorg ervoor dat de basislijn stroom is binnen 3% van de basislijn huidige waargenomen bij het meten van de kalibratie deeltjes. Indien niet binnen de 3%, gelden de hieronder beschreven aan de basislijn huidige stabiliseren strategie. Breng de exacte druk zoals toegepast op de kalibratie deeltjes en noteer de voorbeeldbestanden.
   Opmerking: Het deeltje tarief perceel moet constant deeltjesdetectie (Figuur 2a) weer te geven. In geval van een plotselinge onderbreking van de deeltjes detectie, een plotselinge daling van de basislijn huidige, of een plotselinge toename van de RMS ruis, kan de porie verstopt zijn; dus pauzeren opname. Om de basislijn, kraan herstellen of draai de afscherming kap, de zuiger toe te passen of volledig te verwijderen van de nanogaatje en was het met gedemineraliseerd water en plaats deze op het instrument.
   Opmerking: Als alternatief, verhoging van de nanogaatje stretch tot 47 mm in combinatie met een maximale druk van de VPM voor ongeveer 5 minuten.

1.4 Data-analyse

1. Klik op de "; Analyseren deGegevenstabblad "naar de sectie analyse van de software voeren. Verwerk de kalibratie en voorbeeld bestanden door met de rechtermuisknop te klikken op de "Onverwerkt Files" en te kiezen voor "Process Files".
2. Klik op het selectievakje naast het monster in de "gekalibreerd" kolom te koppelen van de voorbeeldbestanden om de kalibratie-opnames. Selecteert u de juiste monster en kalibratie-bestanden en klik op "OK". Opmerking: bij gebruik van de optie multi-drukkalibratie selecteer de "Multi-druk Kalibratie" tab aan de linkerkant voor echtpaar meerdere monsters om meerdere kalibratie-bestanden.
3. Eenmaal succesvol gekoppeld, zal de Izon Control Suite software verschillende sample kenmerken zoals een grootte-verdeling (Figuur 2b) weer te geven, basislijn duur, volle breedte half maximum (FWHM) en een concentratie analyse. Optioneel: Voor elk monster, individuele datapunten kunnen worden geëxporteerd als een door komma's gescheiden bestand.

2.LTERNATIEVE Protocol - Spiking Monsters met Calibration Beads

Opmerking: In het algemeen, kan de standaard werkwijze worden bij het werken met geïsoleerde EVs. Bij het werken met niet-geïsoleerde EVs in biologische monsters, of geïsoleerde EV voorbereidingen besmet met groot eiwit aggregaten, de bediening van de instrumenten kan een uitdaging zijn. Deze uitdagingen bestaan ​​voornamelijk uit een hoog percentage van nanopore blocking (plotselinge daling van de basislijn stroom), onvermogen om de uitgangssituatie stromen herstellen binnen 3% van kalibratiemeting of significante verschillen in deeltje tarieven tussen identieke monsters (figuur 3a). Voor monsters weergeven van deze problemen een alternatief protocol om EV's te kwantificeren werd ontwikkeld ^17. Deze methodologie is gebaseerd op de introductie van grotere polystyreenijking kralen in de steekproef van belang (figuur 3b). Een gedetailleerde procedure voor dit alternatieve protocol wordt hieronder besproken.

2.1. MonsterVoorbereiding

Opmerking: Bij de voorbereiding van monsters met behulp van de alternatieve werkwijze is het gewenst om een ​​EV-to-bead verhouding van ongeveer 1 ook vastgesteld, is het essentieel om een ​​"kalibratie bead slechts 'omvatten sample, zodat nauwkeurige' gating 'van de kalibratie kralen en het aantal achtergrond deeltjes (bijvoorbeeld eiwit aggregaten) in de buffer bepalen.

1. Centrifuge 100 ul celkweek supernatant gedurende 7 min bij 300 xg
2. Voeg 20 ul van de supernatant aan 20 ui PBS en 10 ui 75 keer verdund 335 nm polystyreen kralen (stock 7e10 / ml).

2.2. Voorbeeld Meting

1. Gebruik de in paragraaf 1.2 beschreven strategie om de optimale instellingen instrument te bepalen.
2. Meet de 'kalibratie kraal slechts' monster eerst. Controleer of de achtergrond detectie van kleine niet-bead deeltjes zo laag mogelijk (<10% van de korrels).
3. Meet elke individuele sample keer eerder opnemen repliceert om fluctuatie distribueren nanopore omstandigheden gelijkmatig over de verschillende monsters. Meet minstens 3 replicaten van elk monster.
4. Meet het 'kalibratie kraal slechts' monster na het beëindigen van de registratie van alle monsters.

2.3. Data Analysis

Opmerking: Bij het gebruik van de alternatieve protocol, maakt exclusief gebruik van de Izon Control Suite software niet voldoende voor de concentratie berekening. Aanvullende spreadsheet software vereist. Tabel 1 geeft een voorbeeld van de berekening van de concentratie in figuur 3 monsters.

1. Open het 'kalibratie kraal slechts' monster en een of meerdere voorbeeld bestanden.
2. Bepaal welke blokkade event grootte (in nA) kan gebruikt worden als een cut-off voor het onderscheid tussen EV en polystyreen parels. Bepaling van de blokkade waarde (nA) gevonden volgens de linkerkant basis van polystyreen korrels populatie ( figuur 3b). Let op: zorg voor een gelijke instelling van de bin-maten van alle metingen (kan worden aangepast in 'ViewSettings', die toegankelijk is door te klikken op de "pop-up" knop onder "Individuele Blokkade Trace").
3. Haal de waarden van het totale aantal deeltjes voor elk monster door te klikken op de "Particle Analysis Samenvatting" tab van het monster.
4. Filter de datasets met behulp van de cut-off niveau bepaald in stap 2.3.2. door het selecteren van de "Data Filtering" pop-up. Beeldscherm deeltjes alleen kleiner dan de cut-off.
5. Haal de waarden van de telling ES voor elk monster van de "Particle Analysis Summary".
6. Trek de hoeveelheid van EV van de totale deeltjes tot de kalibratie vloeistof kralen bepalen.
7. Bepaal de EV-to-bead-ratio bij ES count te delen door kalibratie kralen tellen.
8. Bepaal de gemiddelde achtergrond verhouding door het gemiddelde van de bepaald voor elke & ratio's# 8220; kraal only "kalibratiemonster. Trek deze waarde van de afzonderlijke monsters.
9. Vermenigvuldig gecorrigeerde EV naar bead verhouding van de concentratie van kalibratie kralen om de concentratie van EV voor elk monster.
10. Vermenigvuldig de concentratie uit stap 2.3.9 door ES verdunningsfactor die door de toevoeging van kalibratie kralen om de EV monster. Opmerking: In het voorbeeld sample opstart, de totale verdunning van het monster in PBS en kalibratie kralen 2,5 maal en dus de concentratie in stap 2.3.9 worden vermenigvuldigd met 2,5 om de ruwe ES monsterconcentratie bepalen.
11. Bereken statistieken zoals het gemiddelde, de standaarddeviatie en de standaardafwijking van het gemiddelde voor elke groep van herhalingen.
    Opmerking: in sommige gevallen overlappen tussen EVS en spiked polystyreen parels wordt waargenomen. Als correctie voor de onderschatting van EV concentratie vereist is, moeten de monsters zonder spiked polystyreen korrels ook worden gemeten. Gebruik dezelfde cutoff zoals bepaald in stap 2.3.2 een "bead-to-EV" verhouding bepalen de verhouding van EV die binnen het bereik van het verrijkte polystyreen kralen vallen berekenen. Deze kraal naar EV verhouding worden toegevoegd aan de EV-to-bead verhouding bepaald in stap 2.3.8.

2.4. Optioneel: EV Size Distribution Met behulp van de alternatieve methode.

1. Open een monster opname twee keer in de Control Suite Software.
2. Stel de filteropties van een van de monsters om alleen deeltjes groter zijn dan de cut-off hierboven bepaald. Dit zal de kalibratie deeltjes alleen weer te geven.
3. Stel het gefilterde monster "kalibratie file" en voer de modus grootte van de kalibratie kralen.
4. Koppel het monster bestand en de "calibratie bestand" gemaakt in stap 2.4.3, zoals beschreven in 1.4.2. De sample bestand zal nu een grootteverdeling van zowel EV's en kalibratie kralen op basis van de spiked kalibratie kralen weer.
   Opmerking: De standaard operating protocol meestal voldoende voor de bepaling van grootte-verdelingen van EV. Soms echter precies buffer componenten zijn bekend (bijvoorbeeld plasma of urine) die het onmogelijk om een ​​fragment van kalibratie kralen in dezelfde buffer als de EV plaats bereiden. Een EV monster verrijkt met kalibratie deeltjes kan worden gebruikt voor EV grootte-schatting in deze specifieke omstandigheden.

Results

De TRP instrument een niet-geleidend nanopore heeft op de 4 armen van de machine (Figuur 1a) worden gebracht en een spanning (figuur 1b) worden toegepast. Zodra een basislijn elektrische stroom wordt gevestigd, zal resistieve pulsen veroorzaakt door deeltjes die door de porie worden gedetecteerd als geïllustreerd in figuur 1c.

EV's werden gezuiverd uit de celkweek supernatant van de glioblastoma cellijn U87-MG / EGFRvIII door ultracentrifugatie. Een stabiele deeltje rate-plot wordt waargenomen bij het ​​meten van de geïsoleerde EV's (Figuur 2a) op een NP100 nanogaatje. Deze stabiele deeltjes tarief-perceel is nodig voor een betrouwbare EV meting van de concentratie. Na het koppelen van de EV-sample opname een opname van 115 nm polystyreen ijking kralen, een grootteverdeling (figuur 2b) en concentratie raming van de EV-monster kan worden verkregen (gegevens niet getoond).

EV's werden ook direct gekwantificeerd in glioblastoma celkweeksupernatant. Bij het ​​meten van EV's in biologische monsters, nanopore verstopping resulteert vaak in onderbrekingen en / of schommelingen in deeltje tarief percelen (Figrue 3a). Dit resulteert in onnauwkeurige EV ramingen van concentraties. Door spiking het monster met polystyreen kralen van bekende concentratie en de grootte kan een EV-to-bead verhouding bepaald. Figuur 3b toont de verkregen na spiking celkweek supernatant met polystyreen kralen van 335 nm in grootte resultaten. Twee duidelijke populaties worden waargenomen. De deeltjes induceren van een blokkade van minder dan 0,46 nA zijn vastbesloten EV's, de grotere deeltjes worden bepaald polystyreen parels. De verhouding van EV polystyreen korrels wordt gebruikt om de ruwe concentratie van EV (tabel 1) te berekenen. Figuur 3c illustreert de grootte schatting van de twee populaties op basis van de puntige polystyreen korrels. De nanopore setup gebruikte regeraadpleegd in de detectie van EV> 140 nm in grootte. Dit kan worden verlaagd door het verminderen van de nanopore opening, maar dit zal resulteren in meer verstopping events.

Figuur 1: qNano instrument en de wijze van exploitatie. (A) Foto van het instrument. Een nanopore wordt op het instrument, het scheiden van een lagere fluïdum cel uit een bovenste vloeistof cel. De vloeistof cellen worden beschermd tegen milieu-elektrische interferentie door de afschermkap. (B) Illustratie waarin instelbare weerstand puls sensing (TRP). Een niet-geleidende elastische nanopore scheidt twee fluïdum cellen. Door een spanning een elektrische stroom wordt vastgesteld door de porie doorboord in de nanoporiën. Als extracellulaire blaasjes bewegen door de nanopore, wordt de ionische stroom veranderd en gedetecteerd als een resistief puls. In TRP de openingsafmeting van de nanoporiën kan worden afgestemd (verlaagd of verhoogd) door strekken de nanopore door de afstand tussen de tegenover elkaar gelegen armen van het instrument, of verminderen deze afstand. (C) Illustratief voorbeeld van resistieve pulsen. De omvang van een enkele resistieve puls is evenredig met het volume van het deeltje:. Grotere impulsen geven grotere deeltjes Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: aantal deeltjes-plot en de grootte-verdeling verkregen van het meten van geïsoleerde EV's van U87-MG / EGFRvIII celkweeksupernatant (A) Particle count-plot aangeeft totale constante deeltjesdetectie.. Korte vermindering van particle detectie werd waargenomen tussen 80 en 100 sec opname. Na het pauzeren van de opname en het tikken van de afschermkap, het deeltje gestabiliseerd, waarna de opname werd hervat. (B) De grootteverdeling van geïsoleerde elektrische auto is uitgezet na het kalibreren van het onbekende monster (EV's) tot 115 nm polystyreenijking kralen. (5 nm bin formaat). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3: TRP kwantificering van EV in celcultuur supernatant de alternatieve protocol. (A) Typisch particle-tarief plots verkregen bij het ​​meten van elektrische auto's direct in een biologische vloeistof. Porie verstopping veroorzaakt korte onderbrekingen en schommelingen in de snelheid van de deeltjes detectie. Elkeperceel is een herhaalde meting van hetzelfde monster. (B) drie gelijke grootte-distributie grafieken verkregen na stekelige celkweeksupernatant met 335 nm polystyreenijking kralen. Alle deeltjes induceren een weerstandsbelasting pulsduur korter dan 0,46 nA worden geselecteerd EV. (C) De puntige polystyreen kralen kunnen worden gebruikt om een maat-verdeling van het monster te verkrijgen. (5 nm bin formaat). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Meting	Kalibratie alleen # 1	Kalibratie alleen # 2	Supernatant nr.1	Supernatant nr.2	Supernatant # 3
Gemiddelde stroom (nA)	117	120	116	118	120
Deeltje tarief	172	194	250	246	196
cutoff gebruikt (nA)	0.46	0.46	0.46	0.46	0.46
Totaal deeltjes	303	317	489	488	454
Extracellulaire blaasjes	3	1	213	215	213
Spiked kalibratie kralen	300	316	276	273	241
EV / kalibratie kralen	0.01	0.003	0.772	0.788	0.884
Voorbeeld - achtergrond			0.765	0.781	0.877
Extracelullar blaasjes (10 7) / Ml			7.14	7.29	8.18
Monster 2.5x verdund
Raw concentratie EV's (10 7) / ml			17.85	18.22	20.46

Tabel 1:. Voorbeeld berekening van EV concentratie met behulp van de alternatieve protocol A cut-off waarde is vastbesloten om EV's te onderscheiden van de kalibratie kralen. Vervolgens kan het totale aantal van EV en kralen teruggevonden. Voor elke meting de EV-to-bead verhouding wordt berekend. De hoogte van de achtergrond deeltjes in de elektrolyt (bijvoorbeeld eiwit aggregaten) wordt berekend door het gemiddelde van de EV-to-bead-ratio voor de individuele metingen van de 'kalibratie kralen slechts' monster. Voor elk monster de achtergrond verhouding wordt afgetrokken van de verkregen verhouding. Dit adjusted verhouding wordt vermenigvuldigd met de concentratie van de kalibratie korrels in het monster (in dit voorbeeld: 9.33e7 / ml). De ruwe concentratie van EV bepalen, wordt de verkregen concentratie vermenigvuldigd met het totale EV verdunningsfactor (in dit voorbeeld 2.5).

Discussion

De in dit manuscript aanbod methoden voor kwantificering en grootte karakterisering van EV's met behulp van TRP beschreven protocollen. De belangrijkste voordelen van de TRP platform zijn de kleine steekproef, relatief korte meettijd en het ontbreken van vereiste monstervolume manipulatie.

Voorwaarde voor nauwkeurige TRPS meting is om voorwaarden die identiek zijn tussen kalibratie en sample metingen houden. Dit omvat het gebruik van identieke buffers en identiek instrumentinstellingen, zoals nanopore grootte, spanning en toegepaste druk. De originele VPM ontbreekt een mechanisme voor de exacte instelling van de toegepaste druk, waardoor wordt veroorzaakt kleine verschillen in de toegepaste druk tussen de monsters. Ook kan verdamping van priming fluïdum in de VPM kleine drukverschillen veroorzaken bij het meten op verschillende tijdstippen en VPM derhalve dikwijls opnieuw gevuld. Deze beperkingen zijn mogelijk opgelost door invoering van de VPM2 dieheeft een klik op basis van schaalvergroting en is de luchtdruk gebaseerd.

Het alternatief protocol in dit manuscript beschreven is bijzonder geschikt voor het meten van EV in niet gezuiverde biologische monsters ^17. Wij geloven dat buffer componenten, zoals suikers, lipiden, eiwitten en andere grotere brokstukken, kan in sommige gevallen beïnvloeden de meetomstandigheden te veel voor het standaardprotocol toepassing. Toevoeging van kalibratie kralen om het monster in plaats van het vergelijken van twee afzonderlijke metingen introduceert 'real time kalibrering'. Deze methode is vooral geschikt bij het ​​vergelijken van monsters (bijvoorbeeld bloedplasma van verschillende donoren) die verschillende en / of onbekende vloeibare inhoud achtergrond hebben. Hoewel er verschillen zijn tussen de EV en polystyreen deeltjes (bijvoorbeeld deeltjes dichtheid en oppervlakte lading), theoretische modellen en experimentele gegevens onderstrepen de bruikbaarheid van polystyreen parels voor de kwantificering en de grootte profilering van EVS,onder de voorwaarde dat er aanzienlijke druk wordt uitgeoefend ^15,19. Om de invloed van elektrokinetische krachten te minimaliseren, is het gebruik van de relatief grote NP150 / NP200 nanopore en significant positieve druk aangeraden.

EV's en kalibratie kralen onderscheiden zich door de grootte. Bijgevolg nanopore moet geopend worden door middel rek, een diameter waarbij detectie van EV en grotere kalibratie deeltjes waargenomen. Sinds de opening van de poriën van de gevoeligheid voor kleinere deeltjes zal afnemen, EVS alleen groter dan een bepaalde grootte worden opgenomen (vaak EV> 120 nm bij gebruik van een 335 nm kalibratie kraal). De minimum detectielimiet voor EV's kunnen worden verlaagd tot ongeveer 90 nm, met behulp van 203 nm kalibratie kralen op een NP150 nanogaatje. Echter, kan deze setup niet levensvatbaar zijn als grotere EV's veroorzaken frequente verstopping van de nanogaatje. De aanwezigheid van deze belemmeren EV kan het gebruik van een opstelling dwingen waarbij een populatie van EV, te klein om te reach de detectiegrens, niet zal worden gedetecteerd.

De moeilijkheid van het systeem toeneemt werking wanneer het proberen om deeltjes kleiner dan 100 nm te meten. In dat geval kan de detectie worden verbeterd door de zoutconcentratie van de elektrolyt. Een verhoogde ionenconcentratie relatief verhoogde blokkade magnitudes voor kleine deeltjes (grotere signaal-ruisverhouding) induceren. De haalbaarheid van deze techniek voor het meten van elektrische voertuigen moet echter worden gevalideerd, zoals verhoogde zoutconcentraties het volume van de EV's kunnen beïnvloeden.

Concluderend kan het TRP-platform worden gebruikt voor directe kwantificering en grootte karakterisering van EV's. Aangezien er geen isolatie of EV manipulatie (antilichaambindingsonderzoeken of fluorescerende labeling) is vereist, het platform is geschikt voor directe EV kwantificering in biologische vloeistoffen. Een alternatief protocol verschaft die nuttig zijn voor monsters kunnen zijn wanneer buffercomponenten induceren significante porie Clogging gebeurtenissen, waardoor betrouwbaar gebruik van het standaard protocol niet levensvatbaar.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
qNano instrument	Izon Science Ltd.	N/A
Variable pressure module	Izon Science Ltd.	N/A
Nanopore	Izon Science Ltd.	NP100, NP200	Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes.
Calibration Particles	Izon Science Ltd.	CPC100, CPC200, CPC400	Calibration particles are available in different sizes.
Sonication bath	Multiple available		Basic sonication bath is sufficient
(Mini) vortexer	Multiple available
Lift-free tissues	Multiple available
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Multiple available
Windows based computer
Izon Control Suite 2.2	Izon Science Ltd.	N/A
Spreadsheet Software	Multiple available	N/A