Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Het gebruik van TL-Target Arrays voor het beoordelen van de T-cel responsen

14.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51627

⸱

19 juni 2014

 ,  ,  , 
1Department of Immunology, John Curtin School of Medical Research, Australian National University

In dit artikel

Samenvatting

Het vermogen om T-cel responsen in detail volgen in vivo is belangrijk voor de ontwikkeling van ons begrip van de immuunrespons. Hier beschrijven we het gebruik van fluorescerende doel arrays (FTA's) in een in vivo T-cel test die> 250 parameters beoordeelt gelijktijdig door flowcytometrie.

Samenvatting

Het vermogen om T-cel responsen in vivo monitoren is belangrijk voor de ontwikkeling van ons begrip van de immuunrespons en het ontwerp van immuuntherapie. Hier beschrijven we het gebruik van fluorescerende doel array (FTA) technologie, die vitale kleurstoffen zoals carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE), violette laser prikkelbaar kleurstoffen (CellTrace Violet: CTV) maakt gebruik van en rode laser prikkelbaar kleurstoffen (Celproliferatie Dye eFluor 670: CPD ) naar label muis lymfocyten combinatorieel in> 250 waarneembaar fluorescerende cel clusters. Cell clusters binnen deze overeenkomsten kunnen worden gepulst met major histocompatibility (MHC) klasse-I en MHC klasse-II-bindende peptiden en daardoor fungeren als doelcellen respectievelijk CD8 + en CD4 + T-cellen. Deze FTA cellen levensvatbaar blijven en volledig functioneel, en derhalve worden toegediend in muizen beoordeling van CD8 + T-cel gemedieerde doding van doelwitcellen FTA en CD4 + T-cellen nagedacht hel toestaanp FTA B cel doelcellen in real time in vivo door flowcytometrie. Sinds> 250 doelcellen kan worden beoordeeld in een keer, de techniek maakt het monitoren van T-cel responsen tegen meerdere antigeen epitopen bij verschillende concentraties en in meerdere herhalingen. Als zodanig kan de techniek T-cel responsen te meten zowel kwantitatief (bijvoorbeeld de cumulatieve grootte van de respons) en een kwalitatieve (bijv.. Functionele aviditeit en epitoop-kruisreactiviteit van de respons) niveau. Hierin beschrijven we hoe deze FTA geconstrueerd en geven een voorbeeld van hoe ze kunnen worden toegepast om T-cel responsen geïnduceerd door een recombinant pokkenvirus vaccin te beoordelen.

Inleiding

T-cellen spelen een centrale rol bij de adaptieve immuunrespons en zijn vaak gericht op manipulatie immunotherapie. CD4 + effector-T-cellen reageren op vreemd antigeen door het afscheiden van cytokines dat veel aspecten van de immuniteit regelen en kan ook direct helpen B-cellen om antistoffen te produceren. CD8 + cytotoxische T-cellen (CTL) kunnen ook reageren op vreemd antigeen door het afscheiden van cytokines, evenals een centrale rol spelen in het direct doden van cellen die een vreemd antigeen. De fundamentele interactie die deze T cel effectorfuncties initieert houdt de interactie van de T cel receptor (TCR) met vreemde peptiden die op MHC moleculen op het oppervlak van cellen. CD4 + T-cellen herkennen peptiden die op MHC klasse II moleculen op antigeen presenterende cellen en CD8 + T-cellen herkennen peptiden die op MHC klasse-I-moleculen die doorgaans worden weergegeven microben geïnfecteerde cellen.

In ordede rol van T-cellen spelen een immuunrespons te beoordelen, is het essentieel dat de effectorfuncties worden gemeten door betrouwbare en gevoelige technieken. Gemeenschappelijke methoden voor de beoordeling van T-cel respons op te nemen; MHC class-I/II/peptide tetramer reactiviteit; cytokine productie door ELISPOT en intracellulaire cytokine kleuring; en doden capaciteit met 51Cr afgifte assays. Deze testen zijn echter meestal ex vivo uitgevoerd met in vitro stimulatie, of om beperkt inzicht in T-celfunctie. Idealiter bij het ​​meten van T celresponsen het nuttig om te beoordelen in situ in vivo zou zijn als ze zich voordoen, zonder manipulatie van T-cellen om veranderingen in de functionele parameters die kunnen optreden door in vitro stimulatie voorkomen. Enkele van de meest gebruikte in vivo T-cel functionele assays zijn gebaseerd op het meten van CTL gemedieerd doden van doelcellen gepulseerd met MHC klasse I-bindende peptiden, die in vivo worden opgesomdvia hun opsporing door fluorescentielabelling met vitale kleurstoffen zoals CFSE. Hoewel deze soorten tests kunnen controleren CTL gemedieerde doden van doelen als ze gebeuren in vivo, hebben ze eerder een relatief beperkte capaciteit doden van meerdere doelen presenteren verschillende concentraties en verschillende peptide-epitopen, die nodig is om kwalitatieve parameters toelaten na als functionele avidity en epitoop variant kruisreactiviteit worden beoordeeld. Deze testen tonen geen enkele informatie op CD4 + T-cel gemedieerde responsen.

Om veel van de beperkingen met de huidige methoden voor T cel responsen bepalen overwinnen, hebben wij onlangs een multiplex assay gebaseerd op fluorescente doel arrays (FTA), die de controle van T-cel responsen tegen> 250 doelcellen gelijktijdig kan in een dierlijke flowcytometrie 1, 2. Vrijhandelsovereenkomsten bestaan ​​uit lymfocyten gelabeld met SEVmene concentraties en combinaties van vitale kleurstoffen zoals CFSE, CTV en CPD toestaan> 250 celgroepen unieke fluorescentie te genereren. Aangezien deze cellen levensvatbaar en volledig functioneel blijven, kunnen ze worden geïnjecteerd in dieren controle van hun interactie met effector T-cellen in vivo 3 mogelijk. Bijvoorbeeld kan de FTA celclusters worden gepulseerd met MHC-klasse I-bindende peptiden voor de beoordeling van antigeen-specifieke CTL gemedieerde doding van doelwitcellen 1 mogelijk. Bovendien kan de FTA celclusters worden gepulst met MHC klasse II-bindende peptiden, waardoor beoordeling van antigeen specifieke T-helper cel activiteit (TH) door beoordeling activatie (door aanslag van activatie merkers zoals CD69, CD44 en / of CD62L) van B-cellen binnen de FTA lager verwante peptide 2. Al meer dan 250 doelen tegelijkertijd kan worden gedetecteerd, is het mogelijk om CTL en TH-responsen tegen vele doelwitcel clusters gepulseerd met n metenumerous peptiden in verschillende concentraties en de opname van vele herhalingen. De FTA test geeft dan ook een ongekend niveau van T-cel effector respons evaluatie in vivo.

Hier beschrijven we in detail de constructie van een FTA zien hoe ze kunnen worden toegepast op de beoordeling van T-cel responsen in vivo. De procedure beschrijft de constructie van een FTA bestaat uit 252 waarneembare celgroepen door middel van drie essentiële kleurstoffen, bestaande uit 6 herhalingen van 42 celgroepen gepulst met MHC klasse-I en II-bindende peptiden. De etikettering van 42 celgroepen optreedt in 10 ml conische buisjes bodem en het is nuttig te leggen die in een buis rek zoals aangegeven in tabel 1. Deze methode kan worden aangepast voor kleinere aantallen onderscheiden clusters zoals vereist door de hoeveelheid etikettering van elke kleurstof uitgevoerd 1.

We benadrukken het nut van de test door te laten zien hoe deze respons kan metenes gegenereerd door recombinant pokken-virus vaccinatie tegen meerdere epitopen in een klein cohort van muizen. Hieruit blijkt dat het FTA test kan worden gebruikt om cumulatief reacties en functionele aviditeit meten door respectievelijk het gebruik van de oppervlakte onder de curve (AUC) evaluatie en meting van effectieve peptide concentratie vereist om half-maximale respons (EC 50) te genereren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerking: Muizen gebruikt onder dit protocol werden behandeld volgens de richtlijnen van de Australian National University Dierproeven Ethische Commissie en muizen werden gedood door cervicale dislocatie.

1. Dye en Peptide Voorbereiding

  1. Kleurstofpreparaat
    Opmerking: Kleurstoffen zijn voorverdunde bij verschillende concentraties aan etikettering van cellen op discrete fluorescentie-intensiteiten mogelijk te maken. CFSE wordt gebruikt zeven concentraties die via 3,5-voudige seriële verdunningen en CTV en CPD worden gebruikt op zes verschillende concentraties die via 3,7-voudige seriële verdunningen (zie tabellen 2-4). De stock concentraties in de tabellen 2-4 vermelde kleurstoffen worden gebruikt om doelcellen etiketteren de uiteindelijke kleurstof concentraties in Tabellen 2-4 weergegeven. Kleurstoffen reageren bij blootstelling aan waterige oplossing. Het is daarom belangrijk dat flesjes geëquilibreerd tot kamertemperatuur vóór opening blootstelling kleurstoffen condensvorming minimaal.
    1. CFSE
      Opmerking: CFSE wordt gekocht als carboxyfluoresceïne diacetaat succinimidylester (CFDA, SE; MW 557,47), meestal bij 25 mg / flacon.
      1. Resuspendeer 25 mg CFSE in 4,48 ml DMSO om een ​​10 mM voorraad oplossing te verkrijgen.
      2. Serieel verdund CFSE Voeg 35 ul van 10 mM stock CFSE in 87,5 ul DMSO en herhaal deze met verdunde voorraadoplossing aan elke kleurstof concentratie geven in tabel 3.
    2. CTV
      Opmerking: CTV wordt meestal gekocht in verpakkingen van 9 flesjes, die elk kunnen worden opgelost in 10 pl van DMSO tot een 10 mM oplossing van de kleurstof genereren.
      1. Reconstrueren en bundelen alle 9 flacons van CTV met 90 ul van DMSO om een ​​10 mM oplossing.
      2. Serieel verdund CTV Voeg 11 ul van 10 mM stock CTV in 29,7 ul DMSO en herhaal deze met verdunde voorraadoplossing aan elke kleurstof concentratie geven in tabel 2.
    3. CPD
      Opmerking: CPD (MW 792,6) is een typisch voorbeeldly gekocht als 0,5 mg / flacon.
      1. Resuspendeer 0,5 mg CPD in 63 ml DMSO om een ​​10 mM oplossing te krijgen.
      2. Serieel verdund CPD Voeg 11 ul van 10 mM stock CPD in 29,7 ul DMSO en herhaal deze met verdunde voorraadoplossing aan elke kleurstof concentratie geven in tabel 4.
        Opmerking: Dye voorraden kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C gedurende verscheidene maanden en kan meerdere malen worden ontdooid en opnieuw ingevroren zonder significant verlies van functie.
  2. Peptidepreparaat
    Opmerking: MHC klasse I-bindende peptiden worden gewoonlijk gebruikt om doelcellen puls op 6 verschillende concentraties bereid met 10-voudige verdunningen van een beginconcentratie van 1 pM (Tabel 5). MHC klasse II-bindende peptiden worden gewoonlijk gebruikt om doelcellen puls op 6 verschillende concentraties bereid met 3-voudige verdunningen van een beginconcentratie van 400 pM (Tabel 5). Elk peptide wordt gemaakt op 2x uiteindelijke concentratie in PBS dergelijke that elke peptide concentratie heeft een minimaal volume van 250 ul. Peptide voorraden kunnen worden opgemaakt voor FTA constructie en bewaard bij -20 ° C zonder significant verlies van functie.
    1. Het voorbereiden voorraad MHC klasse-I-bindende peptiden
    2. Bereid de hoogste concentratie van elk peptide epitoop 2 uM voorraadoplossingen (2x 1 uM)
    3. Serieel verdunnen MHC-klasse I-bindende peptiden: voeg 44,4 ul van 2 uM peptide voorraad oplossing in 400 pi PBS. Herhaal dit met verdunde voorraadoplossing elk peptide concentratie geven in Tabel 5.
    4. Het voorbereiden voorraad MHC klasse-II-bindende peptiden
    5. Bereid de hoogste concentratie van elk peptide epitoop 800 uM voorraadoplossingen (2x 400 uM).
    6. Serieel verdunnen MHC klasse-II-bindende peptiden: voeg 150 ul van 800 uM peptide oplossing in 300 pi PBS. Herhaal dit met verdunde voorraadoplossing elk peptide concentratie geven in Tabel 5 .

2. FTA Voorbereiding

Opmerking: De onderstaande procedure beschrijft de constructie van een FTA bestaande cellen gepulseerd met 7 verschillende peptide-epitopen op 6 verschillende concentraties (bijvoorbeeld 42 celgroepen.) Herhaald 6 keer tot 252 waarneembare celgroepen genereren. Binnen elke herhaling, een cel cluster niet gepulst met enige epitoop (Nil), is opgenomen als controle. Het is nuttig voor vrijhandelsovereenkomsten een CD45 allotype verschil hebben van gastheerdieren hun discriminatie van ontvangende cellen mogelijk door antilichaamidentificatie bij de analyse. Anders vrijhandelsovereenkomsten kan met andere kleurstoffen zoals PKH-26 voor dit doel (in stap 2.6 omschreven) worden geëtiketteerd. Meestal wordt de FTA voorbereidingsprocedure van begin tot einde uitgevoerd tijdens een vergadering.

  1. Label 42, 10 ml conische bodem kunststofbuizen 1-42 (zoals in tabel 1 bijvoorbeeld).
  2. Bereiding van cellen
    1. Isoleer milt en / of lymphnodes van muizen. Bereid enkele celsuspensie van weefsels door stampen door een 70 um poriën zeef met een 5 ml spuit zuiger en te tellen cellen met behulp van een hemocytometer.
    2. Resuspendeer lymfocyten bij maximaal 200 x 10 6 cellen / ml in 11,5 ml Rochester Park Memorial Institute 1640 (RPMI of gelijkwaardig) bevattende 5% foetaal kalfsserum (FCS). Opmerking: Het is belangrijk om een buffer met een hoog gehalte amine toxiciteit kleurstof minimaliseren cellen 3.
  3. CTV etikettering
    Opmerking: de cellen worden in eerste instantie voorzien van 6 concentraties van CTV.
    1. Grondig resuspendeer de cellen door het buisje meerdere malen. Voeg 1,9 ml celsuspensie tot en met 6 van de 10 ml buizen gelabeld 37-42, zorg ervoor dat u de bovenste helft van de buizen nat.
    2. Om cellen te labelen met CTV, verwijder het dopje en leg de buis horizontaal.
    3. Voeg 83 ul van PBS om de niet-bevochtigde gedeelte aan de bovenkant van de buis, en deze voegen 17 pl voorraad CTV (zie Table 2 waarvoor stockoplossing wordt toegewezen aan welke buis). Opmerking: Een niet nat buis belangrijk celsuspensie verkeer en voortijdige menging van de cel oplossing te voorkomen met de kleurstofoplossing.
    4. Sluit het buisje af en meng de celsuspensie met de kleurstof snel en grondig door te vortexen.
    5. Herhaal stappen 2.3.2-2.3.4 de voorraadoplossingen van CTV in de aangewezen buizen in Tabel 2 beschreven.
    6. Incubeer de cellen gedurende ten minste 5 minuten bij kamertemperatuur (20 ° C).
  4. CFSE labeling
    1. Na CTV etikettering, voeg 5 ml van RPMI bevattende 5% FCS aan elk buisje en de cellen grondig mengen door vortexen.
      1. Van buis 37 breng 1 ml celsuspensie buizen 31, 25, 19, 13, 7 en 1.
      2. Van buis 38 breng 1 ml celsuspensie buizen 32, 26, 20, 14, 8 en 2.
      3. Van buis 39 breng 1 ml celsuspensie buizen 33, 27, 21, 15, 9 en 3.
      4. Van buis 40 breng 1 ml van de celsuspensie buizen 34, 28, 22, 16, 10 en 4.
      5. Van buis 41 breng 1 ml celsuspensie buizen 35, 29, 23, 17, 11 en 5.
      6. Van buis 42 breng 1 ml celsuspensie buizen 36, 30, 24, 18, 12 en 6
        Opmerking: Zorg ervoor dat u de bovenste helft van de buizen nat tijdens stappen 2.4.1.1-2.4.1.6.
    2. Om cellen te labelen met CFSE, verwijder het dopje en leg de buis horizontaal.
    3. Voeg 103 ml PBS om de niet-bevochtigde gedeelte aan de bovenkant van de buis, en dit 7 ml voorraad CFSE (zie tabel 3 waarvoor voorraadoplossing wordt toegewezen aan welke buis).
    4. Sluit het buisje af en meng de celsuspensie met de kleurstof snel en grondig door te vortexen.
    5. Doen stappen 2.4.2-2.4.4 voor de voorraad oplossingen van CFSE in de aangewezen buizen beschreven in Tabel 3.
    6. Incubeer de cellen gedurende ten minste 5 minuten bij kamertemperatuur (20 ° C).
    7. Was de cellen: Verdunnen celsuspensie met 9 ml 20 ° CRPMI bevattende 5% FCS, sediment door centrifugatie bij 300 xg gedurende 10 min bij 20 ° C en verwijder supernatant door afzuigen met een transferpipet.
  5. Peptide pulserende en cel wassen
    Opmerking: Nadat cellen werden gelabeld met CFSE en CTV, ze gepulst met MHC klasse I en / of MHC klasse II-bindende peptiden (bereid in 1.2). Een van de celpopulaties moet niet worden gepulst met peptide (bijv.. Nil in tabel 1) en als negatieve controle voor de berekening van T-cel responsen.
    1. Peptide pulserende
      1. Resuspendeer cellen in een totaal volume van 250 pl RPMI bevattende 5% FCS. Opmerking: Typically 50 pi celsuspensie blijft na aspireren van het supernatant aan het einde van stap 2.4.7, dus voeg 200 ul van medium tot pellet cel.
      2. Voeg 250 ul van vooraf bereide peptide aandelen (tabel 5) om passend aangeduid buizen (zoals in tabel 1) en worden sure met een controle buis PBS omvatten alleen toegevoegd zonder peptide als Nil controle.
      3. Meng cel suspensies met een vortex. Opmerking: Het is belangrijk dat elk peptide epitoop peptide en elke concentratie wordt toegewezen aan een enkele buis hetgeen duidelijk vastgelegd gebaseerd op de verwachte fluorescentie van de cellen in deze buis, omdat de fluorescentie ondertekening van deze cluster dit peptide zal bepalen (zoals in Tabel 1 bijvoorbeeld).
      4. Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 1 uur.
    2. Cel wassen
      1. Voeg 5 ml ijskoude (4 ° C) RPMI bevattende 5% FCS aan de celsuspensie en resuspendeer cellen door het buisje. Onderlaag de celsuspensie met 3 ml ijskoud (4 ° C) FCS zorgvuldig.
      2. Sedimenteren de cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Gebruik trage acceleratie en remmen om de interface van FCS te waarborgen en de celsuspensie oplossing wordt gehandhaafd.
      3. Zuig voorzichtig het RPMI en vervolgensde FCS met een transfer pipet, waardoor de gewassen cel pellets ongestoord. Opmerking: Het gebruik van een onderlaag FCS om cellen te wassen zorgt ervoor zoveel peptide oplossing wordt verwijderd uit de cellen mogelijk en daardoor blootstelling van celpopulaties meerdere vrije peptiden beperken wanneer de cellen worden samengevoegd.
      4. Was de cellen weer: Resuspendeer de celpellets in 10 ml 4 ° C RPMI bevattende 5% FCS. Sedimenteren de cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Giet af bovenstaande vloeistoffen.
      5. Pool alle celpopulaties samen in een enkele buis met een pipet met behulp van 6 ml 4 ° C RPMI met 5% FCS. Sediment samengevoegde cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Aspireren supernatant met een transfer pipet.
  6. CPD Cell etikettering
    NB: Op dit punt zes intra-assay duplo kan worden gegenereerd door middel van etikettering peptidengepulste cellen met 6 verschillende concentraties van CPD.
    1. Voeg 11,4 ml 20 ° CRPMI bevattende 5% FCS aan de samengevoegde cel pellet en resuspendeer grondig met een pipet.
    2. Voeg 1,9 ml celsuspensie tot en met 6, 10 ml buizen gelabeld AF, zorg ervoor dat u de bovenste helft van de buizen nat.
    3. Om cellen te labelen met CPD, verwijder het dopje en leg de buis horizontaal.
    4. Voeg 92 ul van PBS om de niet-bevochtigde gedeelte aan de bovenkant van de buis, en deze voegen stock CPD (zie Tabel 4 voor de hoeveelheid voorraadoplossing aan elke buis).
    5. Sluit het buisje af en meng de celsuspensie met de kleurstof snel en grondig door te vortexen.
    6. . Heeft stappen 2.6.3-2.6.5 voor de voorraad oplossingen van CPD in de aangewezen buizen in tabel 4 beschreven Opmerking: Anders CFSE en CTV, de CPD etikettering concentratie niet precies lineair gerelateerd aan de resulterende fluorescentie-intensiteit van gelabelde cellen, en dus de etikettering gebruikte concentratie om op gelijke afstand fluorescerende pieken van verschillende gelabelde bevolking heeft kunnen verkrijgenempirisch bepaald (zie tabel 4).
    7. Incubeer de cellen gedurende ten minste 5 minuten bij kamertemperatuur (20 ° C).
    8. Was de cellen tweemaal: Resuspendeer cellen met 10 ml 20 ° C RPMI bevattende 5% FCS. Sedimenteren de cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 10 min bij 20 ° C. Aspireren supernatant met een transfer pipet. Herhalen.
    9. Pool alle cellen samen in een enkele buis met behulp van 8 ml 4 ° C RPMI met 5% FCS met een pipet. Sediment samengevoegde cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en zuig het supernatant met een pipet overdracht.
  7. (Optioneel) PKH-26 Cell etikettering
    Opmerking: Als VHZ niet kan worden gebouwd met cellen die een CD45 allotypische verschil aan muizen hosten, kunnen ze met PKH-26 gelabeld worden om hun discriminatie van ontvangende cellen mogelijk te maken.
    1. Voeg 2,9 ml 20 ° C PBS om de samengevoegde cel pellet te resuspenderen en grondig met een pipet.
    2. Voeg celsuspensie aan een non bevochtigd 10 ml tube, zorg ervoor dat u de bovenste helft van de buis te bevochtigen.
    3. Verwijder het dopje en leg de buis horizontaal.
    4. Voeg 58 ul verdunningsmiddel C (in de PKH-26 dye kit) aan de niet bevochtigd gedeelte aan de bovenkant van de buis, en deze voegen 42 ul van 1 mM voorraad-PKH 26.
    5. Doe het buisje dicht en meng cel oplossing met de kleurstof goed door vortexen.
    6. Incubeer de cellen gedurende ten minste 10 minuten bij kamertemperatuur (20 ° C).
    7. Was de cellen tweemaal: Resuspendeer cellen met 10 ml 20 ° C RPMI bevattende 5% FCS. Sedimenteren de cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 10 min bij 20 ° C. Aspireren supernatant met een transfer pipet. Herhalen.
  8. Injecteren van vrijhandelsovereenkomsten in gastdieren
    Opmerking: T cel responsen in vivo gemeten worden FTA geïnjecteerd in dieren die een actieve immuunrespons te hebben en in situ gelaten gedurende maximaal 24 uur. Het is essentieel dat de FTA ook geïnjecteerd in naïeve dieren als negatieve controle.
    1. Telling en resuspendeer cellen bij 2,5 x 10 8 cellen per ml in PBS. Injecteer 200 ui cellen intraveneus in gastheercellen muizen, waaronder een naïeve dieren als controle.

3. Flowcytometrie

  1. 18-24 uur na de FTA injectie oogst bloed of milt (of andere weefsels van belang) van de host muizen.
  2. Bereid enkele celsuspensie van weefsels door stampen door een 70 um poriën zeef met een 5 ml spuit zuiger.
  3. Resuspendeer cellen op tot 65 x 10 6 cellen / ml in PBS dat 0,1% BSA.
  4. Verdeel 100 pi fracties van celsuspensie in putjes van een microtiterplaat voor antilichaam labeling.
  5. Label cellen met fluorochroom gelabelde antilichamen en fluorescerende levensvatbaarheid sondes met spectraal compatibel fluorescentie te CFSE, CTV en CPD. Opmerking: Antilichamen tegen cel merkers zoals B220 en activatie merkers zoals CD69 B essentieel voor B-celactivering meten als met de FTA naar T H cel responsen te meten 2. Omvatten een antilichaam aan CD45.1 en / of CD45.2 indien de vrijhandelsovereenkomsten en gastheer muizen hebben een CD45 allotypische verschil.
  6. Voeg 100 ul 2x voorraadoplossing antilichamen / levensvatbaarheid kleurstoffen (in PBS dat 0,1% BSA) en 100 ul aliquots cellen, mengen en incuberen op ijs (4 ° C) gedurende 30 minuten.
  7. Was de cellen: Sediment cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en verwijder supernatant. Resuspendeer cellen in 200 pl PBS dat 0,1% BSA, sediment cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en verwijder supernatant.
  8. Resuspendeer cellen in een totaal volume van 400 ul PBS dat 0,1% BSA, filter cellen door een 70 urn gaas en geanalyseerd door flow cytometrie in een flowcytometer opsporen van de relevante fluorescente kleurstoffen en conjugaten. Verzamel maximaal 3 x 10 6 lymfocyten gebeurtenissen om elke FTA cel cluster op te lossen en krijgen genoeg cellen voor statistischecal analyse. Opmerking: Zorg ervoor dat alle typische controles (zoals single-lood controles) voor flowcytometrie in dienst zijn. Typisch, CFSE vereist excitatie van een blauwe laser bron (meestal bij 488 nm) en detectie met band pass filters gecentreerd op 520 nm; CTV vereist excitatie van een violette laser bron (meestal bij 405 nm) en detectie met band pass filters gecentreerd op 450 nm; en CPD vereist excitatie van een rode laser bron (meestal bij 633 nm of 640 nm) en detectie met band pass filters gecentreerd op 670 nm.

4. Data Analysis

  1. Analyseer flowcytometrie gegevens met behulp van standaard flowcytometrie software (zie representatief resultaat voor een voorbeeld van het type gating strategie toegepast).
  2. Voor% specifieke doden, bereken het aantal cellen in elk FTA cel cluster gepulseerd met MHC-klasse I-bindende peptiden en de FTA clusters die niet werden peptidengepulste ("Nil") en met de volgende formule om te berekenen% Specifieke Killing.
    % Specifieke Killing figure-protocol-1
    Opmerking: In de bovenstaande formule "primer" verwijst naar doelen van dieren die worden verondersteld om een ​​immune respons tegen het doel peptiden, "naïef" naar doelen vanuit naïeve dieren, "peptide" naar targets gepulseerd met peptiden en "nul" verwijst naar doelstellingen niet gepulseerd met enige peptiden.
  3. Voor B-cel activatie als een maat TH activiteit Bereken de geometrische gemiddelde fluorescentie-intensiteit (GMFI) van CD69 antilichaam fluorescentie op FTA B-cellen gepulst met MHC klasse II-bindende peptiden in "geprimed" dieren en naar het aftrekken van de GMFI CD69 uitdrukking op de overeenkomstige FTA B-cellen in "naïeve" dieren een maat TH activiteit geven.
  4. Uit de gegenereerde in stappen 4.2 en 4.3, gebruiksstatistiekenwiskundige spreadsheet software zoals GraphPad Prism aan andere kwantitatieve en kwalitatieve parameters zoals oppervlakte onder de curve en EC 50 (een diepgaande beschrijving van hoe deze berekeningen worden uitgevoerd voor AUC berekening is te vinden op
    http://graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm?stat_area_under_the_curve.htm, en voor EC50: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/curve-fitting/index. htm? reg_the_ec50.htm).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Als voorbeeld van het gebruik van de FTA assay werd een BALB / c muizen geïmmuniseerd met recombinant vacciniavirus (VV) expressie HIV-I epitopen (VV-HIV) en reacties op de HIV-I CTL epitopen, Gag, Gag mut, env en Pol, de VV CTL epitopen F2L en F2L mut, en de HIV-I T H celepitoop, Gag Th (zoals beschreven in 2) werden beoordeeld met behulp van een 252 parameter FTA assay (Figuur 1B). Epitoop varianten van Gag (Gag mut) en F2L (F2L mut) komen niet tot uitdrukking in de VV-HIV vector...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het voordeel van FTA-gebaseerde testen is dat ze de discriminatie van> 250 levensvatbare en volledig functionele doelcel populaties van een gastheerdier door flowcytometrie. Dit verschaft een niveau van complexiteit in vivo flowcytometrie gebaseerde testen die voorheen niet mogelijk was. Dit wordt benadrukt in de 2 dierproeven hierboven, waarbij reacties op 7 verschillende virale epitopen bij 6 concentraties kunnen worden gecontroleerd replicaten van 6 gelijktijdig in een dier waarbij parameters zoals AUC en...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door projectsubsidies # 1010395 (BQ en CP) en # 525431 (CR) en een Program Grant # 455395 (CP) van de National Health and Medical Research Council of Australia, een Australische Centrum voor Hepatitis en HIV Virologie EOI 2012 subsidie ​​(CR en RJJ) en een subsidie ​​van de Gordon and Gretel Bootes Foundation (BQ en CR). Wij willen Harpreet Vohra en Michael Devoy bedanken voor hun uitstekende onderhoud van de JCSMR FACS laboratorium, de Australische Cancer Research Foundation Biomolecular Resource Facility, JCSMR, ANU, voor peptide synthese, en Dr David Boyle, CSIRO Animal Health Laboratories, Geelong, Australië voor het verstrekken van de ouder HIV-vaccin voorraden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
RPMISigmaR8758
Fetal calf serumSeranaFCS-500
CTVInvitrogenC34557
CFDA, SEInvitrogenC1157
CPDeBioscience65-0840-90
anti-B220 PerCp-Cy5.5eBioscience110730
anti-CD69 brilliant violet 605Biolegend104529
PKH-26SigmaPKH26GL-1KT
VortexScientific Industries Inc
CentrifugeEppendorf
Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source)BD Bioscience

Referenties

  1. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo. Cytometry A. 81, 679-690 (2012).
  2. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo. J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).
  3. Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).
  4. Mata, M., Paterson, Y. Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens. J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).
  5. Earl, P. L., et al. Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines. Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).
  6. Wild, J., et al. Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model. Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).
  7. Takeshita, T., et al. Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule. J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).
  8. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3, 361-368 (2006).
  9. Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry. Cytometry A. 75, 440-449 (2009).
  10. Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. , (2010).
  11. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
  12. Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. , (2010).
  13. Hermans, I. F., et al. The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo. J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).
  14. Busch, D. H., Pamer, E. G. T cell affinity maturation by selective expansion during infection. J Exp Med. 189, 701-710 (1999).
  15. Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response. Immunity. 10, 485-492 (1999).
  16. Wang, X. L., Altman, J. D. Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays. J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).
  17. von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells. Clin Dev Immunol. , (2012).
  18. Prussin, C., Metcalfe, D. D. Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies. J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).
  19. Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2007).
  20. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).
  21. Klinman, D. ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells. Curr Protoc Immunol. , (2008).
  22. Yerly, D., et al. Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance. J Virol. 82, 3147-3153 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Fluorescente Target ArrayFlowcytometrieVital Dye LabelingMHC peptidepulsingCellTrace VioletCFSE kleuringCPD proliferatiekleurstofIntra assay replica sIn vivo beoordeling
Het gebruik van TL-Target Arrays voor het beoordelen van de T-cel responsen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.