Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Gecombineerde DNA-RNA-TL

27.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51628

⸱

14 juni 2014

 , 
1Department of Reproduction and Development, Erasmus MC - University Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

Fluorescente in situ hybridisatie (FISH) maakt de detectie van nucleïnezuren in hun eigen omgeving binnen cellen. We beschrijven hier een protocol voor gecombineerde, gelijktijdige detectie van RNA en DNA door middel van FISH, die kan worden gebruikt om X-chromosoom inactivatie in muis embryonale stamcellen.

Samenvatting

Fluorescente in situ hybridisatie (FISH) is een moleculaire techniek die de detectie van nucleïnezuren in cellen mogelijk maakt. DNA FISH wordt vaak gebruikt in cytogenetica en kankerdiagnostiek en kunnen afwijkingen van het genoom, die vaak belangrijke klinische implicaties detecteren. RNA FISH kunnen worden gebruikt om RNA-moleculen te detecteren in cellen en heeft belangrijke inzichten in regulatie van genexpressie verschaft. De combinatie van DNA en RNA FISH binnen dezelfde cel is technisch uitdagend, als omstandigheden die geschikt zijn voor DNA FISH te hard voor fragiele, enkelstrengs RNA-moleculen zou kunnen zijn. We stellen hier een gemakkelijk toepasbare protocol dat de gecombineerde gelijktijdige detectie van Xist RNA en DNA gecodeerd door de X-chromosomen mogelijk maakt. Deze gecombineerde DNA-RNA FISH protocol kan waarschijnlijk worden toegepast op andere systemen waar zowel RNA als DNA moeten worden gedetecteerd.

Inleiding

Studeren cellen en weefsels door middel van fluorescente in situ hybridisatie (FISH) is sinds de invoering ervan in de late jaren 1970 1, mogen onderzoekers genen, chromatine organisatie en de genexpressie te bestuderen op het subcellulaire niveau. DNA FISH wordt vaak gebruikt in cytogenetica, karyotypering 2, kankerdiagnostiek 3 en pre-implantatie genetische screening 4, en heeft een belangrijke rol in moleculair onderzoek 5-6 aangezien het de detectie van nucleïnezuren in hun eigen omgeving. Enkele cel expressie analyse op RNA FISH kunnen inheemse primaire transcripten en niet-coderende RNA's worden afgeschreven van chromosomen, en biedt voordelen voor andere technieken die op populatieniveau genexpressie te beoordelen, met inbegrip van bijvoorbeeld kwantitatieve RT-PCR, genoom-wijde expressie analyse of Northern blotting . Door het visualiseren van RNA-transcripten die rechtstreeks afkomstig zijn van hun sites van herkomst, heeft het bijvoorbeeld geweestgemerkt dat genexpressie stochastische 7 en soms allelspecifieke 8 zijn. Verbeteringen in de techniek zijn ook toegestaan ​​de detectie en kwantificering van afzonderlijke mRNA-moleculen in de cellen 9-11.

Het basisprincipe van FISH bestaat uit hybridisatie van nucleïnezuren in de cel een nucleïnezuur probe door zeer specifieke Watson en Crick baseparing. De probe kan direct of indirect gedetecteerd, waardoor een signaal dat microscopisch kan worden gevisualiseerd. Initiële pogingen bestond uit radioactief gemerkte probes die nadelen had gebaseerd op veiligheid, beperkte ruimtelijke resolutie en de mogelijkheid om slechts een doelwit tegelijk 12-14. De verdere ontwikkeling van niet-radioactieve labels, waaronder fluorochromen, haptenen, en enzymen, heeft geleid tot de brede verspreiding gebruik van FISH als een routine moleculaire biologie techniek. De FISH probe kan direct worden gelabeld met fluorochromes door chemische koppeling van fluorescerende moleculen nucleïnezuur sequenties 15 en integratie van fluorescent gemerkte nucleotiden 16-19, of de sonde kan indirect worden gevisualiseerd na integratie van haptenen (zoals biotine en digoxigenine) en immunologische detectie van haptenen met hapteen antilichamen geconjugeerd aan fluorescerende reportermoleculen 20-21. Deze aanpak maakt signaalversterking door verscheidene lagen fluorescerend gemerkte antilichamen die worden gebruikt om het originele signaal te versterken, en maakt de detectie van RNA-soorten die worden uitgedrukt op lage niveaus. Door directe en indirecte labeling technieken en diverse haptenen kunnen meerdere doelen gelijktijdig worden gevisualiseerd binnen dezelfde cel.

Een van de belangrijkste stappen in FISH protocollen is de hybridisatie van de probe aan het doelwit. Hoewel in theorie een probe specifiek alleen binden aan zijn doel in praktijk specificiteitniet altijd bereikt, als probes binden aan homologe gebieden en hybridisatieomstandigheden niet altijd ideaal voor een bepaalde DNA-gebied of RNA soort. Post-hybridisatie wassingen zijn daarom van bijzonder belang, aangezien zij de stringentie van de FISH procedure kan verhogen, en kan voorkomen dat niet-specifieke binding van FISH probes die resulteert in een hoge mate van achtergrondgeluiden. Als RNA-moleculen enkel zijn gestrand zij gemakkelijk kunnen worden gehybridiseerd met een FISH probe. In tegenstelling, het dubbelstrengs DNA-molecuul heeft een eerste denaturatiestap, waarna een probe hybridiseren. Dit wordt gewoonlijk bereikt door verhitting van het monster, waardoor denaturatie van het DNA. Echter, onder deze zware omstandigheden, breekbaar, enkelstrengs RNA-moleculen kunnen verloren gaan. Daarom gecombineerde DNA-RNA FISH vereist aanzienlijke optimalisering van de omstandigheden en is technisch uitdagend vergelijking met de afzonderlijke detectie van enkel RNA of DNA.

Hier presentatie weta gedetailleerd protocol van gecombineerde, gelijktijdige DNA-RNA FISH die heeft ons toegestaan ​​om X-chromosoom inactivatie (XCI) studeren in het onderscheiden vrouwelijke muis embryonale stamcellen 22-24. XCI is een cruciaal epigenetisch mechanisme voor vrouwelijke embryonale ontwikkeling 25, en resulteert in heterochromatinization en dus zwijgen van een van de twee X-chromosomen in vrouwelijke individuen 26-27. Van essentieel belang om dit proces is het niet-coderende RNA Xist 28-30, die wordt gereguleerd door de RNF12 22-23 en REX1 24 eiwitten. Xist expressie wordt gereguleerd op de toekomst inactieve X-chromosoom (Xi) tijdens de embryonale ontwikkeling of bij ES celdifferentiatie in vitro en kunnen zich langs de X-chromosoom en daardoor chromatine remodeling enzymen die leiden tot transcriptionele uitschakeling van het X-chromosoom 31 te trekken. Deze verspreiding van Xist RNA kan door RNA FISH worden gevisualiseerd als een bekleding van de X-chromosommige, die ook wel een Xist cloud. Aangezien vrouwelijke ES-cellen een van hun X-chromosomen als gevolg van instabiliteit van het genoom kan verliezen, hebben wij en anderen werkzaam gecombineerde DNA-RNA FISH om XCI bestuderen, om ervoor te zorgen dat alleen karyotypisch stabiele cellen worden beoordeeld in de analyse van dit belangrijke proces 22,32 -34. Zoals bij elke moleculaire biologie technieken, hebben verschillende uitstekende protocollen gepubliceerd 35-38. Hier presenteren we onze werkwijze, uitgaande van de inductie van differentiatie in muizen ES cellen, fixatie van cellen, kenmerken van FISH probes door nick-translatie, voorbehandeling van gefixeerde cellen om permeabilisatie en daaropvolgende opname probe, hybridisatie van de probe aan de doel, en tenslotte detectie van de probe met fluorescent gemerkte antilichamen. De hierin gepresenteerde protocol kan de gelovigen detectie van Xist RNA en het X-chromosoom binnen een termijn van twee dagen, en de basis van deze techniek kan waarschijnlijk worden aangepast aan othaar systemen en onderzoeksgebieden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Inductie van differentiatie in vrouwelijke embryonale stamcellen aan X-chromosoom inactivatie Braken

OPMERKING: Vrouw muis embryonale stamcellen (op aanvraag) worden geteeld onder standaard ES-cel voorwaarden ontsloten kweekschalen gecoat met muis embryonale fibroblasten (MEF). Wij hier aannemen dat de lezer bekend is met standaard celkweek technieken 39-41. Om differentiatie induceren, wordt ES cellen gekweekt in T25 gerechten worden gescheiden van de MEFs en worden uitgeplaat in differentiatiemedium.

  1. Verwijder ES medium uit de ES-cel cultuur, en twee keer wassen met celkweek PBS.
  2. Voeg 1,5 ml trypsine-EDTA (voorverwarmd tot 37 ° C) en incubeer cellen bij 37 ° C gedurende 7 minuten. Na 3,5 minuten, schud de schotel voorzichtig te breken van de kolonies.
  3. Inactivatie van het trypsine-EDTA door toevoegen van 3,5 ml differentiatiemedium aan de cellen. Pipet cellen omhoog en omlaag om een ​​enkele cel oplossing te verkrijgen, en het verzamelen vanin een 15 ml buisje. Centrifugeren gedurende 5 min bij 200 xg en cellen te verzamelen in 10 ml differentiatiemedium.
  4. Voeg celsuspensie aan een niet-gegeleerd kweekschaal en incubeer gedurende 1 uur in een celkweek incubator. OPMERKING: MEF kunnen toetreden tot de niet-gegeleerde kweekschaal wordt, dat ES cellen in suspensie blijven.
  5. Ondertussen voeg gesteriliseerde glazen dekglaasjes (24 x 24 mm) tot 6-well platen, voeg 0,2% gelatine en incubeer gedurende minimaal 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
  6. Na 1 uur, verzamel de bovenstaande vloeistof van de pre-plated ES celcultuur, die hoofdzakelijk bestaan ​​uit niet-hechtende ES-cellen. Plate ES cellen 6-well platen met dekglaasjes. OPMERKING: Gebruik ⅙ e van een confluente T25 schotel voor 6 putjes van een 6-wells plaat. Dit zal een samenvloeiing differentiatie mogelijk te maken en na 3 dagen van differentiatie. Verander medium op een dagelijkse basis. Voor langere differentiatie tijd cursussen, plaat pre-plated ES-cellen in differentiatiemedium in bacteriële gerechten, en incubaten op een cel shaker geïntegreerd in de celkweek incubator. Hierdoor kan de cellen embryoid organen, waarvan dekglaasjes kunnen worden uitgeplaat 1-2 dagen voor fixatie vormen.

2. Bevestiging van gedifferentieerde ES cellen voor latere DNA-RNA FISH analyse

  1. Verwijder differentiatiemedium uit differentiatie culturen, en tweemaal wassen met celkweek PBS. OPMERKING: Voeg PBS voorzichtig om te voorkomen dat cellen worden weggespoeld.
  2. Verwijder celkweek PBS en zet cellen door toevoeging van 4% paraformaldehyde (PFA) / PBS en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. LET OP: PFA is giftig en kan significant risico voor de gezondheid opleveren wanneer ze ingeademd of wanneer het in contact op de huid of ogen. Bovendien PFA is kankerverwekkend.
  3. Verwijder 4% PFA / PBS, en was dekglaasjes 3x met 70% ethanol. OPMERKING: Correct wassen is belangrijk, omdat elk spoor van PFA zal interfereren met latere FISH stappen. Dekglaasjes worden opgeslagen in 70% ethanol bij -20 ° C gedurende enkele maanden voor FISH analyse.

3. Labeling van DNA probes voor FISH Experimenten

LET OP: Zorg voor een DNA-fragment van het gen van belang (minimale lengte> 2 kb voor RNA FISH, of> 20 kb voor DNA FISH), of een BAC die het gen van belang. Voor RNA-detectie, kan een kleinere sonde voldoende opzichte DNA detectie, aangezien waarschijnlijk transcriptie zal leiden tot meervoudige transcripten, die gelijktijdig kunnen worden gedetecteerd. Voor een sterk signaal op de kopie DNA-streng, is een langere probe nodig, kunnen voldoende opgenomen haptenen detecteren. Bij voorkeur wordt een niet-getranscribeerde genomisch gebied gekozen ontwerpen van de DNA probe. Bovendien, wanneer een kleinere sonde naar RNA te detecteren, zal worden voorkomen dat de genomische loci waarvan het RNA wordt getranscribeerd wordt gedetecteerd in de gecombineerde DNA-RNA FISH benadering, hoewel dit niet volledig worden uitgesloten. Om muis Xist detecteren, werd een 5,5 kb cDNA-probe gebruikt. Voor detectie van het X-chromosoom, kan verschillende BAC probes worden gebruikt. Goede resultaten zijn verkregen met een mengsel van BAC RP23-100E1 en BAC CT7-474E4, die zich bevinden in de nabijheid van de Xist locus. Afhankelijk van het gen of chromosoom plaats kan verschillende probes vereist voor optimale resultaten. Wanneer het werken met materialen die zullen worden gebruikt voor RNA-FISH, gebruik steriel filter tips, RNAse vrij H 2 O, en werken in een schone omgeving.

  1. Neem 1 ug DNA en verdund in H2O in een totaal volume van 16 pl. Voeg 4 ul van digoxigenine of biotine etikettering oplossing (zie reagentia), meng door vortexen en incubeer bij 16 ° C gedurende 90 minuten. OPMERKING: De biotine of digoxigenine-gelabelde nucleotiden zal nu door nick-translatie worden opgenomen.
  2. In de tussentijd bereiden G50 kolommen aan niet-geïntegreerde nucleotiden te verwijderen. Neem een ​​spuit 2 ml, verwijder de stamper en voeg gesteriliseerd katoen in de spuit. Voeg G50 ballen in oplossing to vul de spuit, plaats spuit in een 15 ml buis en centrifugeer bij 642 xg gedurende 1 minuut. OPMERKING: Ongeveer 80% van de spuit moet nu worden gevuld met G50. Herhaal wanneer minder G50 aanwezig is.
  3. Na 90 min, voeg 40 ui H2O de nick-translatie reactiemengsel en voeg de reactie op de kolom G50. Voeg een lege buis onder de kolom en centrifugeer bij 642 xg gedurende 2 minuten. Verzamel de stroom door een reactiebuis.
  4. Meet het volume van de stroming door met een pipet en voeg H2O tot een totaal volume van 200 pi te bereiken. Neerslag de doorstroming door toevoeging van 13,3 ul zalmsperma DNA (10 mg / ml), 13,3 ul tRNA (10 mg / ml), 26,7 pl muis Cot-1 DNA (1 mg / ml) en 28 ui 2 M NaAc, pH 5.6. Meng door vortexen, en voeg 533 ul ijskoude 100% ethanol. Schud de buis en centrifugeer bij 16.200 xg gedurende 30 min bij 4 ° C.
  5. Verwijder de supernatant en was de pellet twee keer met 70% ethanol. Centrifugeer bij 16.200 xg gedurende 5 minuten bij4 ° C en de lucht droog de pellet. Voeg 50 ul van 50 + hybridisatie-oplossing en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten om het oplossen te vergemakkelijken. OPMERKING: Gemerkte probe kan worden opgeslagen voor meerdere jaren bij -20 ° C. LET OP: 50 + hybridisatie-oplossing bevat formamide, dat giftig is, kan de huid, ogen en luchtwegen irriteren, en is ook een teratogeen.

4. Permeabilisatie, Voorbehandeling en hybridisatie van Vaste Cellen voor gecombineerde DNA-RNA FISH

  1. Hydrateren gefixeerde cellen op dekglaasjes, door het verwijderen van 70% ethanol en toevoeging van celkweek PBS om de 6-well platen. Incubeer gedurende 5 minuten. Herhaal in totaal drie keer.
  2. Verwijder celkweek PBS en voeg 0,2% pepsine de 6-well platen, om de cellen te permeabiliseren. Incubeer 6-well platen in een waterbad bij 37 ° C gedurende 4 minuten. Verwijder pepsine en inactiveren met RNAse vrij H2O
  3. Post-fix cellen door incubatie met 4% PFA / PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Na fixatiop, was tweemaal met celkweek PBS gedurende 5 minuten.
  4. Uitdrogen cellen door incubatie met 70% ethanol gedurende 3 min, 90% ethanol gedurende 3 min en 100% ethanol gedurende 3 minuten. Overdracht coverslips van de 6-well platen, en de lucht drogen dekglaasjes gedurende enkele minuten.
  5. Leeftijd cellen door incubatie dekglaasjes bij 65 ° C gedurende 1 uur op een verwarmingsplaat.
  6. Pre-FISH probe hybridiseren met muizen Cot-1 DNA door optelling van elke dekglaasje te analyseren, 25 gl 50 + hybridisatieoplossing, 0,5 pi muis Cot-1 DNA, 1 ui met biotine gelabelde probe Xist en 1 pl digoxigenine BAC gemerkte probe detecteren van het X-chromosoom. Meng door vortexen en denatureren bij 99 ° C gedurende 5 minuten. Onmiddellijk Incubeer bij 37 ° C gedurende 45 minuten, zodat Cot-1 DNA te hybridiseren met sequenties in de probes herhalen.
  7. Na veroudering, spot 50 pl denaturatie buffer (bestaande uit 70% formamide/2x SSC/10 mM fosfaatbuffer) op een glasplaatje, en zet dekglaasjes geplaatst met cellen naar towards de denaturatiebuffer. Incubeer bij 65 ° C gedurende 2 minuten.
  8. Dekglaasjes naar 6-well platen en na correctie cellen toevoegen door incuberen in ijskoude 70% ethanol gedurende 5 minuten.
  9. Uitdrogen cellen door daaropvolgende incubatie in 70% ethanol gedurende 3 min, 90% ethanol gedurende 3 min en 100% ethanol gedurende 3 minuten. Verwijder dekglaasjes van 6-well platen, en laat drogen aan de lucht gedurende een aantal minuten.
  10. Spot vooraf gehybridiseerde probe op een glasplaatje, en incubeer dekglaasje geplaatst. Plaats de glaasjes in een bevochtigde kamer gevuld met 50 ml 50% formamide/2x SSC en incubeer overnacht bij 37 ° C.

5. Post-hybridisatie Wast en antilichaam-gemedieerde Detectie van Probe

  1. Fill 6-well platen met 2x SSC en pre-warm tot 42 ° C. Dekglaasjes Voeg na overnacht incubatie, en incubeer bij 42 ° C gedurende 5 minuten.
  2. Verwijder 2x SSC en incubeer dekglaasjes met 50% formamide/2x SSC gedurende 10 minuten bij 42 ° C. Herhaal dit in totaal 3 keer (30 min wassen in totaal).
  3. Verwijder 50% formamide/2x SSC en wassen dia's met Tris-zoutoplossing-Tween (TST) voor 2 x 5 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Spot 50 pl Tris-zout-BSA (TSBSA) per dekglaasje op nieuwe glazen dia's, en incubeer dekglaasjes ondersteboven voor het blokkeren gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een TST-bevochtigde donkere kamer.
  5. Transfer coverslips terug naar 6-well platen, en was 2 x 5 minuten met TST.
  6. Vlek 50 ul schapen-anti-DIG antistof (1:500 in TSBSA) per dekglaasje nieuwe glasplaatjes en incubeer dekglaasjes ondersteboven de eerste incubatiestap gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een vochtige TST-donkere kamer.
  7. Transfer coverslips terug naar 6-well platen, en was 2 x 5 minuten met TST.
  8. Spot 50 ul van konijn-anti-schaap antilichaam geconjugeerd met FITC (1:250 in TSBSA) per dekglaasje op nieuwe glazen dia's, en incubeer dekglaasjes ondersteboven voor de tweede incubatie stap gedurende 30 min bij kamertemperatuur in een TST-bevochtigde donkere kamer .
  9. Transfer coverslips terug naar 6-well platen, en was 2 x 5 minuten met TST.
  10. Vlek 50 gl geit-anti-konijn-antilichaam geconjugeerd met FITC (1:250 in TSBSA) per dekglaasje nieuwe glasplaatjes en incubeer dekglaasjes ondersteboven derde incubatiestap gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een vochtige TST-donkere kamer .
  11. Transfer coverslips terug naar 6-well platen, en was 2 x 5 minuten met TST.
  12. Vlek 50 pl muis anti-biotine antilichaam (1:200 in TSBSA) per dekglaasje nieuwe glasplaatjes en incubeer dekglaasjes ondersteboven vierde incubatiestap gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een vochtige TST-donkere kamer.
  13. Transfer coverslips terug naar 6-well platen, en was 2 x 5 minuten met TST.
  14. Spot 50 ul van ezel-anti-muis antilichaam geconjugeerd met Rhodamine (1:250 in TSBSA) per dekglaasje op nieuwe glazen dia's, en incubeer dekglaasjes ondersteboven voor de vijfde incubatie stap gedurende 30 min bij kamertemperatuur in een TST-bevochtigde donkere chambER.
  15. Transfer coverslips terug naar 6-well platen, en was 2 x 5 minuten met TST.
  16. Spot 50 ul van geit-anti-paard antilichaam geconjugeerd met Rhodamine (1:250 in TSBSA) per dekglaasje op nieuwe glazen dia's, en incubeer dekglaasjes ondersteboven voor de zesde incubatie stap gedurende 30 min bij kamertemperatuur in een TST-bevochtigde donkere kamer . OPMERKING: de geit-anti-paard antilichaam zal de ezel-anti-muis antilichaam herkennen; bij beschikking van de onderzoeker, zal een geit-anti-ezel antilichaam zo goed werkt.
  17. Transfer coverslips terug naar 6-well platen, en was 2 x 5 minuten met TST. Was eens 5 min met Tris-zoutoplossing (TS).
  18. Uitdrogen cellen door daaropvolgende incubatie in 70% ethanol gedurende 3 min, 90% ethanol gedurende 3 min en 100% ethanol gedurende 3 minuten. Verwijder dekglaasjes van 6-well platen, en laat drogen aan de lucht gedurende een aantal minuten.
  19. Spot een daling van montage medium met DAPI (zie reagentia) op een glasplaatje, en voeg dekglaasje omgekeerd op. Seal dia's met nagellak enFISH resultaten te beoordelen door fluorescentie microscopie (figuur 1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Met behulp van bovenstaande protocol voor gecombineerde DNA-RNA FISH, konden we X-chromosoom inactivatie visualiseren differentiëren vrouwelijke embryonale stamcellen zijn. Figuur 1 toont een representatief voorbeeld van een DNA-RNA FISH experiment waarbij we zowel Xist (die herkend zichtbaar als een zogenaamde Xist RNA wolk op het inactieve X-chromosoom en een basale transcriptie lokaliseren op actieve X-chromosoom), en een gebied van het X-chromosoom, die zichtbaar als lokaliseren si...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Gecombineerde DNA-RNA vis kan worden technisch uitdagend, als omstandigheden die geschikt zijn voor DNA FISH te hard voor minder stabiele RNA-moleculen kunnen worden. Verschillende benaderingen zijn toegepast op zowel DNA als RNA studie in dezelfde cel, omzeilen de noodzaak voor gelijktijdige incubatie met probes detecteren zowel DNA en RNA. Bijvoorbeeld, in een superpositie benadering wordt eerst RNA FISH uitgevoerd en de cellen worden afgebeeld en coördinaten worden genomen. Vervolgens worden dezelfde slides gebruikt ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs danken alle voormalige en huidige leden van de afdeling Reproductie en Ontwikkeling van de Erasmus MC voor nuttige en stimulerende discussies gedurende de afgelopen jaren. We willen ook de drie anonieme recensenten bedanken voor hun nuttige feedback. Het werk in het Gribnau-lab wordt ondersteund door financiering van de Nederlandse onderzoeksraad (NWO-VICI) en een ERC-startsubsidie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
vrouwelijke muis embryonale stamcellenworden op verzoek beschikbaar gesteld
muis embryonale fibroblastenkunnen worden afgeleid van E13.5 embryo's, of via commerciële bronnen bijv. Millipore
ES cel kweekmediumDMEM, 15% foetaal kalfs serum, 100 U/ml penicilline, 100 mg/ml streptomycine, niet-essentiële aminozuren, 0,1 mM α-mercaptoethanol en 1.000 U/ml LIF. Filter steriliseren en bewaren bij 4 °C voor maximaal 2 weken.
LIFChemiconESG1107
DMEMInvitrogen11960085
Foetaal Kalfs SerumInvitrogen10099141
Penicilline–streptomycine (100x)Invitrogen15140-122
Niet-essentiële aminozurenInvitrogen11140-050
α-mercaptoethanolSigma-AldrichM7522
ES cel differentiatiemediumIMDM-Glutamax, 15% verhit geïnactiveerd foetaal kalfs serum, 100 U/ml penicilline, 100 mg/ml streptomycine, niet-essentiële aminozuren, 37,8 μl/L monothioglycerol en 50 μg/ml ascorbinezuur
IMDM-GlutamaxInvitrogen31980-030
Ascorbinezuur (50 mg/ml)Sigma-AldrichA4403
monothioglycerolSigma-AldrichM6145
T25 cel kweekschalenGreiner Bio-one690160
6-wells cel kweekschalenGreiner Bio-one662160
cel kweek kwaliteit PBSSigma-AldrichD8537
Trypsine-EDTA 0,25% (v/v) trypsine/0,2% (w/v) EDTA in PBSGibco25200-056
Falcon buizenFalcon352196
24 x 24 mm dekselsMenzle780882
gelatineSigma-AldrichG1890-100Gbereid een 0,2% gelatine/cel kweek PBS oplossing en autoclaveer
PepsineSigma-AldrichP7000Verdun tot 0,2% in 0,01 M HCl (pH 2,0)
absoluut 100% ethanolSigma-Aldrich32221-2.5Lgebruik absoluut 100% ethanol en RNAse vrij water om 70% en 90% ethanol oplossingen te maken
RNAse vrij waterBaxterTKF7114
steriele filter tipsRainin Bio CleanGP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
digoxigenine-labeling kit (DIG-Nick translatie)Roche11745816910
biotine-labeling kit (Biotine Nick translatie)Roche11745824910
Sephadex G50Sigma-AldrichG5080
2 ml spuitBD Plastipak300013
gesteriliseerde katoen
Eppendorf buisjesEppendorf30120086
gist tRNA 10 mg/mlInvitrogen15401-029
Salmon Sperm DNA 10 mg/mlInvitrogen15632-011
muis cot-1 DNA 1 mg/mlInvitrogen18440-016
Eppendorf tafel centrifuageEppendorfModel 5417R
Eppendorf gekoelde centrifugeEppendorfModel 5810R
2 M NaAc, pH 5,6Sigma-AldrichS7670
50+ hybridisatie oplossing50% formamide, 2x SSC, 50 mM fosfaat buffer pH 7, 10% dextran sulfaat pH 7
formamideAcros organics3272350000
dextran sulfaatFluka31403
10 mM fosfaat buffer, pH 7voeg 57,7 ml van 1 M Na2HPO4 en 42,3 ml 1 M NaH2PO4 toe; gebruik DEPC behandeld water en autoclaveer
denaturatie buffer70% formamide/2x SSC/10 mM fosfaat buffer pH 7
Tween-20Sigma-AldrichP2287
2 M Tris pH 7,5 oplossing
Tris-saline-Tween was oplossing (TST)100 ml 10x saline, 50 ml 2M Tris, 500 μl Tween-20, voeg RNAse vrij water toe tot 1 L
10x saline oplossinglos 85 g NaCl op in 1 L RNAse vrij H2O en autoclaveer
Tris-saline-BSA (TSBSA)500 μl 10x saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml RNAse vrij H2O
BSA, gezuiverd, 100xNew England BiolabsB9001S
schapen-anti-dig antilichaamRoche diagnosticsgebruik 1:500 verdund in TSBSA
konijn-anti-schapen antilichaam geconjugeerd met FITCJackson labsgebruik 1:250 verdund in TSBSA
geit-anti-konijn antilichaam geconjugeerd met FITCJackson labsgebruik 1:250 verdund in TSBSA
muis-anti-biotine antilichaamRoche diagnosticsgebruik 1:200 verdund in TSBSA
ezel-anti-muis antilichaam geconjugeerd met RhodamineJackson labsgebruik 1:250 verdund in

Referenties

  1. Rudkin, G. T., Stollar, B. D. High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence. Nature. 265, 472-473 (1977).
  2. Imataka, G., Arisaka, O. Chromosome analysis using spectral karyotyping (SKY). Cell Biochem Biophys. 62, 13-17 (2012).
  3. Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
  4. Mastenbroek, S., et al. Preimplantation genetic screening: a systematic review and meta-analysis of RCTs. Hum Reprod Update. 17, 454-466 (2011).
  5. Martins-Taylor, K., Xu, R. H. Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 22-27 (2012).
  6. Rens, W., et al. Resolution and evolution of the duck-billed platypus karyotype with an X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5 male sex chromosome constitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16257-16261 (2004).
  7. Munsky, B., et al. Using gene expression noise to understand gene regulation. Science. 336, 183-187 (2012).
  8. Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
  9. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Rep. 46, 65-72 (2013).
  10. Ji, N., van Oudenaarden, A. Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos. WormBook. , 1-16 (2012).
  11. Femino, A. M., et al. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  12. Buongiorno-Nardelli, M., Amaldi, F. Autoradiographic detection of molecular hybrids between RNA and DNA in tissue sections. Nature. 225, 946-948 (1970).
  13. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).
  14. John, H. A., et al. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature. 223, 582-587 (1969).
  15. Bauman, J. G., et al. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
  16. Wiegant, J., et al. In situ hybridization with fluoresceinated DNA. Nucleic Acids Res. 19, 3237-3241 (1991).
  17. Langer, P. R., et al. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 6633-6637 (1981).
  18. Manuelidis, L., et al. High-resolution mapping of satellite DNA using biotin-labeled DNA probes. J Cell Biol. 95, 619-625 (1982).
  19. Kislauskis, E. H., et al. Isoform-specific 3'-untranslated sequences sort alpha-cardiac and beta-cytoplasmic actin messenger RNAs to different cytoplasmic compartments. J Cell Biol. 123, 165-172 (1993).
  20. Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 79, 7331-7335 (1982).
  21. Corput, M. P., et al. Fluorescence in situ hybridization using horseradish peroxidase-labeled oligodeoxynucleotides and tyramide signal amplification for sensitive DNA and mRNA detection. Histochem Cell Biol. 110, 431-437 (1998).
  22. Jonkers, I., et al. RNF12 is an X-Encoded dose-dependent activator of X chromosome inactivation. Cell. 139, 999-101 (2009).
  23. Barakat, T. S., et al. RNF12 activates Xist and is essential for X chromosome inactivation. PLoS Genet. 7, (2011).
  24. Gontan, C., et al. RNF12 initiates X-chromosome inactivation by targeting REX1 for degradation. Nature. 485, 386-390 (2012).
  25. Lyon, M. F. Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L). Nature. 190, 372-373 (1961).
  26. Barakat, T. S., Gribnau, J. X. chromosome inactivation in the cycle of life. Development. 139, 2085-2089 (2012).
  27. Augui, S., et al. Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre. Nat Rev Genet. 12, 429-442 (2011).
  28. Brown, C. J., et al. A gene from the region of the human X inactivation centre is expressed exclusively from the inactive X chromosome. Nature. 349, 38-44 (1991).
  29. Brockdorff, N., et al. Conservation of position and exclusive expression of mouse Xist from the inactive X chromosome. Nature. 351, 329-331 (1991).
  30. Borsani, G., et al. Characterization of a murine gene expressed from the inactive X chromosome. Nature. 351, 325-329 (1991).
  31. Barakat, T. S., Gribnau, J. X chromosome inactivation and embryonic stem cells. Adv Exp Med Biol. 695, 132-154 (2010).
  32. Chaumeil, J., et al. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
  33. Okamoto, I., et al. Eutherian mammals use diverse strategies to initiate X-chromosome inactivation during development. Nature. 472, 370-374 (2011).
  34. Gribnau, J., et al. X chromosome choice occurs independently of asynchronous replication timing. J Cell Biol. 168, 365-373 (2005).
  35. Namekawa, S. H., Lee, J. T. Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos. Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).
  36. Van Tine, B. A., et al. Simultaneous in situ detection of RNA, DNA, and protein using tyramide-coupled immunofluorescence. Methods Mol Biol. 292, 215-230 (2005).
  37. Pollex, T., et al. Live-Cell Imaging Combined with Immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to Study the Nuclear Dynamics and Expression of the X-Inactivation Center. Methods Mol Biol. 1042, 13-31 (2013).
  38. Chaumeil, J., et al. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
  39. Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 690, 31-56 (2011).
  40. Meissner, A., et al. Derivation and manipulation of murine embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 482, 3-19 (2009).
  41. Nichols, J., Ying, Q. L. Derivation and propagation of embryonic stem cells in serum- and feeder-free culture. Methods Mol Biol. 329, 91-98 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Gecombineerde DNA-RNA FISHXist-RNA-detectielabelen van DNA-sondesnick-translatieimmunofluorescentiemicroscopieparaformaldehydefixatiehybridisatiebufferfluorescerende antilichamen
Gecombineerde DNA-RNA-TL
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.