Fluorescente in situ hybridisatie (FISH) maakt de detectie van nucleïnezuren in hun eigen omgeving binnen cellen. We beschrijven hier een protocol voor gecombineerde, gelijktijdige detectie van RNA en DNA door middel van FISH, die kan worden gebruikt om X-chromosoom inactivatie in muis embryonale stamcellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Fluorescente in situ hybridisatie (FISH) is een moleculaire techniek die de detectie van nucleïnezuren in cellen mogelijk maakt. DNA FISH wordt vaak gebruikt in cytogenetica en kankerdiagnostiek en kunnen afwijkingen van het genoom, die vaak belangrijke klinische implicaties detecteren. RNA FISH kunnen worden gebruikt om RNA-moleculen te detecteren in cellen en heeft belangrijke inzichten in regulatie van genexpressie verschaft. De combinatie van DNA en RNA FISH binnen dezelfde cel is technisch uitdagend, als omstandigheden die geschikt zijn voor DNA FISH te hard voor fragiele, enkelstrengs RNA-moleculen zou kunnen zijn. We stellen hier een gemakkelijk toepasbare protocol dat de gecombineerde gelijktijdige detectie van Xist RNA en DNA gecodeerd door de X-chromosomen mogelijk maakt. Deze gecombineerde DNA-RNA FISH protocol kan waarschijnlijk worden toegepast op andere systemen waar zowel RNA als DNA moeten worden gedetecteerd.
Inleiding
Studeren cellen en weefsels door middel van fluorescente in situ hybridisatie (FISH) is sinds de invoering ervan in de late jaren 1970 1, mogen onderzoekers genen, chromatine organisatie en de genexpressie te bestuderen op het subcellulaire niveau. DNA FISH wordt vaak gebruikt in cytogenetica, karyotypering 2, kankerdiagnostiek 3 en pre-implantatie genetische screening 4, en heeft een belangrijke rol in moleculair onderzoek 5-6 aangezien het de detectie van nucleïnezuren in hun eigen omgeving. Enkele cel expressie analyse op RNA FISH kunnen inheemse primaire transcripten en niet-coderende RNA's worde....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Inductie van differentiatie in vrouwelijke embryonale stamcellen aan X-chromosoom inactivatie Braken
OPMERKING: Vrouw muis embryonale stamcellen (op aanvraag) worden geteeld onder standaard ES-cel voorwaarden ontsloten kweekschalen gecoat met muis embryonale fibroblasten (MEF). Wij hier aannemen dat de lezer bekend is met standaard celkweek technieken 39-41. Om differentiatie induceren, wordt ES cellen gekweekt in T25 gerechten worden gescheiden van de MEFs en worden uitgeplaat in differentiatiemedium.
- Verwijder ES medium uit de ES-cel cultuur, en twee keer wassen met celkweek PBS.
- Voeg 1,5 ml trypsine-E....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van bovenstaande protocol voor gecombineerde DNA-RNA FISH, konden we X-chromosoom inactivatie visualiseren differentiëren vrouwelijke embryonale stamcellen zijn. Figuur 1 toont een representatief voorbeeld van een DNA-RNA FISH experiment waarbij we zowel Xist (die herkend zichtbaar als een zogenaamde Xist RNA wolk op het inactieve X-chromosoom en een basale transcriptie lokaliseren op actieve X-chromosoom), en een gebied van het X-chromosoom, die zichtbaar als lokaliseren si.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Gecombineerde DNA-RNA vis kan worden technisch uitdagend, als omstandigheden die geschikt zijn voor DNA FISH te hard voor minder stabiele RNA-moleculen kunnen worden. Verschillende benaderingen zijn toegepast op zowel DNA als RNA studie in dezelfde cel, omzeilen de noodzaak voor gelijktijdige incubatie met probes detecteren zowel DNA en RNA. Bijvoorbeeld, in een superpositie benadering wordt eerst RNA FISH uitgevoerd en de cellen worden afgebeeld en coördinaten worden genomen. Vervolgens worden dezelfde slides gebruikt .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs danken alle voormalige en huidige leden van de afdeling Reproductie en Ontwikkeling van de Erasmus MC voor nuttige en stimulerende discussies gedurende de afgelopen jaren. We willen ook de drie anonieme recensenten bedanken voor hun nuttige feedback. Het werk in het Gribnau-lab wordt ondersteund door financiering van de Nederlandse onderzoeksraad (NWO-VICI) en een ERC-startsubsidie.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| vrouwelijke muis embryonale stamcellen | worden op verzoek beschikbaar gesteld | ||
| muis embryonale fibroblasten | kunnen worden afgeleid van E13.5 embryo's, of via commerciële bronnen bijv. Millipore | ||
| ES cel kweekmedium | DMEM, 15% foetaal kalfs serum, 100 U/ml penicilline, 100 mg/ml streptomycine, niet-essentiële aminozuren, 0,1 mM α-mercaptoethanol en 1.000 U/ml LIF. Filter steriliseren en bewaren bij 4 °C voor maximaal 2 weken. | ||
| LIF | Chemicon | ESG1107 | |
| DMEM | Invitrogen | 11960085 | |
| Foetaal Kalfs Serum | Invitrogen | 10099141 | |
| Penicilline–streptomycine (100x) | Invitrogen | 15140-122 | |
| Niet-essentiële aminozuren | Invitrogen | 11140-050 | |
| α-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| ES cel differentiatiemedium | IMDM-Glutamax, 15% verhit geïnactiveerd foetaal kalfs serum, 100 U/ml penicilline, 100 mg/ml streptomycine, niet-essentiële aminozuren, 37,8 μl/L monothioglycerol en 50 μg/ml ascorbinezuur | ||
| IMDM-Glutamax | Invitrogen | 31980-030 | |
| Ascorbinezuur (50 mg/ml) | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| T25 cel kweekschalen | Greiner Bio-one | 690160 | |
| 6-wells cel kweekschalen | Greiner Bio-one | 662160 | |
| cel kweek kwaliteit PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Trypsine-EDTA 0,25% (v/v) trypsine/0,2% (w/v) EDTA in PBS | Gibco | 25200-056 | |
| Falcon buizen | Falcon | 352196 | |
| 24 x 24 mm deksels | Menzle | 780882 | |
| gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | bereid een 0,2% gelatine/cel kweek PBS oplossing en autoclaveer |
| Pepsine | Sigma-Aldrich | P7000 | Verdun tot 0,2% in 0,01 M HCl (pH 2,0) |
| absoluut 100% ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | gebruik absoluut 100% ethanol en RNAse vrij water om 70% en 90% ethanol oplossingen te maken |
| RNAse vrij water | Baxter | TKF7114 | |
| steriele filter tips | Rainin Bio Clean | GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F | |
| digoxigenine-labeling kit (DIG-Nick translatie) | Roche | 11745816910 | |
| biotine-labeling kit (Biotine Nick translatie) | Roche | 11745824910 | |
| Sephadex G50 | Sigma-Aldrich | G5080 | |
| 2 ml spuit | BD Plastipak | 300013 | |
| gesteriliseerde katoen | |||
| Eppendorf buisjes | Eppendorf | 30120086 | |
| gist tRNA 10 mg/ml | Invitrogen | 15401-029 | |
| Salmon Sperm DNA 10 mg/ml | Invitrogen | 15632-011 | |
| muis cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | 18440-016 | |
| Eppendorf tafel centrifuage | Eppendorf | Model 5417R | |
| Eppendorf gekoelde centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| 2 M NaAc, pH 5,6 | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| 50+ hybridisatie oplossing | 50% formamide, 2x SSC, 50 mM fosfaat buffer pH 7, 10% dextran sulfaat pH 7 | ||
| formamide | Acros organics | 3272350000 | |
| dextran sulfaat | Fluka | 31403 | |
| 10 mM fosfaat buffer, pH 7 | voeg 57,7 ml van 1 M Na2HPO4 en 42,3 ml 1 M NaH2PO4 toe; gebruik DEPC behandeld water en autoclaveer | ||
| denaturatie buffer | 70% formamide/2x SSC/10 mM fosfaat buffer pH 7 | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| 2 M Tris pH 7,5 oplossing | |||
| Tris-saline-Tween was oplossing (TST) | 100 ml 10x saline, 50 ml 2M Tris, 500 μl Tween-20, voeg RNAse vrij water toe tot 1 L | ||
| 10x saline oplossing | los 85 g NaCl op in 1 L RNAse vrij H2O en autoclaveer | ||
| Tris-saline-BSA (TSBSA) | 500 μl 10x saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml RNAse vrij H2O | ||
| BSA, gezuiverd, 100x | New England Biolabs | B9001S | |
| schapen-anti-dig antilichaam | Roche diagnostics | gebruik 1:500 verdund in TSBSA | |
| konijn-anti-schapen antilichaam geconjugeerd met FITC | Jackson labs | gebruik 1:250 verdund in TSBSA | |
| geit-anti-konijn antilichaam geconjugeerd met FITC | Jackson labs | gebruik 1:250 verdund in TSBSA | |
| muis-anti-biotine antilichaam | Roche diagnostics | gebruik 1:200 verdund in TSBSA | |
| ezel-anti-muis antilichaam geconjugeerd met Rhodamine | Jackson labs | gebruik 1:250 verdund in |
Referenties
- Rudkin, G. T., Stollar, B. D. High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence. Nature. 265, 472-473 (1977).
- Imataka, G., Arisaka, O. Chromosome analysis using spectral karyotyping (SKY). Cell Biochem Biophys. 62
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
