Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Ontwikkeling van een IFN-γ ELISpot Assay aan varicella-zoster virus-specifieke-cel gemedieerde immuniteit na transplantatie van navelstrengbloed

14.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51643

⸱

9 juli 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Unité d'Immunopathologie Virale, Centre de Recherche du CHU Sainte-Justine, Department of Microbiology, Infectiology & Immunology, Faculty of Medicine, Université de Montréal, 2Infectious Diseases Service, CHU Sainte-Justine, Faculty of Medicine, Université de Montréal, 3Department of Paediatrics, Université de Montréal

In dit artikel

Samenvatting

Nieuwe generaties van functionele testen zoals gamma interferon (IFN-γ) ELISPOT, die cytokineproductie detecteren op enkele cel en bieden zowel kwantitatieve als kwalitatieve karakterisering van T cel responsen kunnen worden gebruikt om celgemedieerde immuunresponsen tegen varicella zoster beoordelen virus (VZV).

Samenvatting

Varicella zoster-virus (VZV) is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit na transplantatie van navelstrengbloed (UCBT). Daarom is antiherpetic profylaxe systematisch toegediend aan pediatrische UCBT ontvangers complicaties met VZV-infectie te voorkomen, maar er is geen sterk bewijs gebaseerde consensus dat de optimale duur bepaalt. Omdat T-cel gemedieerde immuniteit is verantwoordelijk voor de controle van VZV-infectie, de beoordeling van de reconstructie van VZV-specifieke T-cel responsen na UCBT kan aanwijzingen verschaffen over de vraag of profylaxe moet worden gehandhaafd of kan worden gestaakt. Hiervoor werd een specifiek VZV gamma interferon (IFN-γ) enzym-gekoppelde immunospot (ELISPOT) assay ontwikkeld IFN-γ productie karakteriseren door T-lymfocyten als reactie op in vitro stimulatie met bestraalde levend verzwakt VZV-vaccin. Deze test geeft een snelle, reproduceerbare en gevoelige meting van VZV specifieke cell gemedieerde immuniteit geschikt voor het bewaken van de reconstructie van VZV specifieke immuniteit in een klinische setting en beoordelen immuunrespons te VZV antigenen.

Inleiding

Eerste uitgevoerd in 1989, wordt UCBT steeds meer gebruikt als onderdeel van de behandeling van verschillende neoplastische en nonneoplastic bloed bij kinderen 1. VZV is een cytopatisch menselijk alfaherpesvirus die twee verschillende ziekten, varicella (na primaire infectie) en herpes zoster (na reactivering) veroorzaakt. Na primaire infectie, VZV blijft gedurende de gehele levensduur van de gastheer beschut binnen sensorische zenuwen van de dorsale wortel ganglia. Een van de meest bedreigende infectieuze complicaties na UCBT geassocieerd met VZV 2-4. In ons klinisch centrum, in afwezigheid van VZV profylaxe, de cumulatieve incidentie van VZV ziekte VZV ziekte op 3 jaar postUCBT was 46% 2. Bij deze patiënten is de novo infectie met of reactivering van VZV vaak geassocieerd met viscerale verspreiding onder het centrale zenuwstelsel, de longen en de lever 5-7. Dientengevolge, acyclovir, valacyclovir of famciclovir profylaxe gewoonlijk toegediend aan UBCT ontvangers 8,9. Echter, deze behandelingsstrategie geen rekening gehouden met de beschermende potentieel van VZV specifieke T-lymfocyten en de kinetica van reconstitutie van VZV specifieke T cel responsen. Mogelijke problemen in verband met het toenemende gebruik van lange termijn antiherpetic profylaxe onder a) patiënt overbehandeling; b) de ontwikkeling van resistentie tegen antivirale middelen 10,11; en c) bijzondere waardevermindering van VZV specifieke immuunreconstitutie 12,13. Omdat detectie van functionele VZV-specifieke T-lymfocyten correleert met de aanwezigheid van lange termijn bescherming tegen VZV infectie en betere klinische uitkomst 4,14,15, monitoring cel-gemedieerde immuunrespons gericht tegen VZV in de periode na transplantatie kan leiden tot een rationeler gebruik van antivirale behandeling doordat artsen aan patiënten die baat hebben bij VZV onderscheiden profylaxe van degenen bij wie het immuunsysteem is in staat de controle VZV replicatie 4,13.

De IFN-γ ELISPOT wordt veel gebruikt voor het bewaken celgemedieerde immuunresponsen in verschillende experimentele systemen en klinische voorwaarden. Spots gegenereerd na de splitsing van een chromogeen substraat, het genereren van een zichtbare en stabiel precipitaat op de plaats van de reactie. Elke individuele vlek daardoor vertegenwoordigt de voetafdruk van een individuele cytokine producerende cellen. IFN-γ ELISPOT meet niet alleen het vermogen van afzonderlijke cellen ex vivo IFN-γ produceren in reactie op in vitro stimulatie met verwant antigeen, maar ook een schatting van de frequentie van reagerende cellen in een bepaalde celpopulatie 16,17. Naast de hoge gevoeligheid, IFN-γ ELISPOT is eenvoudig uit te voeren, waarbij de toepassing mogelijk in het kader van gepersonaliseerde klinische protocollen die als leidraad initiatie of beëindiging van antivirale behandeling. De onderstaande procedure describ beschrevenes een ELISPOT-assay die specifiek is ontworpen voor het opsporen en meten van de productie van IFN-γ door perifere mononucleaire cellen na in vitro stimulatie met VZV afgeleide antigenen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit onderzoek protocol werd goedgekeurd door de Institutional Ethics Review Board van CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, Canada, waar de studie werd uitgevoerd. Informed consent werd gezocht en verkregen van alle deelnemers aan de studie, hun ouders of wettelijke voogden. Alle procedures uitgevoerd op dag 1 en 2 dienen onder steriele omstandigheden (dat wil zeggen onder een laminaire stroming kap) worden uitgevoerd. Standaard veiligheidsprocedures voor het omgaan met menselijk bloed moeten strikt worden nageleefd.

1. Coating de platen

  1. Permeabilize de polyvinylideendifluoride (PVDF) membranen onder in 96 putjes MultiScreen IP witte ELISPOT platen door aan elk putje 20 ui 35% ethanol gedurende 1 minuut. Membranen moeten licht doorschijnend geworden.
  2. Spoel de wells 3 maal met 200 ul van 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2PO 4, pH 7,4) met een mulnaals pipet of soortgelijk apparaat. Deze stap is van cruciaal belang gezien het feit dat ethanol residuen levensvatbaarheid van de cellen kan beïnvloeden en binding van vangantilichaam. ELISPOT-platen zijn kwetsbaar en dient voorzichtig behandeld: het gebruik van een geautomatiseerde plaatwasser wordt afgeraden.
  3. Coat de putjes met 10 pl gezuiverd muis-anti-humaan IFN-γ capture-antilichaam verdund in 1 x PBS tot een eindconcentratie van 10 ug / ml. Bedek de platen met gewone plastic wrap en incubeer overnacht bij 4 ° C.

2. Blokkeerplaten

  1. Leeg de putten, tikken ze droog, en was platen 5 maal met 200 ul 1x PBS.
  2. Vul de putjes met 200 ul volledig RPMI 1640 medium platen en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C (blokkeringsstap).
  3. Was de plaatjes 5x met 200 ul 1x PBS en houden de putten vol 1x PBS tot cellen zijn klaar om te worden verzilverd.

3. Cell Plating en stimulatie

  1. Bereid peripheral bloed mononucleaire cellen (PBMC) uit menselijk veneuze bloedmonsters door centrifugatie op Ficoll-Paque gradiënten volgens standaardprocedures. Ook toepassing van standaardmethoden, ontdooien aliquots van PBMC onder vloeibare stikstof bevroren. Na de laatste centrifugatie, resuspendeer cellen in een eindconcentratie van 2 x 10 6 cellen / ml en incubeer overnacht bij 37 ° C onder een 5% CO2 atmosfeer in een watermantel incubator.
  2. Verwijder PBMC uit de incubator en resuspendeer ze in een eindvolume van 5 ml compleet RPMI 1640 medium.
  3. Incubeer PBMC in de aanwezigheid van 10 pi van genetisch gemanipuleerde endonuclease uit Serratia marcescens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
  4. Verwijder een 50 pl aliquot van PBMC en mengen met 50 pi van trypan blauw kleurstof. Tellen cellen en schatten% levensvatbaarheid met behulp van een hemocytometer en microscopisch onderzoek (dye uitsluiting methode). Diverse geautomatiseerde methoden voor het tellen van cellen en de beoordeling van de levensvatbaarheid van de cel kan alzodanig gebruikt. PBMC moet> 95% levend. Gooi monster wanneer de levensvatbaarheid van lager dan 95%.
  5. Centrifugeer PBMC bij 700 xg gedurende 5 min, gooi supernatant en resuspendeer cellen in AIM V-medium aangevuld met 2% (v / v) geïnactiveerd humaan serum (HIS) bij een eindconcentratie van 2 x 10 6 cellen / ml. Bewaren bij 37 ° C totdat stimulatie mengsels worden toegevoegd aan de plaat.
  6. Aan de putjes een druppelsgewijs 100 ul van de juiste stimulatie mengsel. Drie stimulatie mengsels worden gebruikt zoals hieronder beschreven:
    1. Gebruik AIM-V medium aangevuld met 2% (v / v) geïnactiveerd humaan serum (IHS) als negatieve controle.
    2. Met anti-CD3 monoklonaal antilichaam (kloon OKT3) verdund in AIM V-medium aangevuld met 2% (v / v) IHS tot een eindconcentratie van 0,5 ug / ml als positieve controle).
    3. Gebruik VZV-antigeen, in de vorm van hetzij γ-bestraalde (10.000 Gy, 30 min. belichtingstijd) levend verzwakt VZV-vaccin (1350 plaque-vormende eenheden [PFU] / ml) verdunningted 1:200 in AIM V-medium aangevuld met 2% (v / v) IHS) of 1 ug van een equimolair mengsel van 67 peptiden (15 aminozuurresten) gesynthetiseerd gebaseerd op de sequentie van het VZV onmiddellijk vroeg (IE63) fosfoproteïne . Controle bestraling werkzaamheid door monitoring van de afwezigheid van zichtbare cytopathische effecten na 4 dagen in PBMC kweken.
    4. Bereid alle putten in tweevoud.
  7. Aan de putjes een druppelsgewijs 100 ul cellen bereid in stap 5.4 tot de geschikte putjes. Twee putten moet worden overgelaten zonder cellen (negatieve controle). Incubeer 20 uur bij 37 ° C onder een 5% CO2 atmosfeer in een watermantel incubator. Niet schudden, verplaatsen, of stapelen de platen boven op elkaar tijdens incubatie.

4. Spot Ontwikkeling en Opsporing

  1. Gooi de cellen en was de platen 10x met 1x PBS aangevuld met 0,05% (v / v) Tween 20 (PBST). Tween 20 helpt los cellen die zijn toegetreden tot de PVDF mijmbrane na overnacht incubatie.
  2. Met een multichannel pipet 100 pi 0,5 mg / ml biotine geconjugeerd anti-IFN-γ monoklonaal antilichaam (kloon 4S.B3) verdund in 1 x PBS bevattende 0,5% (w / v) runderserumalbumine (BSA). Incubeer de platen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd.
  3. Was de putjes 6x met PBST en voeg elk putje 100 ui streptavidine conjugatd met alkalische fosfatase verdund 1:1000 in 1 x PBS bevattende 0,5% (w / v) BSA. Bedek de plaat en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
  4. Was de plaatjes 3x met PBST en 3x met 1x PBS. Voeg 100 ul van een 5-broom-4-chloor-3-indolyl fosfaat (BCIP) / nitro blauw tetrazolium chloride (NBT) substraat oplossing en incubeer 5 min bij kamertemperatuur geroerd.
  5. Was de plaatjes onder stromend gedestilleerd water. Verwijder het onderste gedeelte van de ELISpot plaat en was beide zijden van het membraan met gedestilleerd water. Lucht drogen de platen.
  6. Onderzoek de putten en sommen de vlekken met behulp van een stereoscopische dissection microscoop of scan de platen met behulp van een geautomatiseerde spot tegen. Houd de platen uit de buurt van licht als ze niet kunnen worden onderzocht op dezelfde dag.
    1. Gemiddeld het aantal vlekken geteld overeenkomstige duplo putjes en aftrekken van het aantal spots meegeteld negatieve controle putjes (zonder cellen) van het aantal vlekken geteld in de test wells.
    2. Express IFN-γ productie het aantal ter eenheden (SFU) per 10 6 PBMC.
    3. Bedenk dat monsters positief als het aantal SFU is> 50 10 6 PBMC en 2 standaarddeviaties (SD) boven de negatieve controle (cellen + AIM-V medium aangevuld met 2% (v / v) IHS).
    4. Gebruik een waarde van 400 SFU per putje als vlekken zijn te talrijk om te tellen.
  7. Test of ELISpot gegevens normaal verdeeld zijn of niet met behulp van de Kolmogorov-Smirnov test. Wanneer de gegevens normaal verdeeld zijn, uit te voeren statistische vergelijkingen met behulp van Student's t test (2 groepen) of ANOVA en Bonferroni post-test (meerdere vergelijkingen). Als de gegevens niet normaal verdeeld zijn, gebruik maken van de Mann-Whitney U-test (2 groepen) of de Kruskal-Wallis-test en post-test Dunn's (meerdere vergelijkingen).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De IFN-γ ELISPOT protocol hierboven beschreven werd ontwikkeld en geoptimaliseerd in ons laboratorium om de omvang en de kwaliteit van celgemedieerde immuunresponsen tegen VZV 4 meten. Diverse bronnen van VZV-antigeen kan worden gebruikt ter bevordering stap. Deze omvatten: a) de handel verkrijgbaar detergent geïnactiveerd uittreksels uit VZV geïnfecteerde Vero-cellen 18; b) pools van overlappende synthetische peptiden uit specifieke VZV gecodeerde eiwitten, waaronder IE63 15 en ORF4

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Wijzigingen en probleemoplossing: IFN-γ ELISPOT-tests werden gebruikt om celgemedieerde immuunresponsen tegen een verscheidenheid van microbiële pathogenen, waaronder humaan immunodeficiëntievirus type 1 (HIV-1) 24,25, hepatitis C virus (HCV) 26 onderzocht, 27, en Mycobacterium tuberculosis 28,29, om er maar een paar te noemen. Hier beschrijven we de ontwikkeling van een IFN-γ ELISpot test om cellulaire immuniteit tegen te meten, met de hoop van het definiëren van correlaten van...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen studie deelnemers en hun ouders bedanken. Wij zouden ook graag Dr Rejean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montreal, Canada) bedanken voor toegang tot zijn ELISpot lezer, Dr Lubo Alexandrov voor statistische analyse, en Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois en Martine Caty voor deskundige technische bijstand. Ondersteund door subsidies van le Fonds d'operation pour les projets de recherche clinique et d'Evaluatie des technologieën (CHU Sainte-Justine) aan GS en PO, door la Fondation Centre de cancérologie Charles-Bruneau, en door de Leukemia & Lymphoma Society of Canada. ISF werd ondersteund door beurzen van la Fondation CHU Sainte-Justine en le Fonds de la recherche du Quebec-sante (FRQS). AJG was de ontvanger van beurzen van de afdeling Microbiologie, infectiologie & Immunologie, Universite de Montreal (Gabriel-Marquis Scholarship), FRQS, en de Canadese Institutes of Health Rnderzoek (CIHR). NM werd ondersteund door la Fondation CHU Sainte-Justine, de Cole Foundation, en FRQS.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Leucocep buisVWR89048-936/89048-93212 ml of 50 ml buizen kunnen worden gebruikt, afhankelijk van het bloedvolume. 
Ficoll-PaqueGE Healthcare17-1440-02Bescherm tegen licht.
Benzonase nucleaseNovagen70746-3Bewaar bij -20 °C.
MultiScreenHTS-IP Filter PlateMilliporeMSIPS4W10Steriel met poriegrootte van 0,45 µm. 
Muis anti-menselijke IFN-γ captuurantilichaamBD Biosciences551221NIB42 clone. 
Pepmix VZV IE63 JPT Peptide TechnologiesPM-VZV-IE63Los de inhoud van één fles op in 40 μl DMSO. Gebruik binnen 6 maanden.
Biotine-geconjugeerd anti-IFN-γ monoklonaal antilichaamBD Biosciences5545504SB3 clone.
Streptavidine geconjugeerd met alkalische fosfatase Bio-Rad Life Science170-3554Verdun voor gebruik op dezelfde dag.
BCIP/NBTBio-Rad Life Science170-6432Bescherm tegen licht.

Referenties

  1. Ballen, K. K., et al. Umbilical cord blood transplantation: the first 25 years and beyond. Blood. 122 (4), 491-498 (2013).
  2. Vandenbosch, K., et al. Varicella-zoster virus disease is more frequent after cord blood than after bone marrow transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (8), 867-871 (2008).
  3. Barker, J. N., et al. Serious infections after unrelated donor transplantation in 136 children: impact of stem cell source. Biol. Blood Marrow Transplant. 11 (5), 362-370 (2005).
  4. Merindol, N., et al. Reconstitution of protective immune responses against cytomegalovirus and varicella zoster virus does not require disease development in pediatric recipients of umbilical cord blood transplantation. J. Immunol. 189 (10), 5016-5028 (2012).
  5. Feldman, S., et al. Varicella in children with cancer: Seventy-seven cases. Pediatrics. 56 (3), 388-397 (1975).
  6. Arvin, A. M. Varicella-Zoster virus: pathogenesis, immunity, and clinical management in hematopoietic cell transplant recipients. Biol. Blood Marrow Transplant. 6 (3), 219-230 (2000).
  7. Wiegering, V., et al. Varicella-zoster virus infections in immunocompromised patients - a single centre 6-years analysis. BMC Pediatr. 11, 31 (2011).
  8. Boeckh, M., et al. Long-term acyclovir for prevention of varicella zoster virus disease after allogeneic hematopoietic cell transplantation--a randomized double-blind placebo-controlled study. Blood. 107 (5), 1800-1805 (2006).
  9. Boeckh, M. Prevention of VZV infection in immunosuppressed patients using antiviral agents. Herpes. 13 (3), 60-65 (2006).
  10. Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: a global perspective. Biol. Blood Marrow Transplant. 15 (10), 1143-1238 (2009).
  11. Ljungman, P., et al. Long-term acyclovir prophylaxis in bone marrow transplant recipients and lymphocyte proliferation responses to herpes virus antigens in vitro. Bone Marrow Transplant. 1 (2), 185-192 (1986).
  12. Selby, P. J., et al. The prophylactic role of intravenous and long-term oral acyclovir after allogeneic bone marrow transplantation. Br. J. Cancer. 59 (3), 434-438 (1989).
  13. Distler, E., et al. Recovery of varicella-zoster virus-specific T cell immunity after T cell-depleted allogeneic transplantation requires symptomatic virus reactivation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (12), 1417-1424 (2008).
  14. Levin, M. J., et al. Decline in varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity with increasing age and boosting with a high-dose VZV vaccine. J. Infect. Dis. 188 (9), 1336-1344 (2003).
  15. Jones, L., et al. Phenotypic analysis of human CD4+ T cells specific for immediate-early 63 protein of varicella-zoster virus. Eur. J. Immunol. 37 (12), 3393-3403 (2007).
  16. Czerkinsky, C., et al. Reverse ELISPOT assay for clonal analysis of cytokine production. I. Enumeration of gamma-interferon-secreting cells. J. Immunol. Methods. 110 (1), 29-36 (1988).
  17. Hutchings, P. R., et al. The detection and enumeration of cytokine-secreting cells in mice and man and the clinical application of these assays. J. Immunol. Methods. 120 (1), 1-8 (1989).
  18. De Castro, N., et al. Varicella-zoster virus-specific cell-mediated immune responses in HIV-infected adults. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 27 (10), 1089-1097 (2011).
  19. Jones, L., et al. Persistent high frequencies of varicella-zoster virus ORF4 protein-specific CD4+ T cells after primary infection. J. Virol. 80 (19), 9772-9778 (2006).
  20. Malavige, G. N., et al. Viral load, clinical disease severity and cellular immune responses in primary varicella zoster virus infection in Sri Lanka. PLoS One. 3 (11), (2008).
  21. Sadaoka, K., et al. Measurement of varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity: comparison between VZV skin test and interferon-gamma enzyme-linked immunospot assay. J. Infect. Dis. 198 (9), 1327-1333 (2008).
  22. Smith, J. G., et al. Development and validation of a gamma interferon ELISPOT assay for quantitation of cellular immune responses to varicella-zoster virus. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8 (5), 871-879 (2001).
  23. Ouwendijk, W. J., et al. T-cell immunity to human alphaherpesviruses. Curr. Opin. Virol. 3 (4), 452-460 (2013).
  24. Rowland-Jones, S. L., et al. Cytotoxic T cell responses to multiple conserved HIV epitopes in HIV-resistant prostitutes in Nairobi. J. Clin. Invest. 102 (9), 1758-1765 (1998).
  25. Alter, G., et al. Human immunodeficiency virus (HIV)-specific effector CD8 T cell activity in patients with primary HIV infection. J. Infect. Dis. 185 (6), 755-765 (2002).
  26. Lechner, F., et al. Analysis of successful immune responses in persons infected with hepatitis C virus. J. Exp. Med. 191 (9), 1499-1512 (2000).
  27. Fournillier, A., et al. A heterologous prime/boost vaccination strategy enhances the immunogenicity of therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J. Infect. Dis. 208 (6), 1008-1019 (2013).
  28. Adetifa, I. M., et al. Interferon-γ ELISPOT as a biomarker of treatment efficacy in latent tuberculosis infection: a clinical trial. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187 (4), 439-445 (2013).
  29. Lalvani, A., Pareek, M. A 100 year update on diagnosis of tuberculosis infection. Br. Med. Bull. 93, 69-84 (2010).
  30. Berger, R., et al. A dose-response study of a live attenuated varicella-zoster virus (Oka strain) vaccine administered to adults 55 years of age and older. J. Infect. Dis. 178 Suppl. 1, (1998).
  31. Trannoy, E., et al. Vaccination of immunocompetent elderly subjects with a live attenuated Oka strain of varicella zoster virus: a randomized, controlled, dose-response trial. Vaccine. 18 (16), 1700-1706 (2000).
  32. Brunner, K. T., et al. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
  33. Moretta, A., et al. Quantitative assessment of the pool size and subset distribution of cytolytic T lymphocytes within human resting or alloactivated peripheral blood T cell populations. J. Exp. Med. 158 (2), 571-585 (1983).
  34. Jung, T., et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 159 (1-2), 197-207 (1993).
  35. Maecker, H. T., et al. Standardization of cytokine flow cytometry assays. BMC Immunol. 6, 13 (2005).
  36. Nomura, L., et al. Standardization and optimization of multiparameter intracellular cytokine staining. Cytometry A. 73 (11), 984-991 (2008).
  37. Letsch, A., Scheibenbogen, C. Quantification and characterization of specific T-cells by antigen-specific cytokine production using ELISPOT assay or intracellular cytokine staining. Methods. 31 (2), 143-149 (2003).
  38. Merindol, N., et al. Umbilical cord blood T cells respond against the Melan-A/MART-1 tumor antigen and exhibit reduced alloreactivity as compared with adult blood-derived T cells. J. Immunol. 185 (2), 856-866 (2010).
  39. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  40. Scriba, T. J., et al. Ultrasensitive detection and phenotyping of CD4+ T cells with optimized HLA class II tetramer staining. J. Immunol. 175 (10), 6334-6343 (2005).
  41. Stone, J. D., et al. Interaction of streptavidin-based peptide-MHC oligomers (tetramers) with cell-surface TCRs. J. Immunol. 187 (12), 6281-6290 (2011).
  42. Pantaleo, G., et al. Evidence for rapid disappearance of initially expanded HIV-specific CD8+ T cell clones during primary HIV infection. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94 (18), 9848-9853 (1997).
  43. Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. Immunol. 12 (6), 492-499 (2011).
  44. Boulet, S., et al. A dual color ELISPOT method for the simultaneous detection of IL-2 and IFN-gamma HIV-specific immune responses. J. Immunol. Methods. 320 (1-2), 18-29 (2007).
  45. Ahlborg, N., Axelsson, B. Dual- and triple-color fluorospot. Methods Mol. Biol. 792, 77-85 (2012).
  46. Precopio, M. L., et al. Immunization with vaccinia virus induces polyfunctional and phenotypically distinctive CD8(+) T cell responses. J. Exp. Med. 204 (6), 405-1416 (2007).
  47. Sadzot-Delvaux, C., et al. Recognition of the latency-associated immediate early protein IE63 of varicella-zoster virus by human memory T lymphocytes. J. Immunol. 159 (6), 2802-2806 (1997).
  48. Malavige, G. N., et al. IE63-specific T-cell responses associate with control of subclinical varicella zoster virus reactivation in individuals with malignancies. Br. J. Cancer. 102 (4), 727-730 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

IFN-gamma ELISpot-assayT-lymfocytenresponsVZV-antigeenstimulatieIFN-gamma-detectiePBMC-isolatiespot-enumeratieCD4+ T-cellen
Ontwikkeling van een IFN-γ ELISpot Assay aan varicella-zoster virus-specifieke-cel gemedieerde immuniteit na transplantatie van navelstrengbloed
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.