Analyse van Nephron samenstelling en functie in de Adult zebravis Kidney

Summary

De zebravis volwassen nier is een uitstekend systeem voor renale regeneratie en ziekte studies. Een essentieel aspect van dit onderzoek is de beoordeling van de nefron structuur en functie. Dit protocol beschrijft een aantal methoden die kunnen worden toegepast om nefron tubule samenstelling te beoordelen en om de renale reabsorptie evalueren.

Abstract

De zebravis model heeft zich ontpopt als een relevant systeem om ontwikkeling nieren, regeneratie en ziekte te bestuderen. Zowel de embryonale en volwassen zebravissen nieren uit functionele eenheden bekend als nefronen die sterk geconserveerd met andere vertebraten, waaronder zoogdieren. Onderzoek in de zebravis heeft onlangs aangetoond dat twee kenmerkende verschijnselen transpireren na volwassen nefronen schade lijden: ten eerste, er is robuust herstel binnen bestaande nefronen dat de vernietigde tubulus epitheelcellen vervangt; tweede, zijn geheel nieuwe nefronen geproduceerd uit renale voorouders in een proces dat bekend staat als neonephrogenesis. Daarentegen, mensen en andere zoogdieren lijken slechts een beperkte vermogen tot nefron epitheliale regeneratie hebben. Tot op heden, de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor deze nier regeneratie verschijnselen blijven slecht begrepen. Omdat volwassen zebravissen nieren ondergaan zowel nefron epitheliale regeneratie en neonephrogenesis, ze bieden een uitstekende experimentele paradigm om deze gebeurtenissen te bestuderen. Verder is er een groot aantal genetische en farmacologische hulpmiddelen op zebravis model dat kan worden gebruikt om de cellulaire en moleculaire mechanismen die nier regeneratie regelen bakenen. Een essentieel aspect van dit onderzoek is de evaluatie van nefron structuur en functie. Dit protocol beschrijft een reeks labeling technieken die kunnen worden gebruikt om renale samenstelling en testen nefron functionaliteit meten in de volwassen zebravissen nier. Aldus zijn deze werkwijzen zijn breed toepasbaar op de toekomst fenotypische karakterisatie van volwassen zebravissen nierschade paradigma, die omvatten maar zijn niet beperkt tot, nephrotoxicant blootstelling regimes of genetische methoden gerichte celdood zoals nitroreductase gemedieerde ablatie techniek. Verder kunnen deze werkwijzen worden gebruikt om genetisch verstoringen bij volwassen nier vorming bestuderen en ook kan worden toegepast op nierstatus tijdens chronische ziektemodel beoordelen.

Introduction

De nier is een complex orgaan dat een veelvoud van fysiologische functies in het lichaam vervult. De belangrijkste functie van de nieren is metabolisch afval uitscheiding, en deze taak is nauw verweven met het onderhoud van de vloeistof homeostase. De nier voert deze banen door het filteren van het bloed en de vorming van urine, terwijl gelijktijdig het reguleren van de bloeddruk, elektrolyten en zuur-base-evenwicht. Zeer gespecialiseerde epitheliale tubuli genaamd nefronen dienen als de basis-functionele eenheid van de nier ^1,2. Bij volwassen gewervelde dieren, zijn nefronen meestal georganiseerd in een strak opgerold arrangement rondom een ​​centraal afvoersysteem, waardoor voor vele buisjes in te pakken in de vrij kleine orgel. Zo kan elke humane nier meer dan 1 miljoen nefronen ³ bevatten. Andere zoogdieren als de muis te bezitten in de orde van 8-10.000 nefronen per nier ^4. De mate van verminderde complexiteit verschilt deze zoogdieren en andere vertwaterdieren gevolg van variaties in totaal nefron aantal en de architectonische ontwerp binnen de nier. Gewervelde species vormen wel drie opeenvolgende nier structuren tijdens de ontwikkeling, en iedere displays toenemende complexiteit wat nefron schenking en opstelling: de pronephros, mesonephros en metanefros. De laatste renale structuur te behouden dient als de volwassen nier orgel-meestal een mesonephros of een metanefros ^2. Elke nier vorm, echter, een nefron-gebaseerde samenstelling ^2.

De nefron is het werkpaard van de nieren en is verantwoordelijk voor bloedfiltratie naast metaboliet secretie en reabsorptie. Nefronen zijn eenvoudige buisvormige structuren bestaat uit epitheliale cellen en hebben een segmentale organisatie, waarbij discrete, zeer gespecialiseerde domeinen van gedifferentieerde epitheel te voeren specifieke taken. In de volgorde van filtraat stroom door het nefron zijn er meestal drie belangrijke onderdelen die comprise elke eenheid: (1) de renale lichaampje, (2) een buisjes met proximale, intermediate, en distale segmenten, en (3) een verzamelen kanaal ^1. Het proximale tubulus is verantwoordelijk voor de reabsorptie van organische opgeloste stoffen, met name glucose en aminozuren ^1. De tussenliggende tubulus (of lus van Henle) is een belangrijke plaats van zout en water regelgeving ^1. Tot slot, fine-tuning van zout en andere ionen optreedt in de distale tubulus en verzamelen van kabelgoten en is sterk gereguleerd door het endocriene systeem ^1. Vandaar, het filtraat reist door de ureter en blaas, uiteindelijk verlaten het lichaam als een afvalproduct ^1.

Het verlies van de nierfunctie kan het gevolg zijn van een veelheid van oorzaken die de normale nefron activiteit te voorkomen. Deze oorzaken kunnen optreden tijdens de ontwikkeling nier, bijvoorbeeld aangeboren afwijkingen die leiden tot misvorming van nefronen ^5, of oorzaken van verschillende soorten schade (als gevolg van zowel genetische en environmental afkomst). Verworven letsels zijn over het algemeen gecategoriseerd als acute nierschade (AKI) of chronische nierschade (CKD). AKI gaat een abrupt verlies van de nierfunctie, vaak als gevolg van ischemie of toxine blootstelling ^6,7. In zoogdieren, nefron epitheliale reparatie mogelijk na dergelijke verwondingen ^8, en veel mensen vertonen een volledig herstel van de nierfunctie na AKI. Echter, AKI ook geassocieerd met hoge morbiditeit en mortaliteit die zijn gerapporteerd over een breed 30 - 70% incidentie bereik ^6,7. CKD daarentegen wordt geassocieerd met progressieve verlies van nierfunctie dat resulteert uit jaren langdurige schade doorgaans geassocieerd met fibrose ^8,9. Verder bestaat er een wisselwerking tussen AKI en CKD, hetzij als men een individu kan predisponeren tot overige ^10-12. Bijvoorbeeld, degenen die hebben geleden onder AKI zijn vatbaarder voor CKD en zelfs de dood ^13. De incidentie van een nierziekte, zowel in de VS en wereldwijd, heeft epidemiolo bereiktmic proporties en zal naar verwachting toenemen als de bejaarde populatie breidt-daarom is er een groeiende behoefte aan regeneratieve geneeskunde interventies te identificeren voor de nieren ^14,15.

Ondanks de wetenschap dat AKI-patiënten kan herstellen, is het al lang gedacht dat de nier is een orgaan zonder aangeboren regeneratieve krachten. Deze traditionele visie is drastisch herzien in de afgelopen jaren ^16. Studies die nierbeschadiging in muizen en ratten na AKI gebleken dat nefron tubulus epitheelcellen kunnen prolifereren en herbouwen functionele nefronen ^17-20. Hoewel zoogdieren bezitten dit adaptief vermogen om nefronen regenereren, zijn er opvallende beperkingen en maladaptieve reacties kunnen worden veroorzaakt die leiden tot nier fibrose en CKD ^21. Bijvoorbeeld, een recente studie heeft aangetoond dat herhaalde epitheelcellen ablatie in murine nefronen werd geassocieerd met verminderde regeneratie en renale fibrose suggereert nefronen havea beperkt regeneratie drempel ^22. Er is geen bewijs dat de volwassen zoogdieren nier vormt nieuwe nefronen om verloren of beschadigde te vervangen, waardoor hun vernietiging leidt tot een permanente nefron tekort ^8,9. Interessant is dat sommige gewervelde dieren reageren op AKI door regeneratie van nefron epitheel en ook de productie van nieuwe nefronen, een proces dat ook als neonephrogenesis of nefron neogenese ^23. Neonephrogenesis komt voor in vis na blootstelling toxine of gedeeltelijke resectie, en letsel modellen hebben in het verleden onder meer de goudvis ^24,25, tilapia ^26, skate ^27, medaka ^28, en meer recent, de zebravis ^29,30. Van deze zebravis zorgen voor een levensvatbaar genetisch onderzoek model om de cellulaire en moleculaire routes die verantwoordelijk zijn voor renale regeneratie ontdekken.

In deze video artikel laten we zien hoe je nefron segmenten labelen in volwassen zebravissen. Kennis van nefron anatomie, moleculaire eigenschappen,en functionele kenmerken zijn essentieel voor een succesvolle toekomst renale studies met behulp van de zebravis. De volwassen zebravissen nier is een mesonephros structuur en is inherent minder complex qua nefron aantal en organisatie dan de metanefros structuur gevonden bij volwassen zoogdieren, avians, en reptielen ^31. Echter, zebravis nefron segmentorganisatie is analoog aan zoogdieren, en werd eerst gedocumenteerd in de embryonale nier gebaseerd op genexpressie studies ^31-35. Zebravis embryo nefronen bevatten lineaire tubulus segmenten die de proximale tubulus (PCT) bevatten rechte proximale tubulus (PST), distale vroeg (DE) en distale eind (DL) ^31-35 (Figuur 1). Zebravis volwassen nefronen bezitten gelijkaardige buisvormige segmenten ^30,31,36,37 (figuur 1). De PCT kan ook worden geïdentificeerd door een functionele fenotype: epitheelcellen in de PCT zal fluorescent gelabelde dextran verbindingen (10-70 kDa groot) aanwezig in het verwerkencirculatie, die is gebruikt in zowel de embryonale en volwassen zebravissen nier endocytotische opname bepalen van deze proximale tubulus cellen ^38-41 (Figuur 1). Een verschil in nefron segmenten tussen zebravis en zoogdieren is dat de zebravis ontbreekt een intermediaire tubulus of lus van Henle ^30-37; aangezien dit segment functies in zoogdieren om water te besparen, en de zebravis zijn een zoetwatervis zonder een dringende noodzaak om hun urine te concentreren, is het niet verwonderlijk dat de zebravis ontbreekt dit segment ^32,33. Zo wordt de totale nefron samenstelling grotendeels geconserveerd tussen de zebravis en zoogdieren nier ^32,33. Deze overeenkomsten hebben gesteld zebravis een doeltreffend onderzoeksinstrument de functies van renale expressie gebrachte genen te onderzoeken gedurende ontwikkelings nefrogenese ^32-35,42 en modelleren vele nierziekten ^43,44, nog afgezien van de aanzienlijke lijst van menselijke aandoeningen die kunnen plaatsvindt onderzocht middelszebravis ^45,46.

Vandaag de dag, de volwassen zebravissen nier is een aantrekkelijk model voor vergelijkende studies van de nierfunctie regeneratie vanwege de genetische volgzaamheid en het uitbreiden van het gehemelte van de beschikbare technologische hulpmiddelen om de functie van genen en signaalwegen ondervragen in deze soort. Verschillende studies hebben de zebravis mesonephros gebruikt om de mechanismen van regeneratie na AKI ^29,30,37 onderzoeken. Voor voortgezet AKI onderzoek met behulp van de volwassen zebravissen nier, is het essentieel om verfijnde methoden om verschillende nefron regio's en methoden te labelen om nefron functionaliteit enquête hebben. Verschillende methoden voor volwassen nier analyse zijn op basis van embryonale nier protocollen. Intraperitoneale injectie van fluorescent gelabelde dextran in de volwassen zebravissen labelt de PCT epitheel in mesonephros nefronen via endocytose ^30, zoals zebravisembryo's ^38-41 (Figuur 1). Deze werkwijze is gebruikt om visualize wanneer proximale tubuli weer hun reabsorbing pand volgende AKI, die een beoordeling van de herstelde fysiologische functie ³⁰ (figuur 1) mogelijk maakt. Een ander kenmerk van het nefron proximale tubulus is dat de epitheelcellen in dit segment een borstel rand ³⁷ die hoge niveaus van endogene alkalische fosfatase activiteit toont bezitten. Aldus kan het proximale epitheel visueel worden gelokaliseerd in de volwassen zebravissen nier met een op fluorescentie gebaseerde techniek die ELF- (Enzyme-gelabelde fluorescentie) -97 ^47.

Hier beschrijven we hoe fluorescerende dextran opname assays ^30,48 in de volwassen zebravissen nier, teneinde een functionele beoordeling van de proximale tubulus verkrijgen en kaart de grootte en de contouren van de tubulus segment. Vervolgens beschrijven we technieken om de proximale tubulus gebieden van de volwassen nefron voorzien van het fluorescentie merkteken alkalische fosfatase. Ten derde tonen we voor de eerste keer dat de Rhodamine-gemerkte lectine Dolichos biflorus agglutinine (DBA), die is gebruikt als een algemene merker van de verzamelbuizen in de zoogdierlijke nier ^49, markeert de distale tubuli van de volwassen zebravissen nier. Als DBA is wederzijds exclusief voor alkalische fosfatase vlekken, deze labels bieden een manier om in grote lijnen te onderscheiden pan-proximale versus pan-distale delen van de volwassen zebravissen nefron. Tijdens de uitvoering van deze fluorescerende vlekken in zowel hele mount en cryostaat histologische coupes, correleren we deze labels met expressie domeinen van opgeloste transporter genen die eigen is aan elke nefron segment. Daarom is dit protocol bevat ook een handleiding voor de gemodificeerde weefselverwerking procedures voor volwassen weefsel ganse berg in situ hybridisatie (WISH)-analyse op basis van onze embryo WISH protocol ^50. Deze procedures kunnen worden gebruikt in verschillende combinaties (figuur 2) te documenteren morfologische en functionele of volwassen zebravissen nier nefronen. Aldus kunnen deze protocollen worden toegepast regeneratie studies, de fenotypische karakterisatie van andere nierziekte modellen en zelfs gebruikt om de vorming van de volwassen nier bestuderen.

Protocol

De procedures voor het werken met de zebravis beschreven in dit protocol werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Notre Dame. Opmerking: Een gids voor de nieren en de nefron anatomie in de zebravis wordt verstrekt (figuur 1). Een overzicht van de in dit protocol beschreven werkwijzen wordt verschaft als een stroomschema (figuur 2) om te illustreren hoe meerdere labeling procedures worden uitgevoerd op dezelfde niermonster. Voor deel 7 op WISH voorbereiding voor volwassen nier studies, de stappen die hier aan hoe de verwerking van zebravis embryo's te wijzigen, zoals onlangs gepubliceerde ^50, een technische handleiding voor succesvolle WISH analyse van de nier orgaan verschaffen.

1 Adult zebravis intraperitoneale injectie met dextran of Interest

1. Stel de gewenste fluorescent gelabelde dextran stock (s) door oplossen van het dextran poeder in gedestilleerd water in een concentratievan 50 mg / ml, dan slaan fracties in microcentrifugebuizen bij -20 ° C in het donker. Opmerking: Various fluorescent gelabelde dextranen zijn commercieel verkrijgbaar. Selecteer het dextraan voor gebruik op basis van de combinatie van andere labels die gewenst zijn, en zorg ervoor dat de juiste fluorescerende filters zijn beschikbaar met de microscopen die zullen worden benut. Lysine-bevestigbaar dextranen vertonen fluorescentie labeling zonder verdere stappen in levende monsters losgemaakte weefselmonster van specimens gedood en vaste monsters.
2. Ontdooi de gewenste dextran voorraad en op te slaan op het ijs in het donker tijdens het uitvoeren van de stappen 1,3-1,5. Wikkel de microcentrifugebuisje in aluminiumfolie om deze te beschermen tegen licht, terwijl de behandeling.
3. Verdoven volwassen zebravissen tussen 5-7 maanden oud door het plaatsen van de vis in een schotel met hetzij 0,02% tricaïne of 0,001% 2-fenoxyethanol ongeveer 1 - 2 min. Opmerking: Het is beter om volwassen zebravissen gebruiken van deze leeftijdscategorie omdat jongere vis kan hebben small nieren die moeilijk te ontleden zijn en niermonsters uit oude vis massa van littekenweefsel die niet kunnen worden geanalyseerd bevatten. Bij juiste verdoofd, de volwassen zebravissen geen reactie vertonen op stimulatie, die kan worden getest door middel van een lepel of stompe sonde voorzichtig aanraken de staartvin van de vis aanraakt.
4. Met behulp van een plastic lepel, til de vis uit de schotel, giet de oplossing en plaatst u voorzichtig het dier op een natte spons mal, ventrale zijde naar boven.
5. Met behulp van een 31 G 1,0 cc insulinespuit Injecteer 20 pi ontdooid dextran voorraadoplossing in de intraperitoneale ruimte. Richt de naald zodat insertie plaatsvindt onder een kleine hoek de ventrale middellijn van het abdomen. Te prikken organen te voorkomen, steek de naald dan iets wordt opgetrokken zodat het lichaam muur van de vis op te heffen en een ruimte om het dextran-oplossing ⁴⁸ injecteren. Opmerking: Als alternatief kan het dextran voorraad worden verdund, bijvoorbeeld in een verhouding van 1: 2 en 1: 2 (dextran: disbewerkte water) om achtergrondfluorescentie te verminderen in het monster.
6. Voorzichtig terug de vis naar de tank om het herstel van anesthesie toe te staan. Opmerking: Opname van dextran door de proximale tubulus segment plaatsvindt binnen 8 - 12 uur en kan worden gedetecteerd ten minste tot 3 dagen na de injectie (dpi). Analyse op 3 dpi biedt een sterke tubulus signaal met een lage achtergrond fluorescentie in de renale stromale populaties. Ga verder naar deel 2 voor de hele berg onderzoek van dextran opname alleen, als er extra etikettering niet gewenst is. Voor combinatorische etikettering, gaat u verder met deel 3 aan het weefsel te bereiden voor de hele berg onderzoek van dextran opname, dan deel 4 dubbel-label met alkalische fosfatase en / of deel 5, met DBA dubbel of triple-etikettering te voeren. Voor onderzoek met behulp van histologische coupes, ga dan naar deel 6 voor instructies over hoe u fijne delen van de nier te maken met behulp van een cryostaat en hoe deze kleuren met verschillende labels en / of immunohistochemie met primaire en secundaire ANTIBodies.

2 Dissection en Flat Mount Voorbereiding van de Adult zebravis nier van een Unfixed Animal voorbeeld te visualiseren TL Dextraan Labeling van de proximale tubulus

1. Euthanaseren het-dextran geïnjecteerd volwassen zebravissen door het te plaatsen in een schaal met 0,2% tricaïne pH 7,0 voor 4-5 minuten. Opmerking: Zorg dat de vis is gedood alvorens verder te gaan, door het bewaken zorgvuldig of de kieuwen beweging hebben opgehouden en het hart is gestopt met kloppen ^36.
2. Met behulp van een plastic lepel, til de vis uit de tricaïne oplossing, wordt de oplossing en leg het dier op een tissue of papieren handdoek.
3. Gebruik een scherp paar van dissectie schaar om een ​​snee achter de kieuw operculum maken en verwijder de kop.
4. Direct naar het lichaam van de vis met de dissectie schaar door het maken van een lange ventrale incisie van het hoofd naar de basis van de staartvin.
5. Verwijder de inwendige organen van de vis met een paar fijne pincet.
6. Gebruik superfijne dissectie naalden om het lichaam wanden pin geopend teneinde visualisatie van de nier orgaan dat is aanhanger van de dorsale wand van het dier mogelijk.
7. Gebruik fijn pincet om de nier van de dorsale wand los.
8. Plaats voorzichtig de nier in een 5 ml glazen flacon met 1X PBS en was 3 keer met 3-5 ml verse 1X PBS gedurende 5 minuten elk. Opmerking: Het gebruik van een glazen flesje Behandeling van volwassen niermonsters zichtbaar maken van het weefsel en maakt wassingen met grote volumes (betrokken op het gewicht weefsel) van ongeveer 3-5 ml. Alternatief kan een 12-well celkweek schaal gebruikt. Terwijl een kunststof microcentrifugebuis kunnen worden gebruikt, zou de standaardformaat buizen (1,5 ml) het wassen beperken.
9. Verwijder de nier met een transfer pipet en plaats op een schoon glasplaatje met 1-2 druppels 1X PBS.
10. Gebruik fijn pincet om de nier te vlakken op de dia, waardoor er geen weefsel is gekruld of anderszins vernietigdzichzelf. Opmerking: Als alternatief kan een wolfraamdraad instrument worden gebruikt om kleine incisies in het bindweefsel maken platte positionering van de nier te vergemakkelijken.
11. Leg kleine stukjes klei op elke hoek van een 18 x 18 mm glazen dekglaasje en langzaam zet de dekglaasje op de nieren. Opmerking: Licht hoek het dekglaasje tijdens de plaatsing op luchtbellen in de oplossing ⁵⁰ te minimaliseren. De boetseerklei graszoden zijn ongeveer 2 mm in diameter (figuur 2A). Als alternatief kan divots van vacuüm vet worden vervangen in plaats van boetseerklei. Voeg een extra druppel 1X PBS om de ruimte tussen het dekglaasje en glaasje vul indien nodig.
12. Observeren en / of afbeelding van de nier door het plaatsen van het glaasje in het gezichtsveld van een stereomicroscoop of samengestelde microscoop met het juiste filter. Opmerking: Zie Figuur 2A voor macroscopische uiterlijk van deze voorbereiding glijbaan.

3 Fixatie, Dissection, Permeabilisatie en verwijdering van de pigmentatie van de Adult zebravis Kidney

1. Bereid een verse fixerende oplossing van 4% paraformaldehyde (PFA) / 1X PBS / 0,1% DMSO of ontdooien van een bevroren hoeveelheid van 4% PFA / 1 X PBS en voeg 0,1% DMSO. Let op: PFA is giftig en PFA oplossingen moeten op een chemische kap behandeld worden tijdens het dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, zoals handschoenen en een laboratoriumjas. Daarnaast moet PFA poeder met zorg behandeld te worden bij het maken van de stamoplossing.
2. Vul een dissectie lade met genoeg fixatief oplossing voor het hele dier onderdompelen.
3. Euthanaseren en monteer de geselecteerde zebravis in fixatie-oplossing (zie Stappen 2,2-2,6). Opmerking: De geselecteerde vis kan een onbehandelde zebravis nier exemplaar, of een nier geïsoleerd van een zebravis die eerder ontvangen een intraperitoneale dextran injectie (deel 1).
4. Fix the sample O / N (12 - 16 uur) bij ^{4 °} C.
5. De volgende dag, gebruik maken van fijne tang om de zorgvolledig los van de nier van de dorsale lichaam muur en plaats het orgel in een glazen flesje met een transfer pipet. Opmerking: Als alternatief kan een 12-well of 24-putjes schaal gebruikt. Terwijl een kunststof microcentrifugebuis kunnen worden gebruikt, zou de standaardformaat buizen (1,5 ml) het wassen beperken.
6. Was de nieren ontleed 3 maal met 3 - 5 ml 1X PBS met 0,05% Tween gedurende 5 min elk.
7. Verwijder de 1X PBS met 0,05% Tween en spoel de nieren met 3 ml van een 5% sucrose oplossing (in 1X PBS) gedurende 30 minuten.
8. Vervang met 3 ml 30% sucrose oplossing (in 1X PBS) en sla O / N (12 - 16 uur) bij ^{4 °} C. Opmerking: De sucrose oplossingen permeabilize de cellulaire membranen, vervolgens waardoor specifieke etikettering van reagentia als ze doordringen in de weefsels.
9. De volgende dag, verwijder de 30% sucrose oplossing en was de nier 2 maal met 5 ml 1X PBS met 0,05% Tween gedurende 5 min elk.
10. Vervang de 1X PBS met 0,05% Tween met 3 -5 ml bleekoplossing de melanocyt pigmentatie aanwezig op de nier orgaan verwijderd.
11. Plaats glazen flacon op een rotator en kijken aandachtig als pigmentatie verdwijnt. Opmerking: Depigmentatie duurt meestal ongeveer 20 minuten wanneer deze wordt uitgevoerd na sucrose behandeling, maar af en toe kan zolang 60 minuten duren. Wanneer het bleken oplossing links op de nier te lang kan desintegratie van het orgaan voorkomt; is het aangeraden om het monster te controleren elke 10-15 min om weefsel integriteit te controleren.
12. Wanneer de pigmentatie is verwijderd uit de nier was tweemaal met 3 - 5 ml 1X PBS met 0,05% Tween.
13. Vervang de 1X PBS met 0,05% Tween met 3 - 5 ml 4% PFA oplossing 1 uur bij kamertemperatuur.
14. Verwijder de 4% PFA-oplossing en was de nier 3 maal met 3 - 5 ml 1X PBS met 0,05% Tween gedurende 5 min elk. Let op: Zodra fixatie is voltooid, wordt de nier ook kan worden op een glasplaatje geplaatst en geëvalueerd voor dextran opname sans de melanocyten pigmentatie, door het uitvoeren van Steps 2,8-2,12.
15. Verwijder de 1X PBS met 0,05% Tween en vervangen door 3 - 5 ml blokkerende oplossing, daarna incubeer de nier bij kamertemperatuur in het blok 2 uur.
16. Bij het blokkeren is voltooid, gaat u rechtstreeks naar de geselecteerde kleuringsprotocol. Opmerking: De nier kan nu worden verwerkt via een of meer andere procedures om labeling studies met verschillende reagentia. Voor de ganse berg etikettering van de proximale tubulus met slechts alkalische fosfatase, ga dan naar Paragraaf 4 Voor ganse berg etikettering van alleen de distale tubulus ga naar punt 5 Als alternatief kunnen de afdelingen 4 en 5 uitgevoerd worden in lineaire opeenvolging voor dual detectie in hele berg .

4 Het labelen van de volwassen nier proximale tubulus Segmenten met alkalische fosfatase Detection

1. Verwijder het blok en was de nier 3 keer met 3-5 ml 1X PBS met 0,05% Tween gedurende 5 minuten elk, en vervang dan de 1X PBS met 0,05% Tween met 3-5 ml1X PBS. Laat de nier weken minimaal 10 minuten. Opmerking: Gedurende deze tijd, breng de nier een 12-well of 24-well cultuur schotel als het weefsel is in een glazen flesje voor eerdere verwerkingsstappen gehouden.
2. Vervang de 1X PBS met toereikende be alkalische fosfatase substraat oplossing (zie detectie kit in de Tabel Materials) aan de steekproef, plaats het monster op een rotator gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur daarna. Houd het beschermd tegen licht monster.
3. Stop de reactie door het wassen van de nieren in alkalische fosfatase wasbuffer oplossing.
4. Spoel de nier met 3 veranderingen wasbuffer oplossing meer dan 10 - 15 minuten. Let op: Na deze stap, ga direct naar deel 5, Stap 5.1 (dus tijdelijk weglaten Stappen 4,5-4,6) indien voor de etikettering met DBA ook gewenst is. Optionele stap: Om te labelen en te visualiseren celkernen in het orgel, genieten van de nier bij propidiumjodide oplossing. Bereid een propidiumiodide voorraad door het oplossen van het poeder in een Concentratie van 1 mg / ml (1,5 mM) in gedestilleerd water. Verdun de voorraad 500 nM in 2X SSC en incubeer de nieren in deze oplossing gedurende 30 minuten. Spoelen met 1X PBS en ga verder met stap 4.5.
5. Verwijder het wassen bufferoplossing en monteer de nier op een schoon glasplaatje in het fosfatase montage medium opgenomen in de etikettering kit (Zie stap 2,9-2,12). Opmerking: De montage medium heeft vervangen de 1X PBS uit stap 2.9.
6. Visualiseer de alkalische fosfatase gekleurd nieren met behulp van een stereomicroscoop of samengestelde microscoop met een Hoechst / DAPI filter set. Opmerking: Optionele stap: Visualiseer de propidiumiodide met een tetramethyl- rhodamine (TRITC) of Texas rood filter.

5 Afbakening van de volwassen nier distale Buisje Segmenten met Rhodamine DBA

1. Bereid een 200 ul werkende DBA oplossing door verdunnen DBA (2 mg / ml) 1 100 in 1X PBS.
2. Vervang de 1X PBS met 0,05% Tween-oplossing met 200 ul oplossing DBA.
3. Plaats op rotator voor1 uur bij kamertemperatuur.
4. Verwijder de DBA oplossing en was de nier 3 maal met 3 - 5 ml 1X PBS gedurende 5 min elk. Opmerking: Optionele stap: Om te labelen en te visualiseren celkernen in het orgel, samen met de DBA-label, genieten van de nier in DAPI oplossing op te sporen met een Hoechst / DAPI filter (rhodamine DBA vlek kan worden gedetecteerd met een TRITC of Texas rood filter). Bereid een DAPI stock door oplossen van poeder in een concentratie van 5 mg / ml (14.3 mM). Verdun de voorraad tot 300 nM in 2X SSC en incubeer de nieren in deze oplossing gedurende 20 minuten. Spoelen met 1X PBS en ga verder met stap 5.5. Als deel 4 bewerking is uitgevoerd, in gedachten houden dat DAPI en alkalische fosfatase zijn beide gedetecteerd met een Hoechst / DAPI filter.
5. Verwijder de 1X PBS en monteer de nier op een schoon glasplaatje (zie Stappen 2,9-2,12).
6. Visualiseer de-DBA gekleurd distale segmenten van de nier met een standaard TRITC of Texas rood filter ingesteld op een fluorescerende stereomicroscoop of samengestelde microscoop. Opmerking: Optionele stap: Visualiseer de DAPI met een Hoechst / DAPI filter.

6 Embedding, cryosectioning en kleuring (Vital Kleurstoffen en immunohistochemie Labeling) van Adult zebravis nierweefsel

1. Selecteer vis voor analyse, dan euthanaseren, repareren, en permeabilize zoals beschreven (Stappen 3,2-3,8). Opmerking: Fix volwassen vissen in 9: 1 ethanol: formaldehyde / 0,1% DMSO in plaats van 4% paraformaldehyde / 1X PBS / 0,1% DMSO voor cryosectie procedure gedeelten te produceren voor dextran, alkalische fosfatase en DBA visualisatie. Echter, in gedachten houden dat-paraformaldehyde gebaseerd fixaties compatibel voor sommige immunohistochemie procedures kan zijn. Verder wordt het bleken van de volwassen nier niet noodzakelijk voor cryosectie analyse, omdat de melanocyten zijn oppervlakkig en laten visualiseren nefron cellen die bestaat uit de "binnenzijde" van de nier orgaan.
2. De volgende dag, verwijder dan de 30% sucrose-oplossing en te vervangen door 1: 1 weefsel bevriezen medium: 30% sucrose 4 uur bij kamertemperatuur.
3. Verwijder het 1: 1 oplossing en verankeren niermonsters 100% tissue freezing medium cryomolds en plaats bij -80 ^o C gedurende ten minste 1 uur.
4. Dwars doorgesneden seriecoupes ongeveer 12 urn dik, door de hele volwassen nier.
5. Monteer bevroren op vriescoupes lijm objectglaasjes en aan de lucht drogen gedurende 1 uur bij 50 ^° C.
6. WINKEL glijdt bij -80 ^o C tot gebruik.
7. Wanneer vriescoupes zijn klaar om te worden gelabeld, verwijder de objectglaasjes van -80 ^o C en plaats op dia warmer bij 50 ^o C gedurende 45 minuten.
8. Met behulp van een vloeistof blocker pen, trek een cirkel rond de vriescoupes en laat drogen gedurende 15 minuten op de dia warmer bij 50 ^o C.
9. Verwijder dia's van de glijbaan warmer en leg plat in een vochtige kamer bij kamertemperatuur.
10. Hydrateren de cryosecties door toevoeging 1X PBS met 0,05% Tween het omcirkelde gedeelte van de objectglaasjes gedurende 20 minuten. Opmerking: Ongeveer 200-300 &# 956; l is nodig om elke omcirkelde gedeelte op een dia te dekken.
11. Vervang de 1X PBS met 0,05% Tween-oplossing met verse 1X PBS en incubeer gedurende 10 minuten.
12. Verwijder 1X PBS en incubeer cryosecties in een blokkerende oplossing gedurende 2 uur. Opmerking: Voor een 10 ml blokkerende oplossing combineren 8 ml 1X PBS met 0,05% Tween, 2 ml foetaal kalfsserum en 150 ul DMSO. Voor immunohistochemie voeren na de blokkeringsstap, incubeer de schuif met de gewenste primaire antilichaam verdund in vers blok O / N bij ^{4 °} C, wassen keer met 1X PBS met 0,05% Tween Incubeer 2 uur bij kamertemperatuur met secundair antilichaam verdund in 1X PBS met 0,05% Tween, wast een keer met 1X PBS met 0,05% Tween, en monteer een dekglaasje op de dia met de montage medium. De vereiste antilichaam verdunningen variëren en proeven worden uitgevoerd om de optimale verdunningen selecteren. Antigen herstel kan ook immunolabeling vergemakkelijken, en wordt uitgevoerd vóór het blokkeren. Onmiddellijk na dia's worden ontdooid bij 50 ^o C(Stap 6.8) incubeer de cryosecties tussen 95 ^{o C-100} ° C gedurende 40 min in voorverwarmde 10 mM natriumcitraatbuffer. Koel de dia's voor 30 minuten, daarna twee keer wassen in 1X PBS met 0,05% Tween, en ga verder met stap 6.11.
13. Verwijder de blokkerende oplossing en was vriescoupes 3 keer met 1X PBS gedurende 5 min elk.
14. Vervang 1X PBS met DBA kleuroplossing en incubeer gedurende 1 uur. Noot: Verdun 1 pl DBA in 99 pi 1X PBS aan 100 gl kleuroplossing maken.
15. Verwijder de DBA kleuroplossing en was vriescoupes 3 keer met 1X PBS gedurende 5 min elk.
16. Toepassen alkalische fosfatase label en incubeer op vriescoupes voor 10 minuten.
17. Was alkalische fosfatase van de cryosecties met een reeks van 3 wassingen wasbuffer gedurende 10 minuten elk. Opmerking: Voor 100 ml oplossing van wasbuffer combineren 5 ml 0,5 M EDTA en 120 mg levamisol in 95 ml 1X PBS. Om kernen te labelen, incubeer de secties met propidiumjodide of DAPI bij de disingen eerder opgemerkt (stap 4.4, 5.4, respectievelijk) gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Selecteer een nucleaire vlek verenigbaar met de combinatie van andere fluorescente vlekken die zijn gekozen.
18. Verwijder alle vloeistof uit de vriescoupes en plaats 2 druppels montage medium op de microscoop dia.
19. Plaats micro dekking van glas voorzichtig op het objectglaasje. Vriescoupes zijn nu klaar om het met de juiste filter (s).

7 WISH Verwerking voor Adult zebravis Kidney Samples

1. Selecteer de gewenste zebravis specimen (s), euthanaseren, repareren en ontleden de nier zoals beschreven (Steps 3.1-3.5). Opmerking: Het is essentieel om een ​​fixeermiddel oplossing van 4% paraformaldehyde (PFA) gebruiken / 1X PBS met 0,1% DMSO aan de nieren permeabilize. Plaats de nier in een glazen flesje voor eenvoudige visualisatie daaropvolgende verwerkingsstappen.
2. Verwijder het fixeermiddel en was de nier tweemaal met 5 ml 1X PBST.
3. Verwijder de 1X PBS en was de nier tweemaal with 100% methanol, vervolgens incubeer de nier bij ^-20 ° C gedurende ten minste 20 min te permeabiliseren. Opmerking: Ontleed nieren kan onbeperkt worden opgeslagen -20 ^o C.
4. Hydrateren de nieren, met een serie van 5 min wassingen met 3-5 ml 50% methanol / 1X PBST, 30% methanol / 1X PBST en tweemaal met 1X PBST.
5. Bleken de nieren om pigmentatie te verwijderen zoals beschreven (Stappen 3,10-3,14).
6. Behandel de nier met 10 ug / ml proteïnase K / 1X PBST met 0,1% DMSO gedurende 20 minuten en spoel tweemaal met 1X PBST en post-fix in 4% PFA / 1X PBST gedurende 20 min bij O / N. Opmerking: bereid altijd proteinase K werkoplossing onmiddellijk voor destructie door het combineren van 50 ui vers ontdooide proteinase K voorraad (10 mg / ml), 50 ml 1X PBST en 50 pl DMSO.
7. Verwerk de nier voor enkele of dubbele WISH volgt de stappen voor riboprobe synthese, prehybridisatie, hybridisatie, anti-digoxygenine / anti-fluoroscein antilichaam incubatie en detectie zoals onlangs beschreven ^49. Opmerking: Hele monteren beeldvorming van de nieren vlekken moet binnen enkele dagen van het uitvoeren van de kleuringsreactie worden uitgevoerd. Nephron vlekken neiging hebben om snel vervagen, vooral rood substraat labels. Voor nefron fotografie, platte monteer de nier monster zoals hierboven beschreven in de stappen 2,10-2,12, en het beeld met behulp van een stereo of samengestelde microscoop. Differentieel interferentiecontrast filters kunnen worden toegepast om de cellulaire contouren van nefronen beter visualiseren monsteranalyse vergemakkelijken.

Results

Elk van de protocollen werd uitgevoerd op wild type zebravis. Voorbeelden van de gegevens verkregen document de normale structurele samenstelling en eigenschappen van de nefronen in de gezonde volwassen zebravissen nier. De volwassen zebravissen bezit een mesonephros of tweede nier vorm die is gelegen op de dorsale lichaamswand (Figuur 1A). De volwassen nier is relatief vlak en bevat een zogenaamd hoofd, romp en staart regio met oppervlakkige melanocyten verspreid over deze gebieden (figuur 1A). Het nierweefsel bevat vertakte arrays van nefronen die verbinding en afvoer naar het centrum verzamelen kanalen (Figuur 1A). Elk nefron gepolariseerd langs zijn lengte, met een bloedfilter (of renale bloedlichaampjes) aan een uiteinde, gevolgd door een reeks tubulus segmenten, en tenslotte eindigt bij een kanaal dat de oplossing die wordt uitgescheiden (Figuur 1A) verzamelt. Elke volwassene nefron tubulus bevat proximale en distale segmentatiets cellen, afgebakend door de expressie van specifieke opgeloste stof transporters ^30,31,36,37, die geconserveerd met het segmentaal patroon vertoond door embryonale nefronen ^31-35 (Figuur 1B). Bijvoorbeeld, cubilin transcripties markeer de proximale tubulus ³⁹ (PCT en PST) en clcnk transcripties markeer de distale tubulus ³² (DE en DL) (Figuur 1B). Verder is de PCT-segment onderscheidt zich door expressie van slc20a1a, de PST wordt onderscheiden door expressie van slc13a1, is het DE gekenmerkt door expressie van slc12a1, en ​​de DL wordt gekenmerkt door expressie van slc12a3 ³²   (Figuur 1B). Verschillen tussen volwassen nefron buisjes vergeleken met embryonale degenen zijn die de distale segmenten tonen windingen (DE, DL) en de DL-segment takken uitvoerig in de volwassene, die zich onderscheidt van de lineaire, niet-vertakte anatomie van deze regio's in de embr isyo ^30,31,36,37 (figuur 1A). Zowel volwassen als embryonale ^{30 38-41} nefron tubuli, kan de PCT epitheel worden onderscheiden door de endocytische eigenschappen en kunnen worden gevisualiseerd en beoordeeld reabsorptive functie gebaseerd op het vermogen om fluorescent dextran conjugaten (Figuur 1B)-gebruik op. Verder, zoals aangetoond in de volgende figuren, de volwassen proximale tubulus (PCT en PST of pan-proximaal gebied) gelabeld door alkalische fosfatase, terwijl het distale tubulus (D en DL of de pan-distale gebied) wordt gelabeld DBA (Figuur 1B). De werkwijzen hierin gebruikt labelen volwassen zebravissen nefron segmenten met dextran opname, alkalische fosfatase, DBA, immunohistochemie of WISH kan worden uitgevoerd in verschillende combinaties, geheel mount of histologische coupes van nierweefsel (figuur 2). Dit zorgt voor een grote flexibiliteit en variëteit wanneer nefron samenstelling worden beoordeeld (Figuur 2).

De volwassen nier kan plat op een glasplaatje voor analyse worden gemonteerd, met divots boetseerklei (of als alternatief vacuüm vet) gebruikt om het dekglaasje over het weefsel (Figuur 3A) opschorten. Omdat de typische nier lengte ongeveer 5-7 mm, heeft een afmeting bevorderlijk beeldvorming op een stereo of samengestelde microscoop (Figuur 3A). Onder helderveld verlichting kan een oppervlakkige populatie van melanocyten zwart gepigmenteerd worden gevisualiseerd samen met het nierweefsel en vasculatuur zoals de aorta zichtbaar omdat het circulerende erytrocyten een rode tint (Figuur 3B). Na intraperitoneale injectie van dextran-FITC, werden PCT domeinen verspreid over de mesonephros nog steeds gelabeld 3 dagen later, en in beeld gebracht met behulp van een FITC-filter op een fluorescentiemicroscoop (Figuur 3C). Terwijl melanocyten gedeeltelijk verduisteren de visualisatie van individuele nierbuisjes (Figure 3C), hebben de melanocyten geen kwantificering van nefron nummer of de evaluatie van tubulus diameter en lengte voorkomen. Na intraperitoneale injectie van dextran fluor-robijn, bleken van de vaste monster elimineerde de melanocyten pigmentatie, en PCT segmenten werden waargenomen met helderveld verlichting alleen (Figuur 3D). Vetdruppels van de buik lichaamsholte soms door samen met hele nier orgaanpreparaten (figuur 3A) .Individual PCT-segmenten laten windingen, spoelen (figuur 3D), maar ook kan worden gekenmerkt door een relatief lineaire stukken (figuur 3D ").

Verschillende dextran conjugaten verschillende totale helderheid in proximale tubulus labeling. In het bijzonder, dextran-FITC of dextran fluor-ruby leidde tot nefron labels met minimale achtergrond (Figuren 3C-D ") krokant. Zowel de dextran cascade blue en lucifer geel conjugaten vertoonden proximale tubulus opname in de volwassen nier (Figuur 4A, 4B). Interessant, nieren blootgesteld aan dextran cascade blauw toonde relatief specifieke PCT fluorescentie met wat achtergrond (Figuur 4A, 4A '), terwijl de nieren blootgesteld aan dextran lucifer gele PCT segmenten had bestempeld, maar toonde merkbaar achtergrond signaal, met niet-specifieke fluorescerende kleuring aanwezig in het hele de renale stroma of de ruimte tussen de nefronen (figuur 4B, 4B). Tenslotte, het gebruik van dextran-fluor ruby ontvangen superior proximale tubulus labeling, met minimale of geen achtergrond zelfs wanneer bekeken op een afstand van verschillende vergrotingen (Figuur 4C, 4C). In alle gevallen, het onderscheidend buisvormige patroon van dextran conjugaat opname gecorreleerd met de WISH expressie van transcripten coderend slc20a1a, een gevestigde PCT-specifieke marker ^30-32 (Figuur 4D). Nephron PCT segmenten gekleurd met slc20a1a antisense riboprobe weergegeven S-vormige PCT spoelen, evenals minder sterk opgerold PCT segmenten (Figuur 4D), zoals waargenomen tijdens gelabeld dextran conjugaat assays (figuur 3D, 3D ").

Andere nier preparaten, zoals detectie van het proximale tubulus alkalische fosfatase (figuur 5A, 5B, 5C) werden op soortgelijke wijze uitgevoerd na verwijdering van de melanocyt pigmentatie. Dit liet proximale tubulus nefron beeldvorming en analyse zonder enige belemmering. Endogene alkaline fosfatase reactiviteit in het nefron is een belangrijk kenmerk van de proximale tubulus ^1,47. Alkalische fosfatase kleuring zeer specifiek proximale nefron regio vergeleken met de pan-proximale WISH expressiepatroon van het gen cubilin ³⁹ (figuur 5D, 5D). Alkalische fosfatase reactiviteit was het meest intens in de sparste deel van de proximale tubulus die overeenkomt met de PCT (figuur 5B), vergelijkbaar met het patroon van cubilin expressie (Figuur 5D, 5D), die bovendien hoogste relatieve transcriptniveaus in de PCT. De PCT werd gekenmerkt door de iets bredere diameter, specifieke expressie van de transcriptiefactor mafba (Figuur 5E, 5E '), en de specifieke uitdrukking van de opgeloste stof transporter gen slc20a1a (Figuur 4D, 4D'). Alkalische fosfatase gemerkt reactiviteit ook een stuk proximale tubulus met een dunnere diameter die overeenkomt met de PST segment (Figuur 5B) op basis van vergelijking met de segment-specifieke transcript expressie van de opgeloste stof transporter gen slc13a1 (Figuur 5F, 5F). De WISH expressie domeinen van het PCT marker slc20a1a en PST marker slc13a1 elkaar uitsluiten (figuur 5G ), en grondig onderzoek van enkele nefronen bleek dat deze domeinen grenzen aan, met weinig of geen ruimte tussen hen, en dat ze samen recapituleren de uitdrukking domein cubilin (zwarte pijlpunten in. figuur 5G ', 5G ", 5G"' ).

Om de relatie van alkalische fosfatase reactiviteit met proximale tubulus identiteit verder te bevestigen, geheel monteren co-etikettering van alkalische fosfatase kleuring werd uitgevoerd op de nieren van de zebravis dat een intraperitoneale injectie van dextran fluor-ruby 3 dagen voor (figuur 6A-C) ontvangen. Dextran fluor-ruby overlap vertoonde met alkalische fosfatase in slechts het gedeelte bredere diameter van de proximale tubulus domein dat overeenkomt met de PCT (voorbeelden in figuur 6D-I). De dextran-positieve domein abrupt gestopt op de plaats waar de diameter van de proximale tubulus verdund, dat wil zeggen wanneer de PCT en PST voldaan (witte pijlheads in figuur 6) en alkaline fosfatase reactiviteit werd waargenomen in de daaropvolgende PST segment (voorbeelden in figuur 6D-I). Achtergrond fluorescentie van de alkalische fosfatase reactie ook slecht licht de paar evenwijdige bekende verzamelbuis titels in de volwassen nier ^29,30 -ducts die zich onderscheiden doordat de breedste diameter van elke renale geassocieerde tube (sterretjes in figuur 6A, 6D, 6E, 6G, 6H). Vervolgens wordt de co-etikettering van nefron buisjes met alkalische fosfatase en dextran opname werd gezien in cryosectie analyse (figuur 6J, tubulus perimeters geschetst met witte stippen). In dwarsdoorsnede is het alkalische fosfatase reactiviteit vastgesteld in een dikke band in het apicale oppervlak van de tubulaire epitheel overeenstemming met brush border ultrastructuur, terwijl de corresponderende buisvormige cel cytosolische ruimte toonde dextran fluor-ruby reactiviteit (figuur 6J). Opmerkelijk stained buisjes waren ofwel dubbel positief voor alkalische fosfatase en dextran, wat leidt tot hun identificatie als PCT segmenten, of afzonderlijk positief voor alkalische fosfatase (figuur 6J, tubule omtrek geschetst in gele stippen), wat leidt tot een identificatie als een PST-segment (let op: andere tubules aanwezig waren negatief voor beide vlekken, gegevens niet getoond) (figuur 6J). Verder werd alkalische fosfatase kleuring (Figuur 6K) succesvol gecombineerd met een nucleaire label, propidium iodide (Figuur 6L) vergemakkelijkt celtellingen (overlay in Figuur 6M).

Het distale tubulus van de volwassen zebravissen nefron werd gelabeld met rhodamine geconjugeerd DBA (figuur 7). Ganse berg double-labeling met DBA en alkalische fosfatase werd uitgevoerd op de nieren van wildtype zebravis (Figuur 7A-C). DBA en alkalische fosfatase reactiviteit vertoonden geen overlap in nefron tubuli ( Figuur 7D-H). DBA gekleurd buisjes toonde een duidelijk dunnere diameter ten opzichte van alkalische fosfatase positieve buisjes, en DBA buisjes werden vaak vertakt (witte pijlpunten, figuur 7G, 7H, 7 J), terwijl vertakking nooit werd waargenomen in tubulus segmenten gekleurd met alkalische fosfatase. Renale cryosecties werden vanuit wildtype zebravis die een transgen waarin de enpep promoter eGFP uitvoeren (Tg: enpep: eGFP), zoals GFP labels zowel de proximale en distale nefron tubuli ⁵¹ (Figuur 7I). Immunohistochemie werd uitgevoerd om te detecteren GFP, zodat alle van de renale tubuli (groen Figuur 7I) label, gevolgd door fluorescente labeling met alkalische fosfatase en DBA (turquoise en rood respectievelijk Figuur 7I). Analyse van de tubulus secties bleek dat buisjes waren ofwel positief voor alkalische fosfatase of DBA, maar niet beide labels (Figuur 7I). Alleen zeldzame tubules toonde reactiviteit met noch alkalische fosfatase noch DBA vlek, mogelijk als gevolg van de hoek van het gedeelte buisje (witte pijl Figuur 7I). Verder werd DBA vlekken met succes gecombineerd geheel monteren nier kleuring met de nucleaire label DAPI (Figuur 7J), opnieuw de nadruk op de karakteristieke vertakte aard van de distale tubulus segmenten (witte pijlpunten, Figuur 7J).

Vervolgens verder de patronen van dextran-FITC opname, alkalische fosfatase en DBA vergelijken, werd triple kenmerken onderzocht door intraperitoneaal injecteren volwassen zebravissen met dextran-FITC, gevolgd door isolatie nieren 3 dagen later gevolgd door cryosectioning en kleuring voor alkalische fosfatase en DBA (voorbeelden in figuur 8A-E). Nierbuisjes toonde drie categorieën label combinaties: buisjes die dubbel positief voor alkalische fosfatase en dextran aangeduid PCT segmenten (witte stippellijnen), Tubul warenes positief voor alkalische fosfatase alleen aangeduid PST segmenten (gele stippellijnen), en distale tubuli werden bestempeld door gewoon DBA (rode stippellijn schetst figuur 8A-E). Verder alleen DBA positieve buisjes vertoonden vertakkingspunten (figuur 8E). Door WISH analyse Dit karakteristieke vertakking van de distale tubuli DBA positief gecorreleerd met de genexpressiepatronen solute transporter transcripten die specifiek voor distale tubulus segmenten (Figuur 8F-I). Transcripties die clcnk, waarin het gehele distale tubulus (DE en DL) markeert waren dun in diameter, overvloedig in de nieren, en bevatte tak punten (zwarte pijlpunt figuur 8F, 8F '). Ter vergelijking, tubule segmenten die uitdrukking van slc12a1 of slc12a3, die markers van de DE en DL zijn vertoonden, respectievelijk, waren minder talrijk in niermonsters algehele vergelijking met expressie clcnk (vergelijk figuur 8 G en 8F, 8H). Verder tubule segmenten die slc12a1 uitgedrukt waren zelden of nooit, vertakt (Figuur 8G, 8G '), terwijl tubule regio's die slc12a3 uitgedrukt werden vaak vertakt in karakteristieke Pinwheel-achtige arrangementen (Figuur 8H, 8H, 8H ", 8H"' , zwarte pijlpunten). Dubbelklik ten slotte WISH voor de PCT marker slc20a1a en de distale marker clcnk bleek dat deze vlekken niet werden overlappende (Figuur 8I). Met name werden de stukken van slc20a1a -expressie PCT segmenten niet gehecht aan -expressie buisjes, die werd verwacht, omdat de PST is gelegen tussen deze regio's (Figuur 8I) clcnk. Samen genomen, het testen van het labelen van niertubuli met dextran opname, alkalische fosfatase reactiviteit, DBA, en wensen voor specifiek gen transcripties, maakt het onderscheiden van proximale versus distale segmenten.

t "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figuur 1 Nephron anatomie in de volwassen zebravissen nier. Schematische tekeningen van de (A) volwassen zebravissen nier en (B) een vergelijkingstabel van segment moleculaire kenmerken tentoongesteld door volwassen en embryonale zebravis nefronen. (A) (linksboven) De volwassen nier is een plat orgaan op het dorsale lichaamswand. (Rechtsboven), wanneer bekeken vanuit een ventrale perspectief, de nier heeft een kenmerkende gebogen morfologie, dat bestaat uit het hoofd, romp en staart regio's, en heeft ook een oppervlakte bevolking van de bijbehorende melanocyten. Uitbreiding (linksonder) toont een schema van een typische nefron boom in de volwassen zebravissen nier, waarbij elke afzonderlijke nefron bezit een bloedfilter (renale bloedlichaampjes) aan een uiteinde, gevolgd door een proximale tubulus, distale tubulus en kanaal. Gekleurde schema (bottom rechts) toont een lineair diagram van een volwassene nefron boom segmentkenmerken met die van embryonale nefronen (B). De zebravis embryo nefronen bevatten tubule segmenten die de proximale tubulus (PCT), proximale tubulus straight (PST), distale vroeg (DE), en distale eind (DL) bevatten, met de respectieve genexpressie domeinen hieronder vermeld. Nefronen in de volwassen zebravissen hebben een vergelijkbare segmentale samenstelling en analoge moleculaire handtekening gebaseerd op de expressie van genen die domeinen opgeloste vervoerders coderen, hoewel een opmerkelijk verschil ten opzichte van het embryo is dat een aantal nefronen kan worden verenigd door een vertakt DL segment. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2 Stroomdiagram map informatie over de samenhang tussen de werkwijzen afgebeeld in dit protocol aangeeft hoe de werkwijzen alleen of in diverse combinaties kunnen worden uitgevoerd. Na intraperitoneale injectie van gelabeld lysine-fixeerbaar dextran in de volwassen zebravissen kunnen de nieren worden gevisualiseerd in een ganse berg bereiding, alleen of in combinatie met alkalische fosfatase en / of DBA vlekken. Als alternatief kan de geselecteerde zebravis nier onderzocht na histologische weefsel snijden met een cryostaat. De secties worden gekleurd talrijke combinaties van kenmerken label, middels immunohistochemie, nucleaire kleuring, DBA kleuring en / of alkalische fosfatase reactiviteit. Bovendien kunnen renale secties direct gevisualiseerd op de aanwezigheid van lysine-fixeerbaar dextran opname in PCT segmenten. Tot slot kan gekozen nieren worden verwerkt voor de spatiotemporele expressie van genexpressie met WISH. Cijfers tussen haakjes verwijzen naar corresponding protocol delen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3 volwassen zebravis nier plat monteren voorbereiding en toepassing op geconjugeerde dextran opname te visualiseren in de PCT-segment van de nieren nefronen. (A) Helderveld beeld van een nier specimen vlak mount preparaat waarin het orgel vlak gepositioneerd op een glasplaatje, een dekglaasje bovenop het weefsel dat rust op vier graszoden boetseerklei (roze kleur). Hier de renale voorbereiding wordt afgebeeld naast een metrische liniaal om een ​​verkleinde vergelijking bieden. De typische volwassen nier is ongeveer 5-7 millimeter (mm) van kop tot staart. (B) Helderveld beeld van een ongebleektnier. De zwarte pigmentatie overeen met de verspreide populatie van melanocyten gevonden in associatie met de nieren en de aorta langs de middellijn van de nier. (C) Visualisatie van nefron PCT segmenten 3 dagen na intraperitoneale injectie van 40 kDa dextran-fluoresceïne (FITC) , zonder bleking van de volwassen nier. PCT segmenten gezien tijdens de nier maar gedeeltelijk bedekt door de melanocyten. (C) Digitale zoom van een nefron, met melanocyten (witte pijl). (D) Afbeelding van een volwassen nier 3 dagen na intraperitoneale injectie van 10 kDa dextran fluor-ruby, fixatie van de nier, en bleken. De melanocyt pigmentatie werd verwijderd en de PCT's werden gevisualiseerd hier op basis van hun endocytische opname van dextran onder helderveld verlichting. Vetdruppels (pijl) van de buik soms door samen met renale weefselmonsters. (D ', D ") Reprewoordiger beelden verbeelden kleine morfologische verschillen tussen PCT segmenten. Terwijl veel nefron PCT strak opgerold (D '), andere nefronen bevatten PCT's dat minimaal coiling (D') hebben. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

. Figuur 4 Volwassenen nier nephron PCT tubulus segment labeling Wildtype zebravis werden intraperitoneaal geïnjecteerd met een fluorescent dextran conjugaat; dan is hun nier onderzocht 3 dagen na de injectie PCT visualisatie. (A, A ') Dextran cascade blue, 10 kDa (B, B') dextran lucifer geel, 10 kDa en (C, C ') dextran f luoro-robijn, 10 kDa alle bij voorkeur het etiket van de PCT-segmenten in de renale nefronen. Beide dextran cascade blauw en lucifer gele tonen enkele niet-specifieke etikettering van stromale cel populatie ligt tussen nefronen, met veel hogere achtergrond waargenomen in lucifer gele behandeld nieren. Daarentegen dextran fluor-ruby bleek dramatisch gereduceerde achtergrond met intense PCT labeling. (D, D ') Een volwassen nieren gekleurd door WISH om de locatie van transcripties die slc20a1a, een specifieke merker van het type PCT transporter cel detecteren. De uitdrukking domein slc20a1a overeenkomt met het karakteristieke patroon van dextran opname waargenomen in de nieren, met een verdeling van de diverse strak opgerolde / doorgelust PCT domeinen evenals meer langwerpige PCT strekt dat een consistent grote diameter laten zien. Klik hier om een grotere versie te bekijken van dit cijfer.

NHOUD "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figuur 5 Vertegenwoordiger gevolg van kleuring voor alkalische fosfatase, een pan-proximale tubulus marker, in de volwassen zebravissen nier in vergelijking met andere proximale tubulus markers gemeten met WISH. (AC) Alkaline fosfatase kleuring (turquoise) verlicht de nefron proximale tubulus, belicht zowel de PCT en PST. (DF) Single WISH voor de vermelde genen (elk in paarse vlekken). (D, D ') Het expressiepatroon van cubilin , een pan-proximale (PCT-PST) marker, correleert met alkalische fosfatase (D, D '). Ter vergelijking, WISH voor mafba markeert het PCT (E, E ') en slc13a1 markeert de PST (F, F'). In (GG ") dubbele WISH voor de PCT marker slc20a1a </ Em> (rood) en de PST marker slc13a1 (paars) laat zien dat de segmenten gelabeld door deze markers niet overlappen, en in plaats van dat hun expressie domeinen bezetten naburige plaatsen als enkele nefronen nauw worden onderzocht (G'-G "'). Zwarte pijlen geven de kruising tussen PCT en PST-segmenten, die doorgaans gepaard gaat met een verandering in het buisje met een diameter van groot tot klein, respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6 Alkaline fosfatase en dextran opname tonen overlap in de PCT-segment van de volwassen nier nefronen, en alkalische fosfatase kleuring is compatibel met nucleaire co-labeling met propidiumjodide. (AI) Hele monteren voorbereidingen van alkalische fosfatase kleuring uitgevoerd op de nieren van de zebravis volwassenen die eerder had ontvangen een intraperitoneale injectie van dextran fluor-robijn. Alkalische fosfatase (turquoise) en dextran fluor-ruby (red) toon overlap in de PCT, maar niet in de PST, die alleen positief voor alkalische fosfatase. Achtergrond niveaus van alkalisch fosfatase verlichten de paar grote verzamelbuizen in de nieren (asterisks, *), die onderscheidend zijn door hun grote diameter. (AC) Samengevoegd beeld en afzonderlijke afbeeldingen van het zadel gebied van een enkele nier. (DF) en (GI) Twee sets van samengevoegde beelden en afzonderlijke afbeeldingen van bijvoorbeeld nefronen. (I) cryosectie analyse bevestigt co-etikettering van alkalische fosfatase en dextran fluor-ruby in PCT segmenten (geschetst in witte stippen), terwijl de alkalische fosfatase alleen labelt de PST segment (geschetst in gele stippen). (KM) Een nier wasgelabeld met (K) alkalische fosfatase (turquoise) en (L) propidiumiodide (paars), waardoor de (M) samengevoegd visualisatie van proximale tubulus cellen en hun kernen, respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 7 Alkaline fosfatase en DBA zijn wederzijds exclusief segment labels die de pan-proximale en distale pan-regio's, respectievelijk markeren, aanwezig in volwassen zebravissen nier nefronen. (AH) Whole mount voorbereidingen van een zebravis nier gekleurd met alkalische fosfatase en rhodamine-DBA. Alkalische fosfatase (turquoise) en DBA (rood) niet overlap in de nier te laten zien. Achtergrond niveaus van alkalische -fosfatase verlichten het paar grote verzamelbuizen in de nieren (asterisks, *), die onderscheidend zijn door hun grote diameter. DBA positieve buisjes dunner in diameter en vaak gekenmerkt door de aanwezigheid van vertakkingspunten (witte pijlpunten). (AC) Samengevoegd beeld en afzonderlijke afbeeldingen van het zadel gebied van een enkele nier. (DF) Een set samengevoegde afbeeldingen en afzonderlijke afbeeldingen Bijvoorbeeld nefronen. (G, H) Extra voorbeelden, met vertakte DBA buisjes naast alkalische fosfatase positieve buisjes, samengevoegd beelden. (I) cryosectie analyse bevestigt dat de alkalische fosfatase en DBA label verschillende tubulus secties, en slechts zelden buisjes zien noch label (witte pijl ), waarschijnlijk te wijten aan de hoek van de sectie voor dat buisje. Voor deze analyse wildtype transgene vis, Tg: enpep: eGFP, gebruikt en alle renale tubuli in de nieren werden immunologisch met een primair antilichaam tegen GFP detecteren (J). Hele monteren nier kleuring voor DBA (rood) en DAPI (blauw) (samengevoegde afbeelding), opnieuw met de vertakte distale tubulus segmenten van de volwassen nefronen (witte pijl). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 8 Triple etikettering van volwassen nier vriescoupes met dextran opname, alkalische fosfatase en DBA tegenover distale segment WISH analyse. (AE) volwassen nieren werden intraperitoneaal geïnjecteerd met dextran-FITC (groen), en de nieren verzameld 3 dagen later voor het inbedden en cryosectioning. Kleuring met alkalische fosfatase (turquoise) en DBA (rood) onthulde drie populaties van de buisjes: PCT segmenten die positief zijn voor alkalische fosfatase reactiviteit en DEXT warenliep (geschetst in witte stippen), PST segmenten die positief waren alleen voor alkalische fosfatase reactiviteit (geschetst in gele stippen) en de distale tubulus segmenten die positief voor DBA alleen (die in rode stippen) die ook toonde karakteristieke distale tak punten waren. ( AD) Samengevoegd imago en de afzonderlijke beelden van een voorbeeld sectie. (E) Samengevoegd beeld van een ander voorbeeld sectie. (FI) Vergelijking van de distale tubulus genexpressie patronen door enkele (FH '") en dubbele (I) WISH. De (FH) Single WISH voor de vermelde genen (elk in paarse vlekken). (F, F ') Het expressiepatroon van clcnk, een pan-distale (DE-DL) marker, werd ontdekt in dunne buisjes die tak punten bevatte (zwarte pijl). (G, G ') Ter vergelijking, WISH voor slc12a1 markeert de DE zonder tak punten gedetecteerd, en (HH' ") slc12a3 markeert de DL, een segment wordt gekenmerkt door tal van tak punten in de nier orgel (zwarte pijlpunten). (I) Dubbele WISH voor de PCT marker slc20a1a (rood) en de pan-distale clcnk (paars). De segmenten gelabeld door deze markers niet overlappen, en in plaats van hun expressie domeinen bezetten niet-aansluitende posities, zodat individuele PCT coils (rechtsonder) niet aanliggen distale tubuli en de laatste te bezetten discrete locaties en bezitten keurmerk tak punten (zwarte pijlpunt ). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

Hier hebben wij werkwijzen beschreven die de visualisatie van nefron segment componenten in de volwassen zebravissen inschakelen. De injectie van fluorescerende dextran conjugaten maakt preferentiële PCT etikettering vanwege de endocytisch eigenschappen van deze proximale tubulus cellen ^30,38. Deze werkwijze kan worden uitgevoerd met een grote flexibiliteit door de aanwezigheid van dextranen die kan worden verkregen met een heel scala aan verschillende fluorescente conjugaten. Bovendien, het gebruik van lysine-fixeerbaar dextranen is een bijzonder gemakkelijke manier om PCT segmenten labelen secundaire labeling procedures niet vereist. Dit is een relatief eenvoudige signaaldetectie en is geschikt voor vele andere fluorescente labels, immunokleuring en het gebruik van transgene reporter lijnen. Alkalische fosfatase etikettering markeert ook de proximale tubulus, met sterke reactiviteit in de PCT en iets zwakkere reactiviteit in de PST. Ten slotte DBA kleuring maakt labeling distale tubulus segmenten die een ch weergevenaracteristic vertakte morfologie. Verschillende lectine moleculen, die suiker bindende eiwitten van immune oorsprong, zijn uitgebreid gebruikt voor zoogdiercellen nefron segmenten ⁴⁷ onderscheiden. Het is interessant dat DBA in de zebravis correleert met distale tubulus segmenten, zoals het wordt gebruikt om verzamelbuizen markeren zoogdieren nieren ^47.

Tezamen kunnen deze werkwijzen worden gebruikt in verschillende combinaties renale samenstelling en functie documenteren. Omdat al deze methoden kunnen worden gebruikt geheel nier preparaten, zij instrumenten te nefron structuur en functie gehele orgaan te evalueren zonder geheel te vertrouwen op het gebruik van tijdrovend, vervelend werkwijzen, bijvoorbeeld cryosectie werk en immunokleuring. Echter, de in dit artikel beschreven methoden vlekken levensvatbaar zijn in cryosectie. Cryosectie analyse genereert monsters (in vergelijking met hele mount), dat beter geschikt is voor immunohistochemie specifieke pepti detecteren zijndes, hoewel natuurlijk dit type analyse vereist de beschikbaarheid van passende primaire antilichamen. Er is nog een belangrijke beperking in samenwerking met de zebravis diermodel blijft de slechte beschikbaarheid van antilichamen. Zo WISH blijft de meest gebruikte, dat wil zeggen, 'go-to' procedure voor de analyse van genexpressie. WISH met BCIP, NBT, en / of INT substraat reacties op paars of rood neerslag te produceren is niet compatibel met fluorescerende vlekken op vriescoupes. Een mogelijkheid is het gebruik van fluorescente detectie WISH, een procedure die is geoptimaliseerd voor zebravis embryo monsters en kunnen worden aangepast voor gebruik bij een volwassen nier roepen. De beschrijving van de methoden die in deze video artikel moet het mogelijk maken voor verdere experimenten met technieken zoals fluorescerende WISH in combinatie met transgene zebravis lijnen waarin afzonderlijke segmenten zijn voorzien van een verslaggever, zoals eGFP of mCherry. Als alternatief, de methoden hier beschreven Could getest in combinatie met andere vitale kleurstoffen, bijvoorbeeld andere lectinen. Zo kon verdere aanpassing en uitbreiding van de hier beschreven methoden worden ingeroepen om de behoeften van de onderzoeker voor de ganse berg nier voorbereidingen en analyse aan te passen.

Als zodanig zijn deze werkwijzen hebben brede mogelijkheden voor de uitvoering van de zebravis model voor continue regeneratie studies en ook genetische ziektemodel. Er is dringend behoefte aan innovatief onderzoek en behandelingen voor nier aandoeningen. Miljoenen mensen lijden aan een vorm van nierziekte elk jaar als gevolg van congenitale, acute en / of chronische oorzaken. Verder is de prevalentie van nierziekte blijft wereldwijd toenemen, waardoor deze ziekten wereldwijd gezondheidsprobleem ^14,15. Bewerkingen zoals hemodialyse beschikbaar waarbij een extern dialysemachine dient bloed van metabole afvalstoffen van een patiënt af als hun nieren niet in staat om deze taak. Helaas, Deze ingreep heeft beperkingen, zoals lopende behandeling nodig is om te overleven. Bovendien zullen patiënten uiteindelijk vereisen een niertransplantatie, die jaren kan duren om te ontvangen zodra een patiënt op een wachtlijst wordt geplaatst. Zelfs na het verkrijgen van een niertransplantatie, vele patiënten lijden aantasting als gevolg van de behandeling en moeten deze effecten voor de rest van hun leven vechten. Deze problemen tonen de dringende behoefte aan de ontwikkeling van nieuwe behandelingen ofwel voorkomen nierziekte of misschien vergroten weefselregeneratie ^8,16,52,53. Gezien de duidelijke ethische beperkingen van het gebruik van menselijke proefpersonen in biomedische laboratoria diermodellen essentieel voor de studie van humane pathogenese en het testen van nieuwe behandelingen. Door de anatomische gelijkenis en evolutionaire nabijheid, is de muis de meest algemeen gebruikt model voor humane ziekten ^45. Er zijn echter bepaalde beperkingen met dit dier, including onvermogen om orgel ontwikkeling in vivo en de uitvoerbaarheid van de voltooiing van grootschalige genetische screens visualiseren. Zebravis zijn relevant en nuttig modelorganisme voor de studie van orgaanontwikkeling en modellering van menselijke ziekten ^45,46. Met betrekking tot ziekten bij de mens, functionele homologen in zebravis bestaan ​​voor bijna 70% van alle menselijke genen ^54,55.

Recent werk heeft gewezen op het nut van de zebravis voor veel gebieden van onderzoek nier ^31,37,56. Studies van regeneratie en reparatie in zebravis na AKI suggereren dat tubulus epitheel regeneratie en neonephrogenesis zijn twee processen die zich voordoen en overlap de hele regeneratie tijdsverloop ^30,37. Het gebruik van een aminoglycoside antibioticum gentamicine is gebruikt als een blessure paradigma, waardoor de uitkomsten van AKI studeren in volwassen zebravissen ^29,30,37. Meer dan een ongeveer twee weken tijd na letsel door gentamicine, de proximale Tubules regenereren, en ondertussen nieuwe nefronen vormen het hele orgel ^29,30,37. In het algemeen zijn de mechanismen die de epitheliale regeneratie reguleren blijven zeer controversieel. In een voorgestelde mechanisme van het herstelproces is er de initiële acute schade event gevolgd door afwerpen van dode cellen in het lumen. Vervolgens is er een aantal de-differentiatie, proliferatie en migratie gebeurtenissen, waarna nieuwe cellen differentiëren herbevolken gewonden basaalmembraan en functieherstel de verwonde plaats. Als alternatief hebben andere studies gesuggereerd dat vervangende cellen ontstaan ​​uit stam / voorlopercellen die binnen nefron buisjes wonen. Met betrekking tot het proces van neonephrogenesis in de zebravis, hebben cellulaire aggregaten waargenomen volgende AKI door gentamicine injectie ^29,30. Deze aggregaten later rijpen in nieuwe nefronen die regelrecht in reeds bestaande tubuli ^29,30. De rode draad die nefron epitheliale regeneratie en neonephr verenigtogenesis is hun pure mysterie factor: op dit moment zijn er exponentieel meer vragen over hoe deze regeneratieve staaltjes optreden dan er beschikbaar zijn inzichten.

Tot op heden, echter, een aantal spannende lijnen van bewijs ondersteunen het idee dat de nieren regeneratie onderzoek met behulp van zebravis inderdaad kan bieden relevante vergelijkende inzichten in de menselijke AKI dat ook kan hebben directe translationeel potentieel ^56-58. Chemical screening kleine moleculen die de proliferatie van renale progenitorcellen in de zebravis embryo recent geleid tot de identificatie van de histone deacetylase inhibitor methyl-4-(fenylthio) -butanoate (m4PTB) ^56,57 verhogen identificeren. Toediening van deze verbinding bij de zebravis larven met gentamicine geïnduceerde AKI bleek dat larvale overleving stijgt en dat de renale tubulaire proliferatie werd versterkt ^56,58. Bij muizen met matige ischemie geïnduceerde AKI werden behandeld met m4PTB, werd hun herstel versneld association met een reductie van zowel tubulaire atrofie en celcyclus van prolifererende renale tubulaire cellen ^58. Deze bevindingen suggereren dat de routes die verantwoordelijk zijn voor de normale zebravis nier ontwikkeling en / of de regeneratieve respons op AKI worden geconserveerd met zoogdieren ^56.

Dus, terwijl verdere studies nodig zijn om te plagen elkaar de mechanismen van regeneratie-namelijk de signaalwegen die betrokken zijn te identificeren en begrijpen van hun interacties-de zebravis biedt een veelbelovende weg om deze belangrijke doelstelling op het gebied nefrologie streven. Instrumenten zoals het nefron cel labels in dit protocol beschreven vertegenwoordigen een groep assays die kunnen worden gebruikt om renale samenstelling en functionaliteit evalueren AKI modellen. Verder, kunnen ze worden toegepast om transgene modellen van nierziekte karakteriseren en kunnen manieren om chemische therapieën kunnen bevorderen herstel van nefron structuur na renale dam te identificerenleeftijd.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X PBS			Made by diluting 10 X PBS in distilled water.
1X PBST			0.1% Tween-20 detergent in 1 X PBS.
1X PBS with 0.05 % Tween			0.05% Tween-20 detergent in 1 X PBS.
Tween 20	American Bioanalytical	AB02038
4% PFA/1X PBS			Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20°C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.
Fine Forceps	Roboz	RS-1050	Dumont Tweezers Pattern #55
Glass slide	Thermo-Fisher	4445	White Frost
Glass coverslip	Thermo-Fisher	12-540A	18 x 18 mm
Modeling clay	Hasbro	Playdoh	Other modeling clays can be substituted and work similarly
Slide holder	Thermo-Fisher	12-587	Optional: cardboard tray to store slides flat
Bleaching solution			Bleach mix formula (for a 20 ml solution): 1.6 ml of 10% Potassium hydroxide solution 0.6 ml of 30% Hydrogen peroxide solution 100 μl of 20% Tween Fill to 20 ml with distilled water
Potassium hydroxide	Sigma	221473
Hydrogen peroxide	Sigma	H1009
Blocking solution			Blocking Solution (for a 10 ml solution): 8 ml of 1X PBS with 0.05% Tween 2 ml of fetal calf serum 150 μl of DMSO
Alkaline phosphatase activity detection	Invitrogen	E6601	We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.  To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer's instructions.
Alkaline phosphatase wash solution			Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 ml solution): 5 ml of 0.5 M EDTA 120 mg of Levamisole 95 ml of 1X PBS
Dextran, fluorescein, 40,000 MW	Invitrogen	D1844	Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, cascade blue, 10,000 MW	Invitrogen	D1976	Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW	Invitrogen	D1825	Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW	Invitrogen	D1817	Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C.
Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine	Vector laboratories	RL-10-32	DBA Staining Solution (for a 100 μl solution): 1 μl of DBA 99 μl of 1X PBS
Propidium iodide	Invitrogen	E6601
DAPI	Invitrogen	P1304MP
Vectashield hard set mounting medium	Vector laboratories	H-1400
Micro cover glass	VWR	48393081
Dimethyl sulfoxide, DMSO	American Bioanalytical	67-68-5
Sucrose	Sigma	S0289
EDTA, 0.5 M solution, pH 8.0	American Bioanalytical	AB00502
Levamisole	Sigma	L-9756
Tissue freezing medium	Triangle Biomedical Sciences, Inc.	TFM-C
Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10 x 10x 5 mm	Sakura Finetek	4565
TruBond 380 adhesive microscope slides	Tru Scientific	0380W
Liquid blocker – super PAP pen	Electron Microscopy Sciences	71312
Immuno stain moisture chamber	Evergreen Scientific	240-9020-Z10
Cryostat	Therm	Microm™ HM 525 Cryostat
Stereomicroscope	Nikon	SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC	Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.
Compound microscope	Nikon	96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red	Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.