Methodenartikel

Een nieuwe Verduidelijking methode om Visualiseer Biliary Degeneratie Tijdens Lever Metamorfose in Sea Lamprey ( Petromyzon marinus)

DOI:

10.3791/51648

⸱

6 juni 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Fisheries & Wildlife, Michigan State University, 2Hammond Bay Biological Station, Great Lakes Science Center, U.S. Geological Survey

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zeeprik verliest de galblaas en galwegen tijdens metamorfose, een proces vergelijkbaar met de menselijke galgangatresie. Een nieuwe bevestiging en verduidelijking methode (duidelijkheid) werd gewijzigd om de gehele galwegen met behulp van laser scanning confocale microscopie visualiseren. Deze methode biedt een krachtig hulpmiddel om de gal degeneratie studeren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Galgangatresie is een zeldzame ziekte van de kindertijd, met een geschatte 1 in 15.000 frequentie in het zuidoosten Verenigde Staten, maar vaker in Oost-Aziatische landen, met een gerapporteerde frequentie van 1 in 5000 in Taiwan. Hoewel veel bekend is over het beheer van galgangatresie, de pathogenese is nog steeds ongrijpbaar. De zeeprik (Petromyzon marinus) biedt een unieke gelegenheid om het mechanisme en de progressie van de galwegen degeneratie te onderzoeken. Zeeprik ontwikkelen door middel van drie verschillende levensfasen: larvale, parasitaire, en volwassen. Tijdens de overgang van larven tot parasitaire jeugdcriminaliteit, zeeprik ondergaan metamorfose met dramatische reorganisatie en verbouwing van de externe morfologie en interne organen. In de lever wordt het gehele galwegen verloren, zoals de galblaas en galwegen. Een nieuw ontwikkelde methode genaamd "duidelijkheid" is gewijzigd om de hele lever en de kruising met de darm in metamorfe Zeeprik verduidelijken. Deproces van gal degeneratie werd gevisualiseerd en onderscheiden tijdens zeeprik metamorfose met behulp van laser scanning confocale microscopie. Deze methode biedt een krachtig hulpmiddel om galgangatresie studeren in een uniek diermodel.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zeeprik ontwikkelen door middel van drie verschillende levensstadia 1,2. Larvale zeeprik (L) brengen de meeste tijd in holen als benthische filter feeders. Na het doorlopen zeven metamorfe stadia dramatische veranderingen in de externe morfologie en reorganisatie in inwendige organen 3, de resulterende jongeren (JV) Voer een parasitaire fase waarin zij zich voeden met bloed en weefsel vloeistoffen uit gastheervis en maakt de lichaamsmassa meer dan 100 keer . Na 1,0 tot 1,5 jaar voeden met de gastheer vis in de oceaan of de grote meren, volwassenen ophouden borstvoeding tijdens het vroege voorjaar en migreren in rivieren om te paaien en dan sterven 1,2.

Tijdens de metamorfose, de zeeprik lever verliest de galblaas en de hele galwegen, een evolutionaire mutante fenotype dat de menselijke zuigeling ziekte galgangatresie nabootst. Zuigeling galgangatresie is een zeldzame pediatrische leverziekte met ernstige medische complicaties 4,5,6,7, 8,9,10, maar de pathogenese en etiologie van galgangatresie zijn grotendeels onbekend 4. Patiënten met galgangatresie sterven binnen twee jaar na de geboorte, tenzij chirurgische ingreep (Kasai procedure) wordt uitgevoerd 5. Vervolgens deze patiënten vereisen uitgebreide klinische behandeling en vaak levertransplantatie 6. Veel theorieën van biliaire atresie etiopathogenese voorgesteld, zoals virale infecties, aangeboren afwijking, auto-immuunziekten en toxische insult. Echter, de bijdrage van elk tot de ontwikkeling van galgangatresie blijft onduidelijk 7,8,9,10.

In tegenstelling tot de zuigelingen die pathologische galgangatresie lijden, ondergaan zeeprik ontwikkelingsgebied geprogrammeerd galgangatresie zonder uitgebreide necroinflammation, fibrose of cirrose 10. De dieren kunnen voorbijgaande cholestase lijden tijdens dit proces 10, maar aan te passen aan deze ontwikkelingsstoornis aandoeningvia de synthese en uitscheiding van galzouten in de darm na ontwikkeling biliaire atresie, naast de bekende mechanismen zoals een vermindering van galzout synthese in lever 11. Dit ontwikkelingsproces in Zeeprik biedt de enige bekende mogelijkheid om de progressie van biliaire atresie onderzoeken.

Een nieuw ontwikkelde methode genaamd "duidelijkheid" maakt hoge-resolutie beeldvorming in complexe zoogdieren zenuwstelsel door het transformeren intact weefsel in een optisch transparant nanoporeus hydrogel 12. Met behulp van de zeeprik lever en een gemodificeerd DUIDELIJKHEID protocol, kan intact weefsel beeldvorming van de galwegen degeneratie worden gedocumenteerd in de lever metamorfose.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Oplossing Voorbereiding

  1. Voeg 1 L 10x 0,1 M fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS, pH 7,4): Weeg 26,2 g natriumfosfaat (monobasisch), 115 g natriumfosfaat (dibasisch) en 87,66 g NaCl. Los op in ongeveer 800 ml gedestilleerd H 2 O, aan te passen pH, en breng het volume tot 1 L met gedestilleerd H 2 O.
    1. Maak 1 L 0,1 M fosfaatbuffer zoutoplossing (pH 7,4): Neem 100 ml 10x PBS en voeg 900 ml gedestilleerd H 2 O.
    2. Maak 1 L 0,1 M fosfaatbuffer zoutoplossing (pH 7,4) met 0,1% Triton X-100: Neem 100 ml 10x PBS, voeg 1 ml Triton X-100, en breng het volume tot 1 L met gedestilleerd H 2 O.
  2. Voeg 1 L 10x 0,1 M fosfaatbuffer (PB, pH 7,4): Weeg 26,2 g natriumfosfaat (monobasisch) en 115 g natriumfosfaat (dibasisch). Los op in ongeveer 800 ml gedestilleerd H 2 O, aan te passen pH, en breng het volume tot 1 L met gedestilleerd H 2 O.
    1. Maak 1 L 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4): Neem 100 ml 10x PB,en voeg 900 ml gedestilleerd H2O
    2. Maak 1 L 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4) met 0,1% Triton X-100: Neem 100 ml 10x PB, voeg 1 ml Triton X-100, en breng het volume tot 1 L met gedestilleerd H 2 O.
  3. Voeg 400 ml hydrogel monomeeroplossing (4% acrylamide, 0,25% bis-acrylamide, 4% paraformaldehyde, 0,0075% ammoniumpersulfaat, 0,0005% saponine in 0,1 M PBS): Weeg 0,3 g ammoniumpersulfaat en 0,2 g saponine. Voeg 210 ml gedestilleerd H2O, 40 ml 40% acrylamide, 10 ml 2% bis-acrylamide, 40 ml 10x PBS (pH 7,4), 100 ml 16% paraformaldehyde en meng.
  4. Maak 4 L clearing-oplossing (4% SDS in 0,2 M boorzuur): Weeg 49,464 g boorzuur en 160 g SDS. Los op in ongeveer 3,5 L gedestilleerd H2O, pH op 8,5 met NaOH en breng het volume tot 4 L.
  5. Maak 1 L 80% glycerol oplossing: Meet 800 ml glycerol, voeg 200 ml gedestilleerd H 2 O, en meng goed.

2. Tissue Voorbereiding

  1. Bereid hydrogel monomeeroplossing en hoeveelheid 10 ml elk 15 ml centrifugebuis.
  2. Ontleden het gehele weefsel en fixeer het hydrogel gedurende 2 dagen bij 4 ° C. Controleer of de hydrogel oplossing tenminste 10x het volume van het weefsel.
  3. Breng de hydrogel vaste weefsel (in de 15 ml centrifugebuis) een zuurkast.
  4. Polymeriseren de hydrogel vaste weefsel door toevoeging van 5 pl TEMED, meng goed en laat zitten in de zuurkast bij kamertemperatuur gedurende 2-3 uur.
  5. Verwijder de overtollige gel grondig. Let op: Extra gel zal het clearing proces en het antilichaam penetratie tijdens kleuring belemmeren.
  6. Incubeer de vaste weefsel in 10 ml clearing oplossing in een incubator schudder ingesteld op 70 tpm en 50 ° C gedurende enkele dagen tot het weefsel doorzichtig. Wijzig clearing oplossing ten minste eenmaal per dag en verwijder de overtollige gel uit het weefsel bij het veranderen van de clearing oplossing.
  7. Spoel het weefsel in 10 ml 0,1 M PB met 0,1% Triton X-100 bij 70 ruur en 37 ° C gedurende de nacht. Herhaal deze stap 3 keer en verwijder de overtollige gel uit het weefsel bij het wijzigen van de bufferoplossing.
  8. Incubeer de geklaarde weefsel in het primaire antilichaam oplossing PB met 0,1% Triton X-100 bij 70 tpm en 37 ° C gedurende 2 dagen. Opmerking: Maak genoeg primaire antilichaam oplossing voor het hele weefsel onderdompelen.
  9. Spoel het weefsel in 10 ml PB met 0,1% Triton X-100 bij 70 tpm en 37 ° C gedurende de nacht. Herhaal deze stap 3 keer en verwijder de overtollige gel uit het weefsel bij het wijzigen van de bufferoplossing.
  10. Voer de volgende stappen in een donkere kamer of bij weinig licht. Bedek de monsters met folie van de foto's bleken te voorkomen.
  11. Incubeer de geklaarde weefsel met de fluorescerende secundaire antilichaam oplossing PB met 0,1% Triton X-100 en de blokkering serum bij 70 tpm en 37 ° C gedurende 1 dag.
  12. Spoel het weefsel in 10 ml PB met 0,1% Triton X-100 bij 70 tpm en 37 ° C gedurende de nacht. Herhaal deze stap 3 keer en verwijder de overtollige gel from het weefsel wanneer u de bufferoplossing.
  13. Spoel het weefsel in 10 ml PBS bij 70 tpm en 37 ° C gedurende de nacht. Herhaal deze stap 3 keer en verwijder de overtollige gel uit het weefsel bij het wijzigen van de bufferoplossing.
  14. Incubeer de geklaarde weefsel in 80% glycerol bij 70 rpm en 37 ° C gedurende de nacht.
  15. Bewaar de tl-lood weefsel bij 4 ° C voorafgaand aan confocale microscopie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enkele belangrijke ontwikkelingsstoornissen gebeurtenissen in het Lever-/galstelsel tijdens Zeeprik metamorfose. De galwegen en de galblaas ondergaan apoptose en gedegenereerde (figuur 1). Het combineren van de gemodificeerde verduidelijking werkwijze en kleuring met levercellen cytokeratine 19 (CK19, aanwezig in zowel cholangiocyten en hepatocyten voor en na metamorfose 13) en anti-apoptotische marker Bcl2 via confocale microscopie werd de volledige galwegen gevangen langs de Z-as ( ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol is een modificatie van een nieuwe methode genaamd "duidelijkheid" 12, die intact weefsel verknoopt polyacrylamide met een nanoporeuze hydrogel, en ontdoet het plasmamembraan van het weefsel optische transparantie en macromoleculaire permeabiliteit bereiken. "Duidelijkheid" kunt intact weefsel beeldvorming van lange afstand projectie en lokale bedrading in het zenuwstelsel. Deze nieuwe methode kan worden gebruikt om de gehele galwegen visualiseren Zeeprik lever tijdens metamorf...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs erkennen de bijdrage van Hammond Bay Biologisch Station, Great Lakes Science Center, US Geological Survey. We danken ook Dr Melinda Frame bij het Center for Advanced Microscopy aan de Michigan State University voor haar technische ondersteuning bij confocale laser scanning microscopie. Dit onderzoek wordt ondersteund door subsidies van de Grote Meren Visserijcommissie om YWCD en WML.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
40% acrylamide Bio-Rad161-0140
2% bis-acrylamide Bio-Rad161-0142
TEMEDBio-Rad161-0800
ammonium persulfate SigmaA3678-25G
boorzuurSigmaB7901-1KG
saponine Sigma47036
natriumdodecylsulfaat SigmaL337-500G
natriumfosfaat (monobasisch)Sigma04269-1KG
natriumfosfaat (dibasisch)SigmaS5136-1KG
Triton X-100SigmaX100-500ML
glycerol SigmaG9012-500ML
16% paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences15710-S
NaOH-pellets EMDSX0590-3
15 ml centrifugebuizenElk merk
dissectie-instrumenten Elk merk

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Applegate, V. C. Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan. US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).
  2. Hardisty, M. W., Potter, I. C. The general biology of adult lampreys. The biology of lampreys. Hardisty, M. W., Potter, I. C. 1, New York Academic Press. 127-206 (1971).
  3. Youson, J. H., Potter, I. C. A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L. Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).
  4. Boomer, L. A., et al. Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L. J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).
  5. Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. Technique and results of operative management of biliary atresia. World J. Surg. 2, 571-580 (1978).
  6. Suzuki, T., Hashimoto, T., Kondo, S., Sato, Y., Hussein, M. H. Evaluating patients’ outcome post-Kasai operation: a 19-year experience with modification of the hepatic portoenterostomy and applying a novel steroid therapy regimen. Pediatr. Surg. Int. 26, 825-830 (2010).
  7. Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. Biliary atresia. Lancet. 374, 1704-1713 (2009).
  8. Morecki, R., Glaser, J. H., Cho, S., Balistreri, W. F., Horwitz, M. S. Biliary atresia and reovirus type 3 infection. New Engl. J. Med. 307, 481-484 (1982).
  9. Shimadera, S., Iwai, N., Deguchi, E., Kimura, O., Fumino, S., Yokoyama, T. The inv mouse as an experimental model of biliary atresia. J. Pediatr. Surg. 42, 1555-1560 (2007).
  10. Sidon, E. W., Youson, J. H. Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts. J. Morphol. 177, 109-124 (1983).
  11. Yeh, C. -Y., Chung-Davidson, Y. -W., Wang, H., Li, K., Li, W. Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).
  12. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  13. Alarcón, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis. Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).
  14. Youson, J. H., Ogilvie, D. R. Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia. Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).
  15. Morii, M., et al. Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri. Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CLARITY MethodLaser Scanning Confocal MicroscopyImmunofluorescent StainingTissue ClearingHydrogel PolymerizationCytokeratin 19BCL TwoMetamorphic Stages

Gerelateerde artikelen