Identificatie van eiwit interacties Partners in zoogdiercellen behulp SILAC-immunoprecipitaties Kwantitatieve Proteomics

Samenvatting

SILAC immunoprecipitatie experimenten vormen een krachtig middel voor het ontdekken van nieuwe eiwit: eiwit interacties. Doordat de nauwkeurige relatieve kwantificering van eiwitgehalte in zowel controle monsters, waar interacties gemakkelijk kan worden onderscheiden van experimenteel verontreinigingen en lage affiniteit interacties bewaard door het gebruik van minder stringente buffer omstandigheden.

Samenvatting

Kwantitatieve proteomics gecombineerd met immuno-affiniteitszuivering, SILAC immunoprecipitatie, vormen een krachtig middel voor de ontdekking van nieuwe eiwit: eiwit interacties. Doordat de nauwkeurige relatieve kwantificering van eiwitgehalte in zowel controle monsters, kan waar interacties gemakkelijk worden onderscheiden van experimenteel verontreinigingen. Lage affiniteit interacties kunnen worden bewaard door het gebruik van minder stringente bufferomstandigheden en gemakkelijk herkenbaar blijven. Dit protocol beschrijft de kenmerken van weefselkweek cellen met stabiele isotoop gemerkte aminozuren, transfectie en immunoprecipitatie van een affiniteit gelabeld eiwit van belang, gevolgd door de voorbereiding van opname in een massaspectrometrie faciliteit. Dit protocol bespreekt vervolgens hoe u het terug van de massaspectrometer om cellulaire partners interactie met een eiwit van belang vast te stellen gegevens te analyseren en te interpreteren. Als voorbeeld van deze techniek wordt toegepast identiteitTify eiwitten binden aan de eukaryote translatie initiatie factoren: eIF4AI en eIF4AII.

Inleiding

Een essentiële stap in het begrip eiwitfunctie is identificatie van relevante interagerende eiwitten. Wanneer dergelijke eiwitten onbekend zijn er een aantal technieken, elk met hun eigen voor-en nadelen. Deze omvatten de gist twee-hybride systeem, pulldown analyses toepassing van recombinant eiwit en tandem affiniteitszuivering of TAP-tagging ^{1, 2.}

Een recentere Naast deze technieken is de combinatie van affiniteit zuivering van een eiwit van interesse van een relevante zoogdiercellijn, gevolgd door kwantitatieve massaspectrometrie met stabiele isotopen van aminozuren in celcultuur (SILAC) ^3. Dit heeft voordelen boven de gist twee-hybride benadering in die cel lokalisatie en post-translationele modificaties zijn niet verstoord, alsmede voordelen boven traditionele TAP tagging doordat het kwantitatieve dan kwalitatieve benadering waardoor de gebruiker reaDily onderscheiden niet-specifiek interagerende eiwitten en verontreinigingen vanuit gastheer factoren die specifiek binden. Verder werd als monster typisch geanalyseerd geheel en niet als afzonderlijke eiwitbanden, eiwitten van belang zijn niet gemaskeerd door soortgelijke migreren eiwitten op een gel, en dat hoeft typisch aanwezig zijn in voldoende hoge niveaus zichtbaar na kleuring, waardoor verhoogde aantallen vol geïdentificeerde eiwitten ^4.

Om deze techniek te demonstreren, GFP fusies van de nauw verwante eukaryotische translatie-initiatie factor eIF4AI en eIF4AII dat aandeel meer dan 90% aminozuuridentiteit werden onderzocht door SILAC-immunoprecipitaties kwantitatieve proteomics. Menselijke eIF4AI en II werden gekloneerd in pEGFP-C1 een fusieproteïne waarin GFP gefuseerd aan de N-terminus van eIF4A vormen. Om te voorkomen dat de noodzaak voor het genereren van stabiele cellijnen transiënte transfectie werd gebruikt om deze constructen te leveren aan stabiele isotoop gemerkte 293T cellen.

Cellen werden eerst gelabeld voor twee weken SILAC celkweekmedium, gevolgd door transfectie van plasmide DNA dat codeert voor een eiwit van interesse. Cellen werden vervolgens gelyseerd, de eiwitconcentratie genormaliseerd en gelijke hoeveelheden lysaat affiniteit gezuiverd anti-GFP agarose. Gelijke hoeveelheden eluaat werden vervolgens gecombineerd en LC-MS/MS analyse worden aangeboden. De resultaten van deze analyse worden vervolgens naar hoog vertrouwen eiwitten te identificeren: eiwit interacties (figuur 1).

SILAC immunoprecipitatie maakt de identificatie van niet alleen rechtstreekse interacties maar ook lage affiniteit of indirecte interacties met eiwitcomplexen ^4. Met dit systeem eIF4AI en II immunoprecipitaties toegestaan ​​reproduceerbare en zekere identificatie van de primaire bindingspartner eIF4G (isovormen I / II en III) ^5, alsook indirecte interacties met eIF4E en talrijke onderdelen van de eIF3 complex.

Protocol

1. Generatie en Passage van SILAC gemerkte cellijnen

Let op: het gebruik van trypsine-EDTA moet worden vermeden in alle stadia van passage en voorbereiding van experimentele monsters voor analyse als de trypsine ongelabelde aminozuren, die zou leiden tot onvolledige etikettering van de monsters kunnen bevatten.

1. Een fles SILAC media bereiden voeg 0,5 ml van een geschikt SILAC gemerkt arginine (84 mg / ml in PBS) en lysine (146 mg / ml in PBS) om een ​​fles van 500 ml van Arg / Lys DMEM (met L-glutamine).
2. Voeg daarna 50 ml gedialyseerd FBS en 5 ml penicilline / streptomycine om de fles van 500 ml.
   Opmerking: HEK 293T-cellen (ATCC) moet worden gehandhaafd in DMEM media ontbreekt arginine en lysine en aangevuld met licht (R0K0), medium (R6K4) of zware (R10K8) aminozuren, gedialyseerd foetaal bovine serum (10 kDa) en penicilline / streptomycine. Cellen moeten media worden gedurende minstens 5 celdelingen te zorgen voor volledigelabeling. Meestal cellen worden gemakkelijk gelabeld ≥ 2 weken.
3. Om cellen voor passage gesplitst moeten de cellen worden losgemaakt uit de monolaag door het raken van de kolf. Alternatieven omvatten het gebruik van mobiele schrapers of met enzymvrij, PBS-gebaseerde cel-dissociatie-buffer.
   Opmerking: Om de media te behouden, moeten de cellen worden gepasseerd in T25 flessen en grotere aantallen cellen gegenereerd alleen onmiddellijk voorafgaand aan een experiment.
4. 24 uur voorafgaand aan transfectie van cellen zaad 3,5 x 10 ^6-SILAC gelabelde cellen in een 10 ^cm2 schaal voor elke experimentele conditie onderzocht.

2. Transfectie van gelabelde cellen met pEGFP-fusieconstructen

1. Verwijder het papier uit de cellen en het vervangen met 9 ml-antibiotica vrij SILAC DMEM (Light, Medium of Zwaar) media.
   Opmerking: Antibiotica mag niet worden toegevoegd aan het medium omdat hierdoor interferentie met de efficiency van liposoom gebaseerde transfectie reagentia.
2. Prepaopnieuw een mix van 10 ug van het juiste plasmide (epEGFP-C1, pEGFP-eIF4A-I, pEGFP-eIF4A-II) in 500 pi van antibiotica-vrij SILAC DMEM en meng het met 500 ul van antibiotica-vrij SILAC DMEM met 10 ui transfectie reagens (bijvoorbeeld Lipofectamine 2000). Meng de reactie goed door pipetteren op en neer meerdere malen.
3. Incubeer het reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten en voeg druppelsgewijs aan de cel monolaag. Rock de plaat zachtjes van links naar rechts.
4. Incubeer de getransfecteerde cellen bij 37 ° C en 10% _CO2 gedurende 24 uur.
   Opmerking: Als de expressie van een eiwit van interesse resulteert in enige duidelijke toxiciteit, dan kan het noodzakelijk zijn de hoeveelheid plasmide getransfecteerd en / of de duur van de daaropvolgende expressie verkorten.

3. Oogsten cellysaten

1. Oogst cellen van de schotel in ijskoude PBS met behulp van een cel schraper. Verzamel cellen door centrifugatie bij 220 xg, 476, C gedurende 5 minuten. Was de cellen nog eens 3x in 10 ml ijskoude PBS.
2. Resuspendeer de celpellet in 200 ui lysis buffer (10 mM Tris-Cl / pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5% NP40) met vers toegevoegde proteaseremmer cocktail III 1x de concentratie en RNase cocktail (optioneel) en 5 gl per ml.
   Opmerking: voor eiwitten met bekende nucleïnezuur bindingsactiviteit, kan het nodig zijn om nucleasen toevoegen lysaat voorafgaand aan precipitatie. Wanneer nuclease toegevoegd, moeten de monsters worden geïncubeerd op ijs gedurende 30 minuten op ijs, met pipetteren elke 10 minuten. Extraheren totaal nucleïnezuur uit een fractie van het monster en analyse met agarosegelelektroforese kan de effectiviteit van de nuclease testen.
3. Centrifugeer de monsters bij 13.000 x g, 4 ° C gedurende 10 min handhaven van de supernatant als oplosbare cellysaat.
4. De concentratie van het cellysaat worden beoordeeld door BCA bepaling volgens de instructies van de fabrikant.
5. Gebruik lysisbuffer die proteaseremmer cocktail III eiwitconcentratie normaliseren in een eindvolume van 500 pi.
6. Stel het volume met de toevoeging van 500 pl verdunningsbuffer (10 mM Tris-Cl / pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA) met proteaseremmer cocktail III bij uiteindelijke concentratie van 1 x 1 ml. Een 50 pi aliquot van het monster te handhaven zoals het in-en het lysaat op ijs gehouden tijdens het bereiden van anti-GFP kralen (bijv. GFP-val).
   Opmerking: Typisch rendementen variëren tussen 1-3,5 mg eiwit in de finale 1 ml monster. Terwijl de bovenstaande buffers zijn geschikt voor vele eiwitten van belang voor derden noodzakelijk kan zijn om buffercomponenten wijzigen om te waarborgen het aas eiwit oplosbaar en eiwit-eiwit interacties handhaven. Mogelijke wijzigingen omvatten de buffer (fosfaat, HEPES), zoutconcentratie (150-500 mM), de keuze van het wasmiddel of andere additieven.

4. Binding aan Anti-GFP Beads

1. Kort geschud kraal slurry om de kralen te resuspenderen. Met een 200 ul pipet tip met het uiteinde afgesneden, overdracht 25 ul van kralen per monster naar een nieuwe buis.
   Opmerking: De gebruiker moet de kralen voor te bereiden op een enkele SILAC experiment als een mastermix om sample-to-sample variatie te minimaliseren.
2. Voor elk 25 pi kraal slurry, voeg 20 volumes (1500 ul per 75 pl suspensie) van verdunning buffer en centrifugeer de kralen aan 2700 xg gedurende 5 minuten. Vervolgens was de korrels nog 2x in 20 volumes verdunningsbuffer.
3. Voeg 100 ul verdunning buffer per 25 pl kraal slurry. Met een 200 ul tip met het uiteinde afgesneden, overdracht 85 ul van deze suspensie geresuspendeerd elk van de SILAC gemerkte monsters van stap 3.6.
4. Incubeer de monsters met kralen op een rotator bij 4 ° C gedurende 2 uur.

5. Wassen, elutie, en voorbereiding van de monsters voor MS Analysis

1. Centrifugeer monsters bij 2700 xg, 46, C gedurende 5 minuten. 50 ul van de supernatant worden gehandhaafd als de ongebonden monster, waarbij de rest van het supernatant weggegooid.
2. 1 ml verdunningsbuffer worden toegevoegd aan elke buis om de kralen te resuspenderen en bij 2700 xg het monster gecentrifugeerd, 4 ° C gedurende 5 minuten. De bovenstaande vloeistof moet worden weggegooid. Dit moet tweemaal worden uitgevoerd.
3. Elueer eiwitten van de bolletjes door de toevoeging van 50 ui 2x SDS-laadbuffer en verwarmen bij 95 ° C gedurende 10 minuten. Pellet de kralen door centrifugering bij 2.700 g gedurende 2 min bij 4 ° C
4. Bewaar het supernatant gesmeerd buizen, waar het dan kan worden opgeslagen bij -80 ° C totdat ze nodig waren. Voor indiening bij een massaspectrometrie faciliteit, meng gelabelde monsters 01:01:01 (bv. 10 pi van elk) en de gemengde monster dienen.
   NB: Op dit punt monsters kan worden getest door western blot, zilver-kleuring of andere middelen te testen voor interactie met bekende / onbekende bindende partners. Een voorbeeld wordt gegeven in Figure 2 toont specifieke binding van een bekende interactie partner - eIF4G door western blot, en de verschijning van zilverkleuring bands aanwezig in pulldown monsters uit een eiwit van belang, maar niet een controle monster.
5. Leg voorbeelden voor LC-MS/MS analyse.
   Let op: zodra zij constateren dat de gelabelde eiwit van belang met succes is bindend interactie partners, gelijke volumes van elk gemerkt monster (lichte, middelzware en zware) worden gecombineerd en voor LC-MS/MS analyse voorgelegd. Het is gebruikelijk om 30 ul totaal een IP monster dienen voor analyse. Dit zou inhouden mengen 10 ul Licht-gemerkte monster met 10 ul medium-gelabelde en 10 ul zwaar-gemarkeerde monsters een 30 pi totaal geven.

6 Data-analyse I:. Inzicht in de resultaten, en verwijdering van de Low-vertrouwen Identifications

Opmerking: Een lijst van de kolomkoppen geretourneerd door de Proteome Discoverer software wordt gegeven in tabel 1 Dif.schillende software (bijv. MSQuant, MaxQuant) worden verschillende posten terugkeren echter slechts een subset van deze zijn voor de analyse en deze zijn gemeenschappelijk voor de verschillende softwarepakketten. Gegevens dient altijd een volgnummer voor elk eiwit geïdentificeerd, verhoudingen vergelijken van elk monster ratio (licht versus medium, licht versus zwaar, medium vs zware etc), het aantal unieke peptiden geïdentificeerd, en een vorm van valse meldingen of indicatie vertrouwen.

1. Alvorens in te gaan door de gegevens, eerst de ruwe data te kopiëren naar een nieuw werkblad. Van deze spreadsheet verwijdert alle kolommen behalve die het geven van de toetreding, aantal unieke peptiden, ratio's vergelijken van monsters, verhouding variabiliteit, en het eiwit beschrijving. Als replica experimenten werden uitgevoerd, moeten deze worden gecombineerd in een enkel Excel-bestand, met elk experiment zijn opgenomen in een apart tabblad.
   Opmerking: Lage vertrouwen data bevat eiwitten die door slechts een enkele unieke peptide, en die whier kwantificering niet mogelijk was.
2. Gebruik functie Blinkt '' soort 'om de gegevens te bestellen door het aantal peptiden en verwijder de tekst voor eiwitten ontbreekt meer dan een peptide. Vervolgens sorteren door ratio en eiwitten die SILAC ratio's (niet gekwantificeerde eiwitten) ontbreekt verwijderen.
3. Converteren SILAC ratio's om een log ₂ waarden met behulp van de formule: '= log (SILAC Ratio, 2)', waarbij 'SILAC Ratio' wordt vervangen door de cel identifier.
   Opmerking: Als SILAC verhouding resulteert in gegevens voor eiwitten die een afname in overvloed wordt beperkt tot waarden tussen 0 en 1, is het gebruikelijk om een SILAC verhouding converteren naar een log ₂ SILAC verhouding, hetgeen impliceert eiwitten zowel verhoogd of verlaagd in een monster worden weergegeven op een log schaal, waar 2 of -2 is een 4-voudige toename of afname in overvloed, en 3 of -3 een 9-voudige toename respectievelijk afname in overvloed. Na deze transformatie, moeten de gegevens passen een GAussian verdeling rond een _log2 SILAC verhouding 0. Een voorbeeld hiervan is gegeven in figuur 3.
4. Maak nieuwe kolommen in de Excel-bestand en bereken log ₂ SILAC verhoudingen voor alle monster / mock kolommen. Voor omzetting van een mock / monster verhouding tot een monster / mock-ratio, gebruik dan de formule: "= 1/ratio"

7 Data-analyse II:. Selectie van hoog vertrouwen Interacties voor verdere studie

1. Open Graphpad Prism, selecteer Nieuw> Gegevens Tabel en grafiek ... Selecteer 'kolom' uit de lijst aan de linkerkant van het venster, en kies de Enter / Gegevens importeren> Voer replica waarden, gestapeld in kolommen opties. Druk op 'Create'.
2. Selecteer en kopieer een bepaald log ₂ Sample / Mock SILAC verhouding kolom van het Excel-werkblad in de nieuwe Prism-bestand.
3. Klik op de dropdown menu 'Invoegen' en selecteer 'Nieuwe analyse'. Onder kolom analyse te selecteren 'Frequentieverdeling '. Het houden van de standaard opties klik op 'OK'.
   Opmerking: Deze stap genereert een histogram illustreert het aantal eiwitten geïdentificeerd in een gegeven verhouding. Dit moet een Gauss-verdeling vormen.
4. In de map 'Resultaten' wordt een nieuwe sectie 'Histogram' zijn gegenereerd. Selecteert u de sectie frequentieverdeling.
5. Klik op de dropdown menu 'Invoegen' en selecteer Nieuwe analyse> XY> Niet-lineaire regressie (curve fit). Klik op 'Gauss-verdeling' en klik op OK.
   Opmerking: Deze stap past een bocht naar frequentieverdeling gegevens gegenereerd in stap 7.3, waarbij waarden die vervolgens kan worden gebruikt om drempels voor significantie berekenen.
6. In de resultaten venster dat verschijnt, het gemiddelde en de standaarddeviatie worden gegeven. Genereer een drempel door toevoeging 1,96 standaardafwijkingen van het gemiddelde.
   Opmerking: Deze waarden geven het gemiddelde en de standaarddeviatie van de Gauss-distribution, niet de totale dataset. 1,96 standaardafwijkingen zou een drempel plaatsen op het 95% betrouwbaarheidsinterval (p ≤ 0,05). 2.58 SD zou geven 99% en 3,3 SD 99,9%. De drempel moet individueel worden bepaald voor elk replica experiment ze kunnen variëren.

8 Data Analysis III:. Samenvoegen Replica Datasets

Opmerking: Als u vertrouwen in het identificeren van interactie partners een typisch SILAC pulldown experiment moet idealiter drie keer worden uitgevoerd, met het medium en zware gelabelde monsters ingeschakeld voor een van de herhalingen te controleren voor elk effect van de media op de resultaten. Een proteïne die verschijnt als onderling in ten minste twee van de drie experimenten met "switched'-mediavoorbeeld ideaal voor een van deze, is een hoge interactie vertrouwen.

1. Terug naar het Excel-bestand, maakt u een nieuw tabblad genaamd "gecombineerde '. Label kolom A 'toetreding' en kopieer alle toetredingscriteria nummers van elkaar of de individuele experimenten in deze kolom.
2. Selecteer het tabblad 'Data', en vervolgens de optie 'Duplicaten verwijderen'.
3. Kolommen voor SILAC verhoudingen en verhouding variabiliteit van elk experiment en voor het eiwit naam / beschrijving kolom.
4. In het tabblad beschrijving, gebruik de VLOOKUP formule om de beschrijving van elke toetreding nummer te verzamelen. Sleep de formule door de kolom in het eiwit beschrijving in te vullen. De VLOOKUP formule is: "= VLOOKUP (AccessionNo, WheretoLook, ColumnsAccross, False)", waarbij: AccessionNo is $ aX met X de rijnummer WheretoLook is het tabblad 'Experiment Naam' $ A $ 2:.! $ Y $ Z waar Y en Z rechtsonder stuk van de gegevens op het werkblad waarnaar wordt verwezen. ColumnsAccross is het aantal kolommen tegenover de toetreding number in kolom A een gewenste waarde ligt.
   Opmerking: Als bijvoorbeeld het toegangsnummer wordt in kolom A, en de gegevens van interesse ligt in kolom E de waarde hier zou 5 zijn (kolom A telt met 1). Als toegangsnummers werden samengevoegd in stap b, is het zeer waarschijnlijk dat VLOOKUP niet alle vereiste namen ve experiment krijgen. Wanneer het terugkeert N / A, wijzigen van de formule om de beschrijving te verkrijgen van elk experiment op zijn beurt tot alle beschrijvingen zijn verworven.
5. Om interagerende eiwitten in de gecombineerde dataset markeren, selecteert u elke verhouding kolom afzonderlijk en klik op het tabblad Start, gevolgd door Voorwaardelijke opmaak> Highlight cellen regels> Meer regels.
6. Selecteer stijl 'Classic'. Formaat alleen cellen die 'Cell waarde' bevatten, 'Groter dan of gelijk aan'. In het vak, typ de 1,96 standaarddeviatie waarde, en klik op 'OK'.
7. Beoordeel de verhouding variabiliteit voor elke positieve interactie. Als aftrekken van de% varANSPRAKELIJKHEID zou dalen een 'hit' onder de drempelwaarde, moet deze met voorzichtigheid worden behandeld.
   Opmerking: Dit is hoe consistent de individuele ratio voor elk peptide die samen SILAC verhouding een eiwitten 'zijn, en wordt gegeven als een percentage. Wanneer de verhouding variabiliteit in aanmerking wordt genomen en dat een eiwit geeft een SILAC verhouding boven de drempel, dit eiwit is een hit. Als de verhouding variabiliteit geeft een bereik dat lager is dan de drempel, de 'hit' kan een verontreiniging vertegenwoordigen.
8. Herhaal deze procedure voor elk van de kolommen en de resultaten te vergelijken over de experimenten. Gemarkeerd eiwitten geïdentificeerd in twee of meer experimenten vormen een interactie groot vertrouwen.
   Opmerking: Afhankelijk van de database die wordt gebruikt om eiwitten toetreding nummers toe te wijzen, in verschillende experimenten een eiwit kan zijn geïdentificeerd onder een andere, of zelfs meerdere toetreding nummers. Het is belangrijk om deze te controleren of eiwitten niet per ongeluk weggelaten.

Resultaten

In een typisch experiment SILAC pulldown, de overgrote meerderheid van de geïdentificeerde eiwitten (> 90%) te vertegenwoordigen verontreinigingen en eiwitten binden niet specifiek aan de affiniteitsmatrix en dit wordt geïllustreerd in figuur 2B, zelfs bij het ​​wassen protocollen de meerderheid van cytoplasmatische contaminanten zoals GAPDH (Figuur 2A). De clustering van niet-specifiek bindende eiwitten in een normale verdeling maakt eiwitten die specifiek binden aan een eiwit van belang kunnen worden onderscheiden deze hogere sample / mock verhoudingen dan de achtergrond. Terwijl verontreinigingen theoretisch zou zich rond een _log2 SILAC verhouding van 0, is dit niet noodzakelijkerwijs het geval, wordt een voorbeeld gegeven in figuur 3. Mogelijke redenen hiervoor zijn onvolmaakte SILAC labeling van cellen laden ongelijke hoeveelheden of concentraties lysaat op de anti-GFP kralen, toevallig verlies van kralen bij zuiverings-of ongelijke mixing van de monsters aan het einde van de zuiveringsprocedure ^3. Echter uitgaande data geanalyseerd op basis van een drempel standaard afwijking van het gemiddelde van de normaal verdeelde verontreinigingen dienen kleinere verschuivingen in de centrering van de gegevens niet de kwaliteit van de resultaten.

Bij het vergelijken van verschillen in eiwitinteracties tussen twee verwante eiwitten, kan een soortgelijke situatie voordoen waarin een eiwit van belang wordt geproduceerd om hogere niveaus in cellen dan een seconde (hetzij door variatie in transfectie-efficiëntie, of een intrinsieke eigenschap van het eiwit of mRNA) . Enige variatie in expressie (bijvoorbeeld figuur 2A) kan worden gecorrigeerd door het analyseren van de SILAC verhouding voor deze twee monsters. In dit voorbeeld zouden dit de GFP-eIF4AI en GFP-eIF4AII monsters. Door het analyseren van de 4AI/4AII SILAC verhouding zoals besproken in hoofdstuk 7, is het mogelijk om eiwitten waarvan de binding verschilt aanzienlijk tussen isovormen identificeren.

In figuur 4 is een weergave van de eIF4A-bindende eiwitten die in een van de replica experimenten getoond dat het bereik van de opening factor complex dit protocol verkregen. De hoogste verhoudingen werden meestal waargenomen met eIF4G, die direct bindt aan eIF4A, met lagere verhoudingen voor eIF4E, dat bindt aan eIF4G op een plaats verwijderd van de eIF4A bindingsplaats. Lagere ratio's werden waargenomen voor de leden van de eIF3 complex. Echter, dit geeft duidelijk aan dat het experiment bevredigende geïdentificeerd zowel directe als indirecte binding partners van eIF4AI en II. Zoals kan worden verwacht uit de hoge sequentie identiteit ^6, eiwit: eiwit interacties bleek grotendeels geconserveerd tussen de twee isovormen in dit experimentele systeem ^{7, 8.} Een greep uit de interagerende eiwitten worden in Tabel 2 illustreert de gegevensindeling.

Kolomkop	Beschrijving
Toetreding	Geeft het toegangsnummer voor de reeks
Dekking	Deel van de eiwitsequentie onder de geïdentificeerde peptiden
♯ PSM	Peptide spectrale wedstrijd
♯ peptiden	Totaal aantal unieke peptiden geïdentificeerd voor een eiwit
♯ AA	De lengte van een eiwit aan aminozuren
MW (Da)	Het molecuulgewicht van een eiwit in Dalton. Exclusief wijzigingen
calc. PI	Het theoretische iso-elektrische punt van een eiwit
Partituur	De totale score van een eiwit (die de som van de indiv vertegenwoordigtidual peptide scores). De exacte score die nodig zijn voor betekenis zal variëren tussen de experimenten. Een MS faciliteit zal gelden doorgaans een 5% valse ontdekking tarief cutoff.
Sequentie	De sequentie van aminozuren die het eiwit
Verhouding	De relatieve intensiteit van peptiden in een benoemde gemerkte monster vergeleken met een tweede monster gelabeld
Ratio Aantal	Het aantal peptide ratio's die werden gebruikt om een ​​bepaald eiwit verhouding berekenen
Ratio variabiliteit (%)	De variabiliteit van de individuele peptide verhoudingen om een bepaald eiwitverhouding berekenen
Beschrijving	De naam van het eiwit

Tabel 1. Standaard kolomkoppen uit een Proteome Discoverer rapport.Terwijl nuttige informatie kan worden opgedaan met al deze kolommen, die van cruciaal belang voor deze analyse zijn vet weergegeven.

Toetreding	Peptiden	4AI/Mock	4AII/Mock	Naam	SILAC analyse
A8K7F6	21	100	1	eIF4AI	'Bait' eiwit
Q14240	22	0.01	90,855	eIF4AII
G5E9S1	25	47,575	30.53	eIF4GI	Interacterende eiwitten
Q59GJ0	5	11,778	10,619	eIF4GII60;
P06730	3	7.22	7.57	eIF4E
Q5T6W5	4	0.685	0.646	hnRNPK	Niet-specifieke binding contaminanten
P62805	1	0.531	0.498	Histon H4
H6VRG2	18	-	-	Keratine-1	Milieuverontreinigende stoffen
P35527	11	0.01	0.01	Keratine-1 cytoskelet 9

Tabel 2. Typische Gegevens uit een SILAC immunoprecipitatie experiment. Geven bijvoorbeeld gegevens voor een eiwit van interesse / aas (hoog peptiden, hoge verhouding), eiwitten die interageren met een eiwit van interesse (hoog / laag peptiden, hoge verhouding), niet-specifiek binden eiwitten (hoog / laag Peptides, ratio lager wordt dan cutoff - in dit experiment 0,96), en milieuverontreinigende stoffen (vaak hoog peptiden, negatieve verhouding / onder de drempel).

Figuur 1. Proefopzet. Eerste cellen worden gekweekt in medium zonder arginine en lysine en gesubstitueerd met stabiele isotoop gemerkte arginine en lysine 2 weken (1). (2) Cellen worden gezaaid in 10 ^cm2 schalen en transiënt getransfecteerd met plasmiden die GFP (Mock) of GFP-fusie-eiwitten (monsters). (3) De cellen worden gelyseerd en GFP of GFP-fusie-eiwitten worden immunogeprecipiteerd uit cellysaten. (4) De monsters worden gecombineerd in een 1:1 verhouding en LC-MS/MS analyse worden aangeboden. De gegevens worden vervolgens geanalyseerd om lage vertrouwen eiwit ident verwijderencaties en een eiwitgehalte verrijking overeenkomend normaal interagerende eiwitten te selecteren.

Figuur 2. Geschikt immunoprecipitation omstandigheden bevestigen. A) Western blot analyse van cellysaten, evenals ongebonden en gebonden fracties van de immunoprecipitatie bevestigt expressie en immunoprecipitatie van het eiwit van belang. Een western blot tegen GAPDH bevestigt uitputting van niet-interagerende eiwitten en verdere western blot een bekende interactie partner van eIF4A bevestigt de succesvolle immunoprecipitatie van eiwitten binden aan het eiwit van belang. B) Wanneer interactie partners van een eiwit van belang niet bekend, een zilver gekleurde gel kan immunoprecipitatie van interagerende eiwitten bevestigen. Op deze zilver-vlek ed gelbanden voor GFP en GFP-eIF4AI/II zijn duidelijk, en een band migreren in de juiste grootte voor eIF4G is alleen aanwezig in de GFP-4AI/II-bound rijstroken en niet in de GFP controle rijstrook.

Figuur 3. Representatieve resultaten. Histogram toont de verdeling van eiwit verhoudingen ve herhaling van (A) GFP-eIF4AI of (B) GFP-eIF4AII pulldown. De 1,96 standaarddeviatie cutoff is gemarkeerd met een stippellijn. Interagerende eiwitten die buiten de normaal verdeelde verontreinigingen blijken uit ~ 0.25 1 in (A) en ~ 0,3-1,5 cm (B).

les/ftp_upload/51656/51656fig4.jpg "/>
Figuur 4. Identificatie van eIF complex leden van een replica van een SILAC IP experiment. Eiwitten groen waren het eiwit van belang voor de pulldown interactie eiwitten schaduw van rood naar wit volgens ₂ SILAC verhouding in het SILAC IP met rode log het meest voorkomende eiwit in de analyse, en wit zijn de 1,96 SD cutoff. Eiwitten grijs gearceerd werden niet geïdentificeerd in deze analyse.

Discussie

De SILAC pulldown strategie die hier beschreven is een zeer gevoelig en krachtig middel voor het opsporen van nieuwe eiwit: eiwit interacties, en bovendien maakt een snelle en eenvoudige discriminatie van veranderde bindingspatronen tussen nauw verwante monsters van belang. In dit voorbeeld werd deze techniek gebruikt om het eiwit te onderzoeken: eiwit interacties van de eIF4AI en eIF4AII eiwitten ^6. Voor zover de auteur, dit is de eerste studie in de literatuur benutten het nut van SILAC proteomics de cellulaire interactoom van deze twee isovormen van eIF4A onderzoeken.

De benadering zoals boven beschreven maakt gebruik van een GFP-tag en anti-GFP kralen ^{9, 10} en derhalve wijzigingen kunnen nodig zijn om deze aanpak te gebruiken voor een bepaalde proteïne van belang, bijvoorbeeld of de markering wordt geplaatst op de N-of C-terminus van een eiwit. Waar mogelijk, western blots of functionele testen moetenworden uitgevoerd om te detecteren binding van een bekende eiwit interactiepartner. Indien een eiwit fusie niet tolereren met een GFP-tag, andere tagging of pulldown strategieën zijn toegepast SILAC pulldown met beide andere tags (FLAG ^11, biotine ^12, STREP (eigen gegevens, ongepubliceerd)), of met primaire antilichamen tegen een eiwit van belang waar siRNA knock-down van het doelwit eiwit zorgt voor een controle monster ^13. Dergelijke experimenten zijn elders beschreven in de literatuur, maar kort, stap 1 en stap 5,4-8 worden zoals hierboven toegepast, met stappen 2-5,3 als geschikt zijn gemodificeerd voor de expressie / pulldown gekozen systeem met gelijke eiwit inputs zoals beschreven in stappen 2,4-2,5. Aangezien de kwantificering fasen mogelijk niet-specifieke binding eiwitgehalte bij de analyse niveau te verwijderen, is het raadzaam om pre-incubatie weglaten controlekorrels of hoge zout wast om een ​​lage-affiniteit proteïne behouden: eiwit interacties met een eiwit van interesse . Een nuclease may worden opgenomen of weggelaten uit dit protocol overeenkomstig de specifieke kenmerken van een bepaald experiment. Bijvoorbeeld: als de eiwitten in deze methode RNA helicases, RNase cocktail werd opgenomen in het protocol indirecte interacties gemedieerd via RNA (stap 3.2) te verwijderen. In sommige gevallen echter, kunnen er profiteren parallel experimenten met en zonder nuclease nucleïnezuur afhankelijke interacties identificeren.

Binnen dit protocol, is de omschakeling van 'medium' en 'zware' monsters in duplo experimenten aangeraden om te controleren voor variatie geïntroduceerd door verschillen in de SILAC media of celgroei. Een alternatief controlesysteem omvat de sequentiële schakeling van alle drie ('light', 'medium' en 'zware') media in replica experimenten. Hoewel deze aanpak is potentieel strengere ofwel verhogen de complexiteit van de analyse, zoals in ten minste een herhaling, een eiwit van interesse worden geproduceerd in 'light' gelabelde cellen en dus is het noodzakelijk onderscheid te maken tussen eiwitten steeds geïdentificeerd light-monsters (milieuverontreinigende stoffen zoals keratine) en die alleen verrijkt "lichte" monsters wanneer gebonden aan een eiwit van belang.

Hoewel het gebruik van kwantitatieve gegevens maakt onderscheid van specifieke van niet-specifieke interacties door het gebruik van een drempel onvermijdelijk enige echte interacties kunnen worden weggegooid. De bovenstaande aanpak is een eenvoudige en snelle wijze te werk om eiwit: eiwit interacties die gemakkelijk kan worden geprobeerd door onderzoekers zonder eerdere ervaring met massaspectrometrie of analyse van grote eiwit: eiwit interactie datasets. Voor de meeste toepassingen is dit meer dan voldoende voor het identificeren van nieuwe eiwitten van belang. Verdere modificaties deze benadering om dit verlies van gegevens te beperken worden elders in de literatuur beschreven en omvatten het gebruik van een protein frequentie bibliotheek waar bekend verontreinigende eiwitten voor een specifieke set van experimentele parameters (cellijn, kraal matrix, buffer voorwaarden) kunnen worden uitgesloten ^{10, 14.} Afhankelijk van de specifieke experimentele parameters noodzakelijk kan zijn om een ​​aantal controle-experimenten uitgevoerd om een ​​kraal proteoom genereren, kan daardoor stijgt zowel de kosten en complexiteit van het experiment. Meer informatie over deze techniek is beschikbaar op de website www.peptracker.co.uk ^14.

Voorts zij opgemerkt dat de hierboven beschreven protocol het mengen verschillend gemerkte monsters aan het einde van de immunoprecipitatie werkwijze (aangeduid als een mixing na zuivering - MAP SILAC experiment). Dit gebeurt als eiwit: eiwit interacties optreden bij een bepaalde evenwichtstoestand ^15. Opgemerkt moet worden dat andere groepen deze map SILAC benadering in dit protocol beschreven incubatie van de monsters gecombineerdevóór pulldown (Zuivering na mengen - PAM SILAC) gedurende een langere tijd (20 min tot 2 uur zijn in de literatuur) ^{15, 16.} Gebaseerd op hoe snel een eiwitverhouding daalt tot 01:01, is het mogelijk kwalitatief onderzoek bindingsaffiniteiten en eiwitten stabiele of dynamische interagerende eiwitten ¹⁵ definiëren.

Samengevat, SILAC pulldowns vertegenwoordigen een zeer krachtig middel ter identificatie van eiwitten die interageren met een bepaald eiwit van belang, in een fysiologisch relevante instelling. De techniek kan gemakkelijk worden aangepast om een ​​aantal verschillende strategieën zuivering, waardoor de toepassing ervan op een bepaalde proteïne van belang. Kwantificering van resultaten sterk vereenvoudigt identificatie van echte interacties en laat relaxatie stringente buffer omstandigheden gebruikt om niet-specifieke binders te verwijderen en daardoor behoudt lage affiniteit interacties. Als maximaal drie monsters kunnen worden vergeleken in de bovenstaandestrategie, de techniek heeft duidelijke troeven bij het vergelijken van de verschillen in eiwit binding tussen verschillende eiwit isovormen, mutante eiwitten, of het effect van farmacologische remmers. Als geheel gelstukjes worden geanalyseerd in plaats van individuele bands die vlek door Coomassie, het aantal eiwitten geïdentificeerd op groot vertrouwen zijn meestal hoger dan die welke in een standaard GST / TAP-pulldown, en experimentator bias bij het selecteren van eiwitten van belang wordt verwijderd. De techniek vergelijkt daarom zeer gunstig af bij andere veelgebruikte technieken die worden gebruikt bij de identificatie van nieuwe proteïne-interacties (gist 2-hybride, GST / Zijn TAP pulldowns).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM)	Dundee Cell Products	LM010	DMEM zonder Arginine en Lysine. (en bevat L-glutamine)
Dialysed FBS (10 kDa cutoff) 500 ml	Dundee Cell Products	DS1003
Arginine (R0) 25 g	Sigma-Aldrich	A8094	Resuspendeer 0,5 g in 6 ml PBS, filter steriliseer en bevries in 0,5 ml aliquots (geeft een 84 mg/ml stock)
Arginine (R6) 0,5 g	Cambridge Isotope Labs	CLM-2265	Resuspendeer 0,5 g in 6 ml PBS, filter steriliseer en bevries in 0,5 ml aliquots (geeft een 84 mg/ml stock)
Arginine (R10) 0,5 g	Cambridge Isotope Labs	CNLM-539	Resuspendeer 0,5 g in 6 ml PBS, filter steriliseer en bevries in 0,5 ml aliquots (geeft een 84 mg/ml stock)
Lysine (K0) 25 g	Sigma-Aldrich	L8662	Resuspendeer 0,5 g in 3,5 ml PBS, filter steriliseer en bevries in 0,5 ml aliquots (geeft een 146 mg/ml stock)
Lysine (K4) 0,5 g	Cambridge Isotope Labs	DLM-2640	Resuspendeer 0,5 g in 3,5 ml PBS, filter steriliseer en bevries in 0,5 ml aliquots (geeft een 146 mg/ml stock)
Lysine (K8) 0,5 g	Cambridge Isotope Labs	CNLM-291	Resuspendeer 0,5 g in 3,5 ml PBS, filter steriliseer en bevries in 0,5 ml aliquots (geeft een 146 mg/ml stock)
Penicilline/streptomycine, vloeibaar. 100 ml	Gibco	15140-122
Lipofectamine 2000 transfectie reagens	Invitrogen	11668-027
GFP-trap Agarose (500 μl hars)	Chromotek	gta-20
5x SDS Sample loading buffer	Fisher Scientific	PN39000	Het gebruik van gekochte in plaats van zelfgemaakte monsterbuffer wordt aanbevolen om keratinecontaminatie te minimaliseren.
Protease inhibitor cocktail set III	Calbiochem	539134
1,7 ml voorgesmeerde buizen	Costar	3207
BCA eiwit analyse kit (1 L)	Pierce	23225
Tris (Trizma)	Sigma-Aldrich	T1503
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)	Sigma-Aldrich	E6758
Natriumchloride	Sigma-Aldrich	S3014
Rnase cocktail	Ambion	AM2286
NP-40 alternatief	Millipore	492016