Het bestuderen van DNA Looping door Single-Molecule FRET

Samenvatting

Deze studie geeft een gedetailleerde experimentele procedure om looping dynamiek van dubbelstrengs DNA meten met behulp van single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). Het protocol beschrijft ook hoe de looping kansdichtheid genaamd de J-factor halen.

Samenvatting

Buigen van dubbelstrengs DNA (dsDNA) is geassocieerd met vele belangrijke biologische processen zoals DNA-eiwit herkenning en DNA verpakking in nucleosomen. Thermodynamica van dsDNA buiging is bestudeerd door een methode genaamd ringvorming die gebaseerd is op DNA ligase covalent treden korte kleverige uiteinden van dsDNA. Echter, kan ligatie efficiëntie worden beïnvloed door vele factoren die niet gerelateerd zijn aan dsDNA looping zoals de DNA-structuur rond de sloot sticky ends, en ligase kan ook invloed hebben op de schijnbare looping tarief via mechanismen zoals niet-specifieke binding. Hier laten we zien hoe dsDNA looping kinetiek meten zonder ligase door het detecteren van tijdelijke DNA lusvorming door FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA-moleculen zijn opgebouwd volgens een eenvoudige PCR-gebaseerde protocol met een FRET-paar en een biotine linker. De lus kansdichtheid bekend als de J-factor wordt uit de looping snelheid en de annealing-verhouding tussen twee scheidersted sticky ends. Door het testen van twee dsDNAs met verschillende intrinsieke krommingen, tonen we dat de factor J gevoelig is voor de eigen vorm van de dsDNA.

Inleiding

Inzicht in de mechanische eigenschappen van dsDNA is van fundamenteel belang in de basiswetenschappen en technische toepassingen. De structuur van dsDNA is ingewikkelder dan een rechte spiraalvormige ladder omdat roll, tilt, en draai hoeken tussen opeenvolgende baseparen kan variëren met de volgorde. Thermische fluctuaties veroorzaken dsDNA tot diverse vormen van conformationele schommelingen zoals buigen, draaien en strekken ondergaan. Overgangen zoals smelten en knikken kan ook in extreme omstandigheden.

Onder deze moties, dsDNA buigen is de meest opvallende biologische gevolgen ^1. dsDNA buigen is geassocieerd met gen repressie of activatie doordat twee verre plaatsen dicht bij elkaar. Het speelt ook een belangrijke rol in DNA verpakking in de celkern of virale capside. Buigvervorming van dsDNA kan experimenteel worden gevisualiseerd door hoge-resolutie microscopie (AFM ² en ³ TEM) en de ThermodynAmics en kinetiek kan worden bestudeerd door looping assays, die chemisch verbinden naast elkaar plaatsen van de dsDNA.

Een dergelijke bepaling is ligase-afhankelijke cyclisatie ^4. In deze assay worden dsDNA moleculen met 'sticky' (cohesieve) uiteinden circulair of gedimeriseerd door DNA ligase. Door het vergelijken van de percentages cirkel en dimeervorming kan men een effectieve molaire concentratie van een uiteinde van het DNA in de nabijheid van het andere uiteinde, die bekend staat als de J factor verkrijgen. Deze J factor dimensioneel gelijk aan de waarschijnlijkheidsverdeling van het vinden van een uiteinde van het DNA op een korte afstand van het andere uiteinde, en reflecteert dus de flexibiliteit van het DNA. Het meten van de J als functie van DNA lengte onthult vele kenmerken DNA mechanica waaronder de persistentielengte ^4,5.

De worm-achtige keten (WLC) model is algemeen beschouwd als de canonieke polymeer model voor dsDNA monteurs op basis van zijn succes in toelichtingining de kracht-extensie curves verkregen DNA trekken experimenten ^6, en het correct voorspellen van de J factoren van dsDNAs langer dan 200 bp ^7. Bij gebruikmaking van de ringvorming kwantitatieve analyse van dsDNA-moleculen zo kort als 100 bp, Cloutier en Widom gemeten J factoren die enkele orden van grootte hoger dan de WLC modelvoorspelling ⁸ zijn. Een jaar later, Du et al.. geproduceerd J factoren in overleg met de WLC model met behulp van de ringsluiting assay met lagere concentraties van ligase en krijgen het afwijkende resultaat uit de Widom groep hoge ligase gebruikte concentraties ^9. Deze controverse is een voorbeeld van de onvermijdelijke invloed van DNA-ligase op cycliseringsreactie kinetiek bij gebruik van de conventionele test ^9. Bovendien kan DNA-ligase ook invloed hebben DNA-structuur en stijfheid door specifieke binding ^10,11.

Om de technische bezwaren van eiwit-afhankelijke looping assays elimineren, we onlangs aangetoond een protein-free looping assay gebaseerd op Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) ^12. Bij deze werkwijze worden een lus conformaties gedetecteerd door FRET tussen de donor en acceptor bevestigd nabij de kleverige uiteinden van een DNA-molecuul. Een objectieve type totale interne reflectie fluorescentie microscoop (TIRFM) wordt gebruikt om trajecten van reversibele looping en unlooping gebeurtenissen uit het oppervlak geïmmobiliseerde enkel DNA moleculen gedurende lange tijd nemen. Deze werkwijze heeft PCR gebaseerde assemblage van DNA moleculen aan-mismatch vrij DNA moleculen, een cruciale verbetering over eenzelfde methode Vafabakhsh Ha en ¹³ genereren. De single-molecule aspect van dit protocol maakt meting van de uitkeringen in aanvulling op gemiddelden ensemble terwijl de FRET aspect maakt het mogelijk om DNA looping dynamiek herhaaldelijk meten van hetzelfde molecuul, zelfs in omstandigheden die ligase activiteit kan schaden.

De TIRFM opstelling is weergegeven in figuur 1. Een aangepasteOntworpen specimen stadium wordt geplaatst over een Olympus IX61 microscoop lichaam. 532 nm en 640 nm lasers worden ingebracht van de zijkant en worden gereflecteerd door kleine elliptische spiegel ¹⁴ in de hoge NA doel kritische invalshoek bereiken op het dekglaasje-water grensvlak. Wij merken op dat meer verspreid via-doelstelling TIR met behulp van dichroïsche spiegels of prisma-gebaseerde TIR instellingen kunnen ook worden gebruikt voor deze FRET toepassing. De fluorescentie beeld gevormd door de microscoop wordt opgesplitst in donor-en acceptor beelden door een dichroïsche spiegel. Ze worden vervolgens opnieuw afgebeeld op twee helften van een EMCCD. Aanvullende emissiefilters long pass gebruikt om achtergrondsignaal verminderen.

De temperatuurregeling is essentieel voor het verkrijgen van reproduceerbare kinetische gegevens. Voor de temperatuurregeling, wordt het doel gescheiden van het neusstuk van de microscoop lichaam om warmte-overdracht, en water uit een temperatuur gecontroleerde chiller / verwarming te minimaliseren wordt gecirculeerd door een messing kraag die goed pastrond het interieur metaal onder de doelstelling jas. Deze opstelling kan robuuste temperatuurregeling bij het ​​dekglaasje oppervlak tussen 15 en 50 ° C (Figuur 2) te bereiken. In dit werk werd het monster temperatuur op 24 ° C.

Het volgende protocol toont de stap-voor-stap procedure voor DNA constructie schatting van DNA vorm, single-molecule experiment en J factor bepalen.

Protocol

1. DsDNA Monsterbereiding

1. Ontwerpen wereldwijd gebogen DNA door het herhalen van een 10-meer sequentie. Bijvoorbeeld, 5'-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) ₇ - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 'is een 186-bp DNA gebogen waarbij X een willekeurig extra basis en de sequentie flankerende het herhalende 10-meer sequentie adaptersequenties.
   Opmerking. In dit voorbeeld twee 10-meren met tegengestelde voorkeuren nucleosoom vorming basis van een grootschalig nucleosoom bezetting studie van Kaplan et al. ¹⁵ gekozen. Sinds de spiraalvormige herhaling van dsDNA is bijna 10 bp, zal de netto afbuiging van de spiraalvormige as van de 10-meer accumuleren tot een vorm zoals een cirkelvormige boog (figuur 3A) te produceren. Sinds de spiraalvormige periode dichter bij 10,5 bp, wordt een extra base ingevoegd na elke twee herhalingen aan de gebogen structuur houden zo vlak mogelijk. Deze sequenties korter dan 200 bp kan van companie worden bestelds dat aanbod gensynthese service. Het is handig om deze sequenties gemeenschappelijke adaptersequenties voor daaropvolgende stappen flankeren. De procedure is schematisch in figuur 3B.
2. Voer PCR met Primer 1 (GTGCCAGCAACAGATAGC) en Primer 2 (/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG). OPMERKING: Primer 2 is gelabeld met de FRET donor Cy3 aan het 5'-uiteinde. Een typische PCR recept en fietsen protocol opgenomen in de tabellen 1 en 2.
3. Voer PCR met Primer 3 (/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC) en Primer 4 (CAACAACGAGCTCGAATG). OPMERKING: Primer 3 wordt gelabeld met de acceptor FRET Cy5 door de ruggengraat en de biotine-linker aan het 5'-uiteinde. PCR recept en fietsen protocol zijn zoals hierboven.
4. Zuiveren de PCR producten met behulp van een PCR cleanup kit.
5. Meng de Cy3-gemerkte product en de Cy5-gelabelde product in een buffer strenguitwisseling (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,0, 1 mM EDTA) bij eindconcentraties van 0,4 &# 181, M en 0,1 uM, respectievelijk. OPMERKING: De overmaat Cy3-DNA verhoogt de concentratie van de duplex die zowel Cy3 en Cy5 als gevolg van strenguitwisseling.
6. Uitwisseling strengen door incuberen bij 98,5 ° C gedurende 2 min, geleidelijk afkoelen tot 5 ° C met een helling van 0,1 ° C / sec, en incubatie bij 5   ° C gedurende 2 uur.

2. Gelelektroforese te detecteren dsDNA Curvature

1. Giet de polyacrylamidegel ^16,17 door mengen acrylamide en bis-acrylamide oplossingen op 29.2:0.8 verhouding, 5% (w / v) in 1 x Tris / boraat / EDTA (TBE) buffer bij pH 8,0. Opmerking: 10 ml geloplossing bevat: 1.217 ml 40% acrylamide, 0,667 ml 2% bis-acrylamide, 1 ml 10X TBE, 100 L ammoniumpersulfaat (APS) 10%, 10 L TEMED, en de rest is dH ₂ O. Volledige stolling van de gel ongeveer 30 minuten.
2. Laad de polyacrylamide gel met DNA-monsters en DNA ladder in 1X laadbuffer (5% glycerol, 0,03% (w / v) broomfenolblauw blue) en laat de gel bij 5-8 V / cm bij 4 ° C gedurende 45 minuten of totdat de kleurstof front benaderingen het einde van de gel.
3. Vlekken op de gel met 1X TBE buffer die 0,5 g / ml ethidiumbromide gedurende 30 minuten bevat. Identificeer de DNA-banden onder UV-belichting. Vergelijk band posities met de grootte marker (100 bp DNA-ladder) aan de schijnbare grootte van de DNA-moleculen te berekenen. OPMERKING: Gebogen DNA bewegen over het algemeen langzamer dan rechte DNA's.

3. Flow Cell Preparation

1. Boor 6-7 paren van gaten aan twee tegenover elkaar gelegen randen van een glasplaatje (3'' x 1'') met behulp van een kolomboormachine en diamant boren. Na het boren, wrijf de glijbaan in stromend water om zichtbare glaspoeder verwijderen. OPMERKING: De gaten dienen als perfusie-en uitlaten. Tijdens het boren koelen de dia met water is belangrijk om scheuren te voorkomen.
2. Plaats de dia's rechtop in een glazen pot en vul deze met water. Ultrasone trillingen gedurende 15 minuten en breng ze in een andere glazen pot dedicated voor aceton reinigen. Vul het met aceton en ultrasone trillingen gedurende 15 minuten. Spoel de glaasjes met ethanol met behulp van een spray fles en daarna met water. Plaats ze in een beker van polypropyleen, vul het met 5 M kaliumhydroxide, en ultrasone trillingen gedurende 15 minuten. Tenslotte ultrasone trillingen de objectglaasjes in water gedurende 15 minuten. Reinig de dekglaasjes (nr. 1, 24 x 40 mm) met hetzelfde protocol. OPMERKING: Niet vervuilde dia's en dekglaasjes kan in dH ₂ O worden opgeslagen voor gebruik op lange termijn.
3. Meng 1 mg biotine-PEG-silaan (MW 3400) met 80 mg mPEG-silaan (MW 2000) in 340 L van 0,1 M natriumbicarbonaat oplossing. Meng goed en centrifugeer het mengsel kort om zich te ontdoen van de bubbels. OPMERKING: De functionalisering van het oppervlak met polyethyleenglycol (PEG) vermindert niet-specifieke binding van DNA aan het oppervlak.
4. Zet 80 L van de PEG-oplossing op elke dia toe en laat een dekglaasje overheen. Wacht 45 minuten. Scheid de dekglaasje van de glijbaan met een pincet, spoel ze af met ruime hoeveelheid dH ₂ O en laat tzoom drogen in open lucht.
5. Plaats dunne reepjes van dubbele plakband over de dia om kanalen te vormen. Lijn een dekglaasje overheen en drukt u stevig op de dekglaasje tegen de dia vloeistofdichte kanalen vormen. Gebruik 5 minuten epoxy aan de randen van de kanalen dichten.

4. Bereiding van Trolox Oplossing

1. Zet ~ 30 mg Trolox en 10 ml dH ₂ O in een kolf en gebruik een magneet roerstaafje om de oplossing in de open lucht gedurende 18 uur roeren.
2. Filtreer de oplossing met behulp van een 0,2 um filter en de pH op 7 door toevoeging ~ 6 ui 1 M Tris-base (pH 11). Opmerking: Trolox is een anti-knipperende reagens dat veel gebruikt wordt in single-molecule studies ^18. De antifading actie van Trolox komt van zijn geoxideerde derivaat, dat aanwezig is in gedeeltelijk aangetast Trolox oplossing ¹⁹ is. Snel oplossen Trolox in methanol of hoge pH Tris oplossing moet worden vermeden door inefficiënte oxidatie.

5. Single-molecule Imaging

1. Injecteer 15 pi neutravidine oplossing (0,5 mg / ml) in het kanaal en wacht 2 min voor spoelen met 100 pl T50 buffer (10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7.0).
2. Injecteer 50 pl DNA monster (50-100 pM) in het kanaal. Wacht 5 minuten en spoel de ongebonden DNA weg met 100 L van T50 buffer. OPMERKING: DNA moleculen zullen specifiek binden aan het oppervlak door neutravidine-biotine interactie.
3. Vul het kanaal met de beeldvormende buffer die een zuurstof opvangsysteem ²⁰ (100 mM PCD, 5 mM PCA, 1 mM Trolox en 500 mM NaCl) bevat.
4. Stel de EMCCD in frame-transfer mode naar 2 x 2 binned beelden (256 x 256) te streamen naar de computer met 25 frames per sec.
5. Doe immersie olie op de microscoop objectief, en zet de stroom cel op de microscoop podium met behulp van specimen clips. Grof scherpstellen door te kijken naar de laser reflectie patroon op de muur. Fijn scherpstellen met behulp van de live weergave van de fluorescentie imleeftijden op de monitor.
6. Begin data-acquisitie met de 532 nm laser in. Controleer de live view en de scherpstelling aan te passen indien nodig. Stop met data-acquisitie wanneer de meeste moleculen photobleached.
   OPMERKING: In deze faciliteit, een-lab geschreven C programma om de microscoop controleren en weer live beelden op de monitor wanneer ze worden opgeslagen op de harde schijf wordt gebruikt.

6. Beeldverwerking en Data-analyse

OPMERKING: Een tijdreeks van 256 x 256 beelden worden verwerkt door een MATLAB-code in single-molecule tijd sporen van Cy3 en Cy5 intensiteiten genereren. Om pixels tussen de donor en de acceptor kanaal kanaal van het imago van de gesplitste weergave koppelen, 6-7 paren van Cy3 en Cy5 vlekken, elk paar van hetzelfde molecuul gelijkmatig verspreid over het gezichtsveld, worden handmatig geplukt, en een affiene transformatie wordt berekend met behulp van de coördinaten van deze plekken als ankerpunten.

1. Met behulp van een MATLAB script, kijken door alle single-molecule tijd sporen tmuts Toon meerdere overgangen tussen lage en hoge FRET signalen. Identificeer de lus en unlooped staten.
   Opmerking: Het FRET signaal wordt gedefinieerd als de Cy5 intensiteit (I _a) gedeeld door de som van Cy3 en Cy5 intensiteiten (I _a + I _d). Looped staat heeft een hoge FRET waarde terwijl unlooped staat heeft lage FRET waarde. Het histogram van FRET signalen van een enkel molecuul wordt bimodaal verdeeld vanwege omkeerbare looping en unlooping.
2. Zoek de drempel die de twee verdelingen scheidt door het bepalen van het snijpunt tussen de twee gepaste Gauss curves.
3. Bereken de FRET efficiëntie en wijs de lus staten met een hoge FRET waarden en de unlooped landen met lage FRET waarden.
4. Met een MATLAB script analyseren de cumulatieve aantal moleculen (N (t)) dat een lus (ofbereikte de hoge FRET staat) op verschillende tijdstippen vervalt sinds het begin van de data-acquisitie. OPMERKING: Aangezien een dsDNA-molecuul kan beginnen in een conformatie van de unlooped staat aan het begin van de data-acquisitie, het groeitempo van de lus bevolking weerspiegelt de gemiddelde snelheid over de eerste looping conformaties gemiddeld. Pak de looping tarief k _lus door het aanbrengen van N (t) met een exponentiële functie: Als verhogingen in twee fasen, kan worden uitgerust met een dubbele exponentiële functie: In dit geval is k _lus verkregen: OPMERKING: Theoretisch, de overlevingskans dat een polymeer is niet gelust op tijdstip t is geen enkele of dubbele exponentiële functie ^12. Exponentiële fitting wordt gebruikt als een praktisch middel om de gemiddelde tijd looping extraheren.

7. Bepalen van de J Factor

OPMERKING: De J factor geeft aan hoe geconcentreerd ene uiteinde van een dsDNA rond het andere uiteinde. Het kan worden bepaald door interpolatie van de concentratie van een segment van het DNA dat dezelfde reactiesnelheid zou opleveren met het andere uiteinde bevindt als gemeten looping tarief. Experimenteel wordt een segment geïmmobiliseerd op het oppervlak, en het andere segment is geïntroduceerd op een bepaalde concentratie c. Als de gemeten annealing snelheid tussen de twee uiteinden is k _gloeien, wordt vervolgens de J factor ²¹ van de . Het gloeien snelheidsconstante (k = k _{annealen gloeien} / C) is onafhankelijk van de probe concentratie.

1. Flow 20 ul van 30-50 pM biotine-Cy5 oligo (Primer 3) into een neutravidine-coated kanaal. Spoel het kanaal met 100 ul T50 weg te spoelen ongebonden oligo's.
2. Bereid de beeldvorming buffer zoals in deel 5 met de toevoeging van Cy3 oligo (primer 2) bij een eindconcentratie van 50 nM. Vloeien deze beeldvorming buffer in het kanaal.
3. Terwijl de 532 nm laser, zet kort de 640 nm laser op locaties van het oppervlak gebonden Cy5 oligo's te identificeren. Schakel de 640 nm laser en beginnen met het monitoren van de FRET signaal.
   OPMERKING: Bij hybridisatie van Cy3 oligo een oppervlak gebonden oligo Cy5, Cy5 fluorescentie zullen voortvloeien uit FRET.
4. Met een MATLAB script analyseren het aantal moleculen die beginnen in de ongebonden toestand (laag Cy5 intensiteit) maar later zetten in de gegloeide toestand (hoog Cy5 intensiteit) als functie van de tijd van de Cy5 intensiteit sporen.
5. Plotten dit aantal gegloeide moleculen tegen de tijd. Past deze curve met een exponentiële functie ( ) Om het gloeien tarief (k _gloeien) te verkrijgen.
6. Herhaal dit experiment bij verschillende concentraties Cy3 oligo (60, 100 en 180 nM) lineariteit tussen de annealing snelheid en de reactant concentratie bevestigen. Extract van de tweede-orde gloeien snelheidsconstante (k _gloeien ) Van de helling.
7. Bereken de J-factor van , Waarbij k de _lus looping snelheid gemeten in dezelfde buffer staat.

Resultaten

DNA-moleculen voor de looping studie uit een duplexgebied variabele sequentie en lengte enkelstrengs overhangen die complementair aan elkaar zijn. De overhangen, die 7-base lang zijn, kunnen hybridiseren met elkaar om de lus staat vast te leggen. Elke overhang bevat ofwel Cy3 of Cy5 die is gekoppeld aan de DNA backbone via amidiet chemie. De Cy5-overhang is ook verbonden met biotine-TEG (15-atoom Tetra-Ethyleen Glycol spacer) voor oppervlakte immobilisatie (zie figuur 4A). Al deze wijzigingen kunnen in ...

Discussie

Een eenvoudige single-molecule assay gebaseerd op FRET werd gebruikt om looping kinetiek van DNA van verschillende intrinsieke vormen bestuderen. Gebogen DNA kan worden bereid door het herhalen van een 10-meer sequentie in fase met de spiraalvormige periode van 10,5 bp en de krommingen kunnen worden geschat PAGE. Deze dsDNAs zijn ontworpen met sticky ends op voorbijgaande lus kan stabiliseren. We onttrokken de looping tarief van de exponentiële toename van het aantal lus moleculen in de tijd. De annealing snelheidsconst...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Small DNA FRAG Extract Kit-100PR	VWR	97060-558
Acrylamide 40% solution 500 ml	VWR	97064-522
Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 ml	VWR	97063-948
GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1,000 bp	Fermentas	SM0241
Mini Vertical PAGE System	VWR	89032-300
Syringe filter 0.2 μm CS50	VWR	A2666
Trolox	Sigma-Aldrich	238813-1G	triplet state quencher
Protocatechuic acid (PCA)	Sigma-Aldrich	08992-50MG	oxygen scavenging system
Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD)	Sigma-Aldrich	P8279-25UN	oxygen scavenging system
mPEG-silane, MW 2,000 1 g	Laysan Bio	MPEG-SIL-2000-1g
Biotin-PEG-Silane, MW 3,400	Laysan Bio	Biotin-PEG-SIL-3400-1g
Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein	Invitrogen	A2666
Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	F-540L
Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit	IBI Scientific	IB47020
Premium plain glass microscope slides	Fisher Scientific	12-544-1
VWR micro cover glass, rectangular, no. 1	VWR	48404-456
Fisher Scientific Isotemp 1006S Recirculating Chiller/Heater	Fisher Scientific		temperature control
Objective Cooling Collar	Bioptechs	150303	temperature control
KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage	Semprex	KMI53
High Performance DPSS Laser 532 nm 50 mW	Edmund optics	NT66-968	Cy3 excitation
CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30 mW, Fiber, FC/APC Connector	Coherent	1139604	Cy5 excitation
650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter	Semrock	FF650-Di01-25x36	splitting dichroic
LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, & 543.5 nm lasers, 25 mm	Semrock	LM01-552-25	combining dichroic
Brightline Fluorescence Filter 593/40	Semrock	FF01-593/40-25	Cy3 emission filter
635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm	Semrock	BLP01-635R-25	Cy5 emission filter
EMCCD iXon+	Andor Technology	DU-897E-CS0-#BV
IX51 inverted microscope frame	Olympus
Objective UApo N 100X/1.49 Oil TIRF	Olympus
Immersion oil type-F for fluorescence microscopy	Olympus	IMMOIL-F30CC
2 mm Diameter 45° Rod Lens Aluminum Coated	Edmund optics	54-092	miniature mirror
1/4" Travel Single-Axis Translation Stage	Thorlabs	MS-1	translation of miniature mirror
Ø1" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm	Thorlabs	AC254-200-A	focusing lens
Adjustable Mechanical Slit	Thorlabs	VA100
Dielectric Mirror	Thorlabs	BB1-E02
Ø1" Achromatic Doublet, f = 100 mm	Thorlabs	AC254-100-A	relay lens
Lens Mount for Ø1" Optics	Thorlabs	LMR1
Dichroic Filter Mount	Thorlabs	FFM1
Fixed Cage Cube Platform	Thorlabs	B3C
Kinematic Mount for Ø1" Optics	Thorlabs	KM100
N-BK7 Plano-Convex Lens, Ø1", f = 40 mm	Thorlabs	LA1422-A	collimating lens
N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 15 mm	Thorlabs	LA1222-A	telescope lens
N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 150 mm	Thorlabs	LA1433-A	telescope lens