Multi-step Voorbereiding Techniek om meerdere Metabolite Compound Klassen voor In-diepte en Informatieve Metabolomic Analyse Recover

Samenvatting

De betrouwbaarheid van de resultaten in metabolomics experimenten afhankelijk van de effectiviteit en de reproduceerbaarheid van de monstervoorbereiding. Beschreven is een strenge en diepgaande methode die extractie van metabolieten van biologische vloeistoffen maakt met de mogelijkheid om later te analyseren tot duizenden verbindingen, of gewoon de verbinding klassen van belang.

Samenvatting

Metabolomics is een opkomend gebied waarin profilering van monsters maakt van levende organismen om inzicht te krijgen in biologische processen. Een essentieel aspect van metabolomics is monstervoorbereiding waarbij inconsistent technieken genereren onbetrouwbare resultaten. Deze techniek omvat eiwitprecipitatie, vloeistof-vloeistof extractie en vaste fase extractie als middel fractioneren metabolieten in vier verschillende klassen. Verbeterde verrijking van lage overvloed moleculen met als gevolg een toename van de gevoeligheid wordt verkregen, en uiteindelijk resulteert in meer zelfvertrouwen identificatie van moleculen. Deze techniek is toegepast op plasma, bronchoalveolaire lavage vloeistof en cerebrospinale vloeistof monsters met volumes van 50 ul. Monsters kunnen worden gebruikt voor meerdere downstream-toepassingen; bijvoorbeeld kan de pellet verkregen uit eiwitten neerslaan worden opgeslagen voor latere analyse. De supernatant uit deze stap ondergaat vloeistof-vloeistofextractie met gebruikmakingwater en een sterke organische oplosmiddel om de hydrofiele en hydrofobe verbindingen te scheiden. Eenmaal gefractioneerde, kan de hydrofiele laag worden verwerkt voor latere analyse of weggegooid als niet nodig. De hydrofobe fractie wordt verder behandeld met een reeks van oplosmiddelen gedurende drie vaste-fase extractie stappen te scheiden in vetzuren, neutrale lipiden en fosfolipiden. Hierdoor kan de monteur de flexibiliteit om te kiezen welke klasse van verbindingen de voorkeur voor analyse. Het helpt ook bij betrouwbaarder metaboliet identificatie sinds enige kennis van chemische klasse bestaat.

Inleiding

Biologische reacties genereren metabolieten als eindproducten van cellulaire processen. Metabolomics is een verzameling van alle aanwezig in een organisme als gevolg van deze processen verbindingen. Het geeft een beeld van de fysiologie van cellen en geeft reactie van een organisme op externe of interne stimuli ^{1, 2.} Dergelijke stimuli kunnen zijn milieu, toxicologische, farmacologische, de voeding, hormonale, of in verband met ziekte. Veel metabolomic toepassingen en worden momenteel bestudeerd door onderzoekers en omvatten de ontdekking van biomarkers ^3, voeding studies ^4, voedsel wetenschap ^5, en drugstesten ^6. Ongeacht de toepassing, variaties in gegevens, besmetting, en de aanwezigheid van valse positieven moeten worden verminderd of bij voorkeur verwijderd. In biomarkerontdekking of bij het bepalen verschillen tussen controle en ziekte groep of onderzoeken van effecten van geneesmiddelen op onderwerpen, biologische fLUID is gekozen op basis van de vragen die gesteld en de soorten metabolieten onderzocht ^7. Als bijvoorbeeld het bestuderen van de directe effecten van een geïnhaleerde geneesmiddel op de longen van astmapatiënten, dan verkennen metabolieten in bronchoalveolaire lavage vloeistof (BALF) monsters voor en na toediening preferentiële zou zijn. Om ervoor te zorgen dat de waargenomen verschillen zijn te wijten aan de werkelijke biologische variatie in plaats van onjuiste monsterbereidingstechniek, gestandaardiseerde en consistente laboratoriumprotocol is essentieel ^8. Informatie over het monster zorgvuldig gedocumenteerd zodat variabelen zoals biologische vloeistof, dierlijke stam bemonsteringstijd onderworpen leeftijd, geslacht, te noemen, worden alle beschouwd en verwerkt in de studie ^9. Daarnaast is de mogelijkheid van contaminatie of valse positieven te verminderen, is het aanbevolen dat oplosmiddel blanks en instrument blanks worden geanalyseerd ^10.

Voor dit protocol, de term "metabolites "gebruikt om te verwijzen naar de werkelijke verbindingen geïdentificeerd. Het gebruik van software leverancier, is een eerste piek bevinding algoritme dat wordt gebruikt om de massa spectrale pieken te detecteren. Deze pieken zijn afgestemd gebaseerd op massa-tot-lading (m / z) verhouding en de retentietijd. Een tweede algoritme wordt dan gebruikt om meerdere functies te combineren tot een enkele verbinding. Dit omvat functies zoals natrium, kalium of ammonium adducten in de positieve ionisatiemodus en chloride in de negatieve ion modus. Extra opties in de software zijn uitgerust met voorzieningen zoals dimeren en andere adducten. Met glucose als voorbeeld, met pieken bij 181.0707 m / z (M + H), 198,0972 m / z (M + _NH4), 203,05261 en m / z (M + Na), zouden drie pieken bij dezelfde verbinding met het eerste algoritme. Echter wanneer het tweede algoritme, dat berust op moleculaire formule wordt toegepast deze drie adducten worden gegroepeerd resulteert in een verbinding.

Metabolieten kan storingen veroorzaken binnen samples vanwege de complexiteit van verbindingen aanwezig. De aanwezigheid van duizenden metabolieten in een monster oorzaken signaalonderdrukking vooral van de lagere overvloed metabolieten. Voorbeeld opruimen verwijderen storende eiwitten en daaropvolgende scheiding in verschillende fracties vermindert de complexiteit van het monster zodoende de piekscheiding toenemende resolutie en verminderen metaboliet co-elutie. Daarom wordt opschoning van het monster en verbeterde scheiding van verbindingen vereist. Het is aangetoond dat eiwit precipitatie alleen, zelfs met het gebruik van verschillende polariteit oplosmiddelen, kan dit probleem niet oplossen ^{11, 12.} Echter, door het combineren van een sterk organisch oplosmiddel zoals MTBE met een volgende fractionering stap wordt de metaboliet dekking toegenomen. Yang et al.. ¹² rapporteerde een stijging van de metabolieten van 1851 of 2073 met methanol of methanol-ethanol precipitatie alleen respectievelijk 3.806 metabolieten met behulp van gecombineerde MTBE solventextractiegevolgd door vaste-fase-extractie (SPE) stappen. Verminderde metaboliet overlap, verbeterde piekscheiding en verhoogde metaboliet overvloed waargenomen met deze methode.

Verontreiniging van niet-metabolieten, zoals polymeren, kunnen voortvloeien uit monstername, oplosmiddelen of instrument geluid, en kan resulteren in signaal onderdrukking van potentieel belangrijke metabolieten. Het wordt aanbevolen dat de monteur (s) en degenen die de monsters voorafgaand aan monstervoorbereiding consequent hetzelfde merk, type en grootte van het monster collectie flesjes, pipet tips en andere buizen gebruikt bij het verzamelen en de voorbereiding van de monsters. Hierdoor kan de data-analist om het volste vertrouwen dat de waargenomen veranderingen zijn echt en niet te wijten aan de achtergrond verschillen van andere bronnen hebben. Behandelingsdoeltreffendheid variaties tussen ziekten en controlegroepen, of andere metabolische analyses kunnen vervolgens worden onderzocht met verhoogde vertrouwen.

De method hier besproken richt op gecombineerde monstervoorbereiding ^13-15 die kunnen worden toegepast op plasma BALF of cerebrospinale vloeistof (CSF) monsters voor niet-gerichte metaboloom profilering voor vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LCMS) gebaseerde analyse. Zowel vloeistofchromatografie (LC) en ultra-vloeistofchromatografie (UPLC) scheidingstechnieken kunnen worden gekoppeld MS na deze procedure. Veel onderzoekers uitvoeren metabolietvorming gebruiken ofwel een eiwit precipitatie techniek en / of een vloeistof-vloeistofextractie techniek ^{16, 17.} In onze studies resulteerde in minder metabolieten gedetecteerd. De methode die hier ¹² beschreven kan de detectie en identificatie van een groter aantal metabolieten, die een breder scala van de metabolome. Deze toename is het gevolg van de grotere zuiverheid van de monsters en verminderde matrixeffecten van voorafgaande scheiding van de metaboliet klassen.

Een eerste protein precipitatie wordt uitgevoerd met koud methanol (MeOH) eiwit uit het monster te verwijderen. Vloeistof-vloeistof extractie (LLE) met methyl-tert-butylether (MTBE) en water wordt gebruikt om de hydrofiele en hydrofobe verbindingen te scheiden. Vervolgens vaste-fase-extractie (SPE) wordt uitgevoerd op de hydrofobe laag op de hydrofobe verbindingen te scheiden in drie klassen - vetzuren, neutrale lipiden en fosfolipiden. De hydrofobe fracties worden gereconstitueerd in 100% methanol, terwijl de hydrofiele fractie wordt opgelost in 5% acetonitril in water. De vaste-fase-extractie (SPE) stap biedt een extra niveau van vertrouwen in de resultaten door het verminderen van het aantal coeluting verbindingen die anders aanwezig zou zijn had een scheiding stap niet uitgevoerd.

Protocol

1. Initiële overwegingen, Voorbereiding van instrumenten en normen

1. Gebruik glazen altijd voor het opslaan van (glas cultuur buizen, glazen Autosamplervials) of de overdracht van (glazen pipetten) lipiden en organische oplosmiddelen.
2. Minimaliseer de blootstelling van alle lipide monsters en standaarden aan de lucht. Seal polytetrafluorethyleen (PTFE) caps strak om blootstelling lucht en verdamping te voorkomen. Onmiddellijk opnieuw in suspensie gedroogd lipiden in de komende oplosmiddel of bewaar ze in een gestage stroom van stikstof.
3. Gebruik 100 ul monster. In gevallen waarin meer (of minder) is beschikbaar, volume aan te passen. Gedurende de lipide fractionering op de SPE kolom _NH2, aangegeven hoeveelheden moet blijven zoals aangegeven.
4. Schakel de centrifuge en op 0 ° C voor de start van het monster voorbereiding.
5. Deze techniek maakt gebruik van veel vluchtige oplosmiddelen dus hou alle oplosmiddelen afgedekt tijdens de voorbehandeling.
6. Bereid twee soorten normen per aanbeveling.
7. Bereid een negatieve controle bestaat uit spiked-in normen alles tegen constante concentratie. Dit wordt ingespoten in alle monsters, alsook een samengevoegd monster dat wordt gebruikt als een batch QC (verrijkte samengevoegd monster gebruikt monstervoorbereiding reproduceerbaarheid op verschillende dagen volgen) en instrument QC (verrijkte gepoolde monsters eerder bereide, sub-porties verdeeld en gebruikt bewaken instrument voorwaarden / schommelingen tijdens de analyse en op verschillende dagen).
   1. De positieve controles op 1x, 2x en 4x standaard spikes. De positieve controles worden toegevoegd aan alle monsters alsmede een plasmamonster samengevoegd en worden gebruikt als kwaliteitscontrole verbindingen voor zowel de monstervoorbereiding stappen en instrumentele analyse stappen voor het analyseren en identificeren van de veelvoudverandering verschillen gedurende gegevensanalyse zodat alle aspecten van de voorbereiding en instrumentele analyse correct werden uitgevoerd.
8. WINKEL normen bij -20 ° C en bewaar monsters bij -80 ° C. Bepaalde interne standaardARDS die gevoelig zijn voor afbraak na langdurige opslag moet bij -80 ° C worden bewaard
9. Deze procedure vereist het gebruik van gevaarlijke, brandbare of vluchtige oplosmiddelen zoals MTBE. Voer alle stappen in een zuurkast.

2. Interne standaarden

1. Kies interne standaarden (ISTD) op basis van individuele projecten en hun specifieke experimentele opzet. Voor biofluids zoals plasma, BALF, of urine, een isotoop gemerkte istDS die van dezelfde aard als die biologisch gevonden in deze monsters zijn zou ideaal zijn. Deze kunnen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, aminozuren, hormonen of lipiden. Voor plantaardige metabolomic monsters, kon bestempeld standaarden zoals flavonoïden, carotenoïden of worden gebruikt. Hetzelfde geldt voor andere metabolietvorming waarbij de onderzoeker een interne standaard die representatief is voor het type monster dat geanalyseerd moet kiezen.
2. Zorg ervoor dat de gekozen ISTD omvat een breed scala van het chromatogram; bijvoorbeeld als tHij acquisitie is 20 minuten, normen die elke 5 min elueren worden gebruikt.
3. Maak hydrofiele voorraadoplossingen bij 2 mg / ml met verschillende isotopisch gemerkte standaarden en / of andere polaire verbindingen die exogeen geanalyseerde proef zijn. Van iedere voorraadoplossing, maak een oplossing in 1:1 methanol: water met alle normen tot een uiteindelijke concentratie van 25 ug / ml _{creatinine-D3,} 100 ug / ml lysine-D ₄ en 200 ug / ml valine-D ₈ .
4. Maak hydrofobe voorraadoplossingen met verschillende isotopisch gemerkte standaarden en / of andere niet-polaire verbindingen die exogeen geanalyseerde proef zijn; voorraadconcentraties van 17:00 vetzuur (4 mg / ml), 19:01 vetzuur (4 mg / ml), 17:00 ceramide (2 mg / ml), 17:00 PE (1,75 mg / ml), 15 : 0 PC (2 mg / ml), en testosteron-D ₂ (1 mg / ml). Per bestand, maakt een oplossing in 1:1 chloroform: methanol alle normen een eindconcentratie van 50ug / ml 17:00 ceramide, 100 ug / ml 15:00 PC 100 ug / ml testosteron-D _2, 200 ug / ml 17:00 vetzuur, 200 ug / ml 19:01 vetzuur en 200 ug / ml 17:00 PE in de standaard mix.
5. Test de mate van ionisatie van elke norm van tevoren met behulp van ten minste vijf verschillende concentraties voor elke standaard om de detectielimiet en de lineariteit van het instrument voor deze verbindingen te bepalen. De concentratie van de voorraadoplossing voor elke standaard is afhankelijk experimenteel ontwerp en de concentratie van elke standaard in de gecombineerde verrijkte norm kan variëren van 20 ug / ml tot 2 mg / ml afhankelijk van hoe goed ze ioniseren.
6. Maak een piek mix van positieve controles en voeg ze toe aan de monsters op 1x, 2x of 4x concentratieniveaus te controleren kwantitatief de sterkte van de monstervoorbereiding en de nauwkeurigheid van de instrumentele gegevens. Uiteindelijke concentratie van positieve controles kunnenzijn: 2 mg / ml D-glucose, 100 ug / ml alanine-D _3, 200 ug / ml methylmalonzuur-D _3, 20 ug / ml triglyceride-D ₅ en / of andere hydrofobe en hydrofiele normen. Stel de standaardconcentraties gebaseerd op de gevoeligheid van de MS en HPLC instrumentatie gebruikt voor analyse.

3. Protein Precipitation

1. Ontdooi monsters tot kamertemperatuur en spike 10 ul van ISTD aan elk monster zoals hieronder beschreven.
2. Spike 10 pl zowel hydrofiele als hydrofobe standaardoplossingen (gemaakt uit de voorraad in stappen 2.3 en 2.4) aan elk monster. Stel de standaardconcentraties noodzakelijk gebaseerd op de gevoeligheid van de MS en HPLC instrumentatie gebruikt voor analyse
   1. Spike 10 ul van beide 1x, 2x of 4x positieve controle oplossing (gemaakt op basis van de voorraad in stap 2.6) aan elk monster. Stel de standaardconcentraties noodzakelijk gebaseerd op de gevoeligheid van de MS en HPLC instrumentatie gebruikt voor analyse
   2. Vortex elk monster gedurende 10 seconden vóór het eiwit precipitatiestap
3. Voeg 400 ul ijskoude methanol (bewaard bij -20 ° C) aan elk monster.
4. Vortex gedurende 10 seconden per buis.
5. Centrifugeer bij 0 ° C gedurende 15 min bij 18.000 x g.
6. De overdracht van alle supernatant naar een nieuwe glazen cultuur buis, en dan droog onder _N2.
7. Als de analyse van het eiwit pellet-fractie, gaat u verder met stappen 3,8-3,11. Als niet het analyseren van de eiwitpellet, doorgaan naar hoofdstuk 4.
   Opmerking: Het eiwit pellet kunnen verbindingen met een hoge hydrofobiciteit die nuttig zou zijn bij het ​​uitvoeren van drugs studies bevatten ^18, voedsel analyseert waarbij hydrofobe flavonoïden ¹⁹ of metabolomics studies met betrekking tot ziekten waar zeer hydrofobe stoffen ophopen, zoals neuronale ceroid-lipofuscinosen ²⁰ en lysosomale lipide opslag ziekten ^21.
8. Voeg 1 ml van MTBE aan thij wit (of gebroken wit) eiwitpellet, vortex gedurende 30 seconden per buis en centrifugeer bij 0 ° C gedurende 15 minuten bij 18.000 x g. Schenk de MTBE laag om een ​​nieuw glas cultuur buis.
   Dit is een cruciale stap als fouten hier drastisch resultaten zal beïnvloeden (zie figuur 5 in representatieve resultaten).
   1. Consequent zuigen dezelfde hoeveelheid MTBE voor alle monsters aangezien de grootte van de pellet zal variëren tussen monsters. Daarom, als alleen 900 pi wordt overgegoten van het monster met de kleinste hoeveelheid supernatant, decanteer 900 pl voor alle monsters.
9. Herhaal stap 3.9, en combineren de organische laag om hetzelfde glas kweekbuis bereid in stap 3.7.
10. De gedroogde monsters door een stroom _N2 en resuspendeer in 200 ul van 01:01 chloroform: methanol. Vortex kort.
11. Transfer naar een centrifugebuis. Centrifuge bij 0 ° C gedurende 15 minuten bij 18.000 xg, vervolgens overbrengen supernatant schroefdop flesjes Autosampler behulp van glaspipetten.

4. Vloeistof-vloeistof extractie

1. Met behulp van een glazen pipet, voeg 3 ml MTBE aan de gedroogde methanol overblijvende (uit hoofdstuk 3, stap 6), vortex 30 sec, voeg 750 ul van water, dan vortex 10 sec per buis.
2. Spin ~ 200 xg gedurende 10 min in een centrifuge bij kamertemperatuur.
3. Zuig 2,5 ml van de MTBE-laag (zonder het krijgen van water) en overbrengen in een schone glazen cultuur buis.
   Opmerking: Dit is een cruciale stap als verschillen hier zullen de resultaten beïnvloeden. 2,5 ml MTBE dient zorgvuldig gedecanteerd van de toplaag, omdat hierdoor een vast volume gedecanteerd zonder pipetteren onder de waterlaag. Indien het volume van het monster aan het begin van het experiment was minder dan de aangegeven 100 ul van deze werkwijze schaal de hoeveelheid MTBE evenredig weerspiegelen deze startpunt monstervolume.
4. Voeg 3 ml MTBE om het resterende water deel van het monster, en vortex 10 sec per buis.
5. Spin ~ 200xg gedurende 10 min in de centrifuge bij kamertemperatuur.
6. Zuig 3 ml MTBE (zonder dat er water) en te combineren met MTBE buis.
7. Concentreer de resterende waterlaag door drogen onder _N2.
8. Resuspendeer residu in 100 ul water.
9. Voeg 400 ul van ijskoud MeOH om het glas cultuur buis, vortex kort en vervolgens transfer naar microcentrifugebuis.
10. Voeg bij -80 ° C gedurende 20-30 minuten. Spin bij 0 ° C gedurende 15 min bij 18.000 x g.
    Opmerking: Het wordt aanbevolen om het gehele monster rack te plaatsen in een -80 ° C vriezer zodat aan alle resterende eiwit neer te slaan in de methanol. Als een -80 ° C vriezer is niet beschikbaar, en andere opties: opslaan bij -20 ° C, het plaatsen van de monsters op droog ijs, en houden ze in een ijsemmer. Het is belangrijk om consequent monsters worden in een koude omgeving en bij dezelfde temperatuur om precipitatie mogelijk.
11. Aspireren 450 ul van supernatant en transfer naareen schone microcentrifugebuis. Volledig drogen in een vacuüm centrifugale concentrator op niet meer dan 45 ° C. (Duurt ongeveer 1-2 uur).
12. Resuspendeer gedroogd supernatant in 200 ul van 5% acetonitril / water. Vortex kort. Invriezen bij -80 ° C.

5. Solid-phase extractie

1. Droog de MTBE fractie onder stikstof bij 35 ° C met een goede stikstofstroom (ongeveer 10-15 min).
2. Als het geheel droog, stop de stroom van stikstof en snel opnieuw in suspensie in 1 ml chloroform _(CHCl3) met een glazen pipet. Vortex kort.
   Opmerking: Oplosmiddelen zoals _CHCI3 hebben een lage viscositeit. Tijdens pipetteren, lage oppervlaktespanning veroorzaakt verlies van oplosmiddel uit de pipet. Aanbevolen wordt de pipetpunt ten minste tweemaal voorbevochtigd equilibratie tussen het oplosmiddel wordt gepipetteerd en de ruimte in de pipet toe. Een gasdichte injectiespuit kan direct gebruikt worden.
3. Het opzetten van een SPE vacuümspruitstuk en NH ₂ SPE kolommen voor fractionering.
4. Warm monsters tot kamertemperatuur en altijd blijven opgehangen onder een gestage stroom van N _2. Opwarming tot RT zal lipide mengsel kan ontstaan ​​en de stikstof zal oxidatie en polymerisatie van lipiden te voorkomen.
5. Was en staat SPE cartridge 2x met 400 ul hexaan. Gooi afval en vervangen door nieuwe glascollectie buis.
6. Sample Toevoegen aan SPE kolom, verzamel doorstromen in glazen buizen.
7. Met glazen pipet 1 ml van 02:01 _CHCI3: IPA, verzamel doorstromen in dezelfde glazen buisjes (dit is de neutrale fractie).
8. Droog de ​​neutrale fractie onder _N2 voor oxidatie (duurt ongeveer 10-15 min) te minimaliseren.
9. Met glazen pipet 1 ml 5% azijnzuur in diethylether verzamelen doorstromen in nieuwe glazen buizen (dit is de vetzuurfractie).
10. Droog de ​​vetzuurfractie onder _N2 oxidatie (ongeveer 10-15 min) minimaliseren.
11. Gebruik plastic tips toe te voegen 800 &# 181 en l methanol SPE cartridge en verzamel doorstroming in 15 ml plastic conische buizen (dit is het fosfolipide fractie).
12. Transfer fosfolipidefractie tot 1,5 ml centrifuge buizen. De monsters met een centrifugale concentrator vacuüm bij 45 ° C (ongeveer 1-1,5 uur).
13. Resuspendeer elk van de monsters van de drie fracties in 200 ul 100% methanol, vortex, en overdracht flesjes schroefdop autosampler voor opslag.

6. Monsteropslag Voorwaarden

1. Bewaar alle monsters bij -80 ° C tot klaar voor instrument analyse.
   Opmerking: extractie monsters gereconstitueerd in organisch oplosmiddel kan worden bewaard bij -20 ° C. Maar dit wordt niet aanbevolen als potentiële metabolieten van belang zal degraderen bij deze temperatuur. Opslag vloeibare stikstof wordt ook niet aanbevolen als onderzoekers hebben gemeld besmetting kwesties, speciale opslag flacons nodig zijn, en er is een gebrek aan homogeniteit in de kamer Cauzingen sterke temperatuurschommelingen.
2. Als monstervolumes klein (<100 pl), gebruikt inserts in de injectieflacons oplosmiddel te verdampen in de kopruimte voorkomen tijdens opslag.
3. Vermijd vries-dooi van de monsters. Ontdooi de monsters slechts een keer, vlak voor instrument analyse. Herhaalde vries-dooi resulteren in steekproef degradatie.

7. Liquid Chromatography Voorwaarden

1. Gebruik van een C-18 2,1 mm x 50 mm (1,8 urn) analytische kolom met een C-18 2,1 mm x 12,5 mm (5 urn) guard kolom hydrofobe fractie te analyseren.
2. Stel de autosampler temperatuur 4   ° C, de kolomtemperatuur op 60   ° C, het injectievolume 2 pl en de stroomsnelheid 0,25 ml / min.
3. Gebruik 0,1% mierenzuur in water voor mobiele fase A en 0,1% mierenzuur in isopropanol: acetonitril: water (60:36:4) voor mobiele fase B.
4. Voer de volgende gradiëntelutie profiel: Start eent 30% B en stijging tot 70% B van 0 tot 1 min, dan stijgen tot 100% B tussen 1 en 15 min en gedurende 5 min, gevolgd door 5 min 10% B was en 5 minuten na run.
5. Gebruik een HILIC 2,1 mm x 50 mm (2,6 urn) analytische kolom met een guard kolom hydrofiele fractie te analyseren.
6. Stel de autosampler temperatuur 4   ° C, de kolomtemperatuur op 20   ° C, het injectievolume 2 pl en de stroomsnelheid 0,5 ml / min.
7. Gebruik 50% acetonitril in 10 mM ammoniumacetaat, pH 5,8 voor mobiele fase A en 90% acetonitril in 10 mM ammoniumacetaat pH 5,8 voor mobiele fase B.
8. Voer de volgende gradiënt elutieprofiel: Ga naar 100% B van 0 tot 2 minuten, vervolgens afnemen tot 50% B 2 tot 15 min, gevolgd door 5 min 0% B wassen en 10 min na run.

Resultaten

De gehele monsterbereidingstechniek werd uitgevoerd zoals hierboven beschreven en de belangrijkste en / of relevante aspecten worden hieronder weergegeven. Hydrofiele en hydrofobe interne standaarden werden spiked in gepoold plasma monsters om directe vergelijkingen van de interne normen en endogene metaboliet abundanties behulp van verschillende extractie methoden uit te voeren. Vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) gegevens werden geanalyseerd via een kwantitatieve software en resulteerde in uitstekende opbrengst en scheidingsfactor van zowel de endogene verbindingen en interne standaarden. Figuur 1 toont de effectiviteit van de MTBE-SPE werkwijze extraheren zowel lipide normen (A) en endogene verbindingen (B).

Kortom, een betere extractie en dekking van de metabolieten werden verkregen vergeleken met andere methoden, zoals methanol extractie of "MTBE alleen" opvraging wanneer het aantal of functies werd vergeleken met behulp van kwalitatieve en kwantitatieve software volgende LC-MS analyse. Bijvoorbeeld, met alleen methanol extractie, de variatie van creatinine-D ₃ was 15.2%. Echter, met MTBE LLE Dit werd verlaagd tot 1,04% CV. Met MTBE, de reproduceerbaarheid van lipiden en waterige samenstellingen waren <8% en <5% respectievelijk in vergelijking met een eenvoudiger methanolextractie waardoor grotere variatie van 29% en 15% respectievelijk voor lipiden en waterige samenstellingen. De interne standaarden gebruikt om lipide terugvorderingen monitoren - testosteron-D _2, C17 ceramide, 15:00 PC en 17:00 PE steeg met 26%, 200%, 100%, 400% respectievelijk vergelijking met het gebruik van methanol alleen. Vergelijkbare stijgingen werden waargenomen voor vetzuur interne normen en phosphotidylcholine en phosphotidylethanolamine endogene metabolieten. Andere endogene metabolieten zoals sphingosines, ceramiden, diacylglycerolen, triacylglycerolen, cholesterol en sfingomyeline werden niet wordt ontdektgebruik van methanol of werden ontdekt op een minimaal niveau. Maar deze endogene lipiden werden gemakkelijk gedetecteerd met MTBE extractie.

In onze analyse standaardprotocollen vergelijken, werden de volgende resultaten verkregen: Methanol precipitatie alleen resulteerde in 1851 metabolieten, methanol-ethanol precipitatie gaf 2,073 metabolieten, MTBE met vloeistof-vloeistof extractie gaf 3.125 en MTBE met vloeistof-vloeistof en vaste fase extractie gewonnen 3806 metabolieten. Geven derhalve leidt tot een groter aantal metabolieten worden gewonnen, waarschijnlijk door verminderde ion onderdrukking en schonere monsters voor LC-MS.

Figuur 2 toont de efficiëntie in het scheiden van de hydrofobe metabolieten in hun respectievelijke klassen kan voor meer vertrouwen metaboliet identificatie. Er is minimale overlapping van de verbindingen die in de drie lipide fracties na SPE. Ter ondersteuning, Figuur 3 toonthet herstel van de interne standaarden tonen dat ISTD werden geëlueerd in de fractie met betrekking tot hun chemische familie.

Kwaliteitscontrole monsters worden gebruikt om de kwaliteit van de monstervoorbereiding evalueren elke batch effecten bepalen wanneer meerdere dagen analyse nodig zijn voor een groot sample set, en instrument reproduceerbaarheid te controleren. Chromatogrammen worden onderzocht om te voorkomen dat spiked-in normen zijn meer dan 90% hersteld met massale fout van minder dan ± 3 ppm en retentietijdvenster van minder dan ± 5%. Als deze criteria niet wordt voldaan, worden de resultaten verwijderd en de monsters worden opnieuw geanalyseerd. In het geval van batch effecten waarbij een verschuiving in retentie wordt waargenomen voor een partij, kan de gegevensanalyse software corrigeren voor. Een eerder bereide charge van gepoold plasma monsters onderging monstervoorbereiding. De fracties werden vervolgens in hoeveelheden verdeeld in sub-autosampler flesjes en opgeslagen bij -80 ° C voor gebruik in toezichtinstrument voorwaardenties tijdens elke monsteranalyse. Tabel 1 toont de resultaten van deze aar-de normen. De vetzuur negatieve ionisatiemodus fractie (gegevens niet in tabel) werd niet gebruikt voor analyse omdat het% CV van de steker in de normen voor QC monster groter dan 10% was. De dataset die fractie werd dan verwijderd en het instrument gecontroleerd en onderhouden. Tabel 2 toont de resultaten van endogene metabolieten in de monsters na drie dagen van monstervoorbereiding en drievoud instrument injecties. De endogene metabolieten in de monsterbereiding QC monsters reproduceerbaar, betekent de sterkte van de monsterbereiding en het instrument injectie reproduceerbaarheid.

Wanneer monstervoorbewerking niet correct worden opgevolgd echter onbetrouwbaar en inconsistente resultaten worden verkregen. Figuur 4 toont de resultaten wanneer de proteïne neerslaan van de werkwijzeniet wordt gevolgd zoals beschreven. Drie operatoren, A, B, en C uitgevoerd dezelfde monstervoorbereiding procedure op samengevoegde plasma monsters. Operator A plaats pipetteren de benodigde hoeveelheid supernatant per experimentele protocol plaats gepipetteerd> 1 ml voor zowel wassen met enkele pellet. Dit niet alleen tot een hoger aantal valse positieven voor dat gedeelte, maar verhoogde de variabiliteit van de gegevens.

De chromatografische reproduceerbaarheid van de gegevens is te zien in figuur 7. Gepoold plasma monsters werden in drievoud bereid op verschillende dagen met eiwit precipitatie, vloeistof-vloeistof extractie en vaste-fase-extractie zoals beschreven in dit protocol. Elke fractie werd geanalyseerd met behulp van de chromatografische scheiding in hoofdstuk 7 van het protocol beschreven. Monsters werden vervolgens geïnjecteerd in drievoud op de LC-MS naar instrument en monstervoorbereiding reproduceerbaarheid te evalueren. Deze consistente overlap toont zowel de strenge van de reproduceerbaarheid van de monstervoorbereiding bereide op drie verschillende dagen, en de sterkte van de chromatografische werkwijze produceren reproduceerbare resultaten. Een toename van chemische ruis waargenomen voor de negatieve ionisatiemodus van de vetzuurfractie. Dit kan optreden als gevolg van verontreinigingen in de LC-MS oplosmiddelen en kan leiden tot inconsistente metabolomic kwantitatieve resultaten. Daarom alleen metabolieten geëlueerd vóór 9 min. geanalyseerd.

Bij het uitvoeren van lange werklijsten, kan een verlies van instrument gevoeligheid en verandering in bufferconcentraties na verloop van tijd resulteert in verminderde signaalintensiteit en retentietijd shift. Als de retentietijd overlap verschil van minder dan 5% en de signaalintensiteit variatie is minder dan 10%, de gegevens nog in standaard laboratorium grenzen. Analyse software kan worden gebruikt om de gegevens te normaliseren richten en te corrigeren voor instrument retentietijd drift. Indien de variatie large, dan is de reden moet worden bepaald. Zodra dit is opgelost, de monsters kunnen opnieuw worden geanalyseerd.

Figuur 1. De overvloed aan lipide istDS (A) en endogene metabolieten (B) na extractie en omgekeerde fase chromatografie (RPC) ^12. Extractie werd uitgevoerd en de resulterende monsters werden gescheiden met behulp van RPC en met behulp van LC-MS in positieve en negatieve ionisatiemodus geanalyseerd. Dit cijfer is gewijzigd van Yang et al., Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013).

Figuur 2. Een vergelijking van MTBE-SPE fracties ^12. De geïdentificeerde metabolieten in elke froptreden vergeleken met de hoeveelheid overlapping te identificeren tijdens de SPE gedeelte van de prep. De getallen in het Venn-diagram geven het aantal metabolieten gedetecteerd in elke fractie. Hier kleine overlap wordt waargenomen tussen de drie fracties, wat neerkomt op een succesvolle verbinding extractie en metaboliet klasse scheiding tijdens de SPE stap. Dit cijfer is gewijzigd van Yang et al., Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013).

Figuur 3. Het herstel van istDS in fracties met behulp van de MTBE-SPE-methode ^12. Extractie werd uitgevoerd en de resulterende monsters werden gescheiden met RPC en gebruiken LCMS positieve en negatieve modus zoals beschreven in de tekst geanalyseerd. Dit cijfer is gewijzigd van Yang et al., Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013).

Figuur 4. Resultaten van de pellet-fractie bereid door drie operatoren. Drie monstervoorbereiding operatoren A, B en C uitgevoerd hetzelfde eiwit bereidingsstap op samengevoegde plasmamonsters. De getallen in het Venn-diagram geven het aantal metabolieten gedetecteerd door elke operator. Operators B en C gepipetteerd het vereiste volume per de monstervoorbereiding protocol terwijl operator A gepipetteerd de gehele supernatant en enkele van de pellet, die in meer dan 500 meer metabolieten, waarvan de meeste valse positieven voor die specifieke fractie.

Figuur 5. Vorming van eiwitpellet tijdens eiwitprecipitatie stap <. / Strong> (A) 100 pl humaan plasma voorafgaand aan bereiding van het monster, (B) plasma na toevoeging van ijskoude methanol, (C) proteïne pellet op de bodem van de buis na centrifugeren bij 0 ° C gedurende 15 min bij 18.000 x g.

Figuur 6. Scheiding van de hydrofiele en hydrofobe lagen in vloeistof-vloeistof extractie (LLE) stap. Het organische oplosmiddel methyl-tert-butylether (MTBE) en water werden gebruikt om de hydrofiele en hydrofobe metabolieten scheiden. De MTBE-laag is niet-polaire verbindingen opgelost en de waterlaag heeft polaire verbindingen opgelost (A) plasma supernatant na proteïneverwijdering;. (B) plasma na drogen onder stikstof, (C) plasma na toevoeging van MTBE; ong> (D) toevoeging van water aan plasma en MTBE, (E) MTBE-waterlaag gevormd na centrifugeren, (F) het verwijderen van bovenste MTBE laag; (G) hoofdzakelijk hydrofiele laag die overblijft na verwijdering MTBE.

Figuur 7. Chromatogrammen van fracties van een geselecteerde gegevensset. Monstervoorbereiding werd uitgevoerd op drie afzonderlijke gepoold plasma QC monsters en elk monster werd geïnjecteerd in drievoud in het LC-MS instrument. Vertegenwoordigd zijn in totaal ion chromatogrammen van de verkregen met behulp van de LC-MS parameters vermeld in artikel 7 van de methode protocol plasma monsters. De chromatografische weergave van andere biologische fluïda variëren door verschillen in metaboliet samenstelling.k "> Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Fractie	Ionisatiemodus	Interne standaard	n	Gemiddelde Peak Area	Peak Area% CV
Waterig	Positief	Creatinine-D 3	31	2217311	3,8%
Neutraal lipide	Positief	Triglyceride-D 5	31	4837032	9,9%
		C17 Ceramide	31	12736707	7,9%
Fosfolipide	Positief	15:00 PC	32	1248929	9.3%
		17:00 PE	32	517234	7,9%

Tabel 1. Kwaliteitscontrole resultaten van spiked interne standaarden. Samengevoegde plasmamonsters van een emfyseem muismodel dataset geanalyseerd voorwaarden instrument dagelijks deze meerdere weken studie volgen. Kwantitatieve analyse software werd gebruikt om de piekoppervlakken van de interne standaarden (n = aantal instrument QC injecties) bepalen.

Fractie	Ionisatiemodus	Endogene metabolieten	Gemiddelde Peak Area	Peak Area% CV
Waterig	Positief	Creatinine	2554574	2,3%
		Valine	3712151	3,3%
		Glucose	2669190	6,9%
Neutraal lipide	Positief	3-Dehydrosphinganine	226644	3,9%
		DG (16:00 / 16:01 / 00:00)	11301	8.2%
		DG (P-14: 0/18: 1)	364119	1,9%
Fosfolipide	Positief	PC (24:0 / 0:0)	27.599	0.9%
		PC16: 0/22: 6)	2873326	4,5%
		PI (16:00 / 18:01)	112998	4,4%
Vetzuur	Positief	10-oxo-5 ,8-decadienoic zuur	1363284	2,3%
		16-oxo-heptadecaanzuur	83700	2,9%
		2-methyl-valeriaanzuur	285782	5,7%
Vetzuur	Negatief	10-hydroxy-8-octadeceenzuur	10.042	4,9%
		(R)-laballenic acid	173929	6,5%
		2-keto valeriaanzuur	35488	6.0%

Tabel 2. Kwaliteitscontrole resultaten van endogene metabolieten. Gepoold plasma monsters van een menselijke ziekte dataset werden geanalyseerd om te controleren monstervoorbereiding reproduceerbaarheid op verschillende dagen. Monsters werden bereid in drievoud over drie dagen, (n = 9 prep QC injecties).

Discussie

Een doel van klinische metabolietvorming is aan veranderingen in de metabolome gerelateerde ziekte of behandelingen te identificeren. Daarom staalvoorbereidingstechnieken nodig robuust, consistent en overdraagbaar van technicus tot technicus en van laboratorium naar het laboratorium te zijn ^22. De resulterende gegevens moet voor de steekproef representatief zijn, en geïdentificeerd veranderingen moeten het stellen in plaats van monstervoorbereiding fouten steekproef weerspiegelen. Daarom nauwkeurig pipetteren, juiste temperatuur, efficiënte afgevuld mengbare lagen, drogen onder stikstof, en het gebruik van dezelfde merken en groottes van glaswerk en tips zijn nodig.

Tijdens het eiwit precipitatiestap, is het cruciaal dat dezelfde hoeveelheid oplossing gedecanteerd van elke pellet. Dit vermindert de variatie in volume en als zodanig vermindert variatie in de steekproef van gegevens. Dit eiwit precipitatie stap is noodzakelijk om metabolietvorming en kan niet worden overgeslagen omdat dit het eiwit vande monsters voorafgaande aan kleine moleculen bepalingsanalyse de massaspectrometer. Het elimineert ziekteverwekkers en grote macromoleculen en releases gebonden metabolieten van eiwitten ^7. Gebrek aan eiwitaccumulatie in de monsters breidt de HPLC-kolom levensduur en verhoogt de nauwkeurigheid en kwaliteit van de resultaten. Figuur 5 is een afbeelding van het eiwit pellet bij het ​​uitvoeren van deze techniek op plasmamonsters. Dit maakt de detectie van kleine moleculen, verbetert ion overvloed, en vermindert matrixeffecten van proteïnen in het monster. Bovendien, aangezien wordt aangenomen dat alle eiwitten verwijderd in deze stap, de aminozuren die in LC-MS analyse gedetecteerd zou afkomstig metabole veranderingen in plaats van eiwitafbraak.

De vloeistof-vloeistof extractiestap is essentieel omdat het scheidt de hydrofiele en hydrofobe metabolieten in twee mengbare lagen. Figuur 6 toont de LLE procedure en een representatie van de LLE laag. Een onjuiste scheiding van de twee lagen resulteert in metabolieten verloren of worden geëlueerd in twee fracties. Zorgvuldige toepassing van deze stap vermindert het aantal hydrofiele verbindingen die in de hydrofobe fractie weergegeven. De resultaten voor deze verbindingen onbetrouwbaar aangezien niet kan worden bepaald welke fractie de representatieve resultaten bevat. Wanneer correct gedaan, wordt metaboliet overlap gereduceerd.

Om oxidatieve afbraak te voorkomen, vooral lipiden maar ook kleine moleculen die thiolgroepen bijvoorbeeld kan bevatten, blootstelling aan zuurstof tot een minimum te worden beperkt. Daarom wordt deze procedure steeds onder stikstof uitgevoerd te verminderen / oxidatie van lipiden of thiol bevattende verbindingen voorkomen. Bovendien overdracht van monster en / of de oplossing snel (binnen een minuut) om zuurstofblootstellingslimieten verminderen, dan monsters snel onder een constante stikstofstroom geplaatst drogen beneden. Eenmaal gedroogd, ze zijn onmiddellijkdellijk geresuspendeerd in 100% methanol gedurende de hierboven besproken redenen.

Laboratoria kunnen profiteren van deze uitgebreide methode in een aantal manieren; Onderzoekers op zoek naar een klasse van verbindingen te isoleren kan het deel van de methode die het best past bij hun behoeften te kiezen. Diegenen die slechts een eiwit neerslag uit te voeren om een ​​pool van metabolieten te verkrijgen kan doen. Als hydrofiele metabolieten gewenst, zoals vele geneesmiddelen, aminozuren en suikers, of indien slechts hydrofobe metabolieten gewenst, zoals triglyceriden, epoxiden, vetoplosbare vitamines en fosfolipiden bijvoorbeeld, dan onderzoekers de vloeistof-vloeistof extractie uitgevoerd stap na eiwit neerslag en de ongewenste fractie weggooien. Onderzoekers die verdere verdichting van de hydrofobe verbindingen (neutrale lipiden, vetzuren en fosfolipiden) nodig kan overgaan tot de fractionering stap.

Opslag overwegingen zijn belangrijk in maintaining de levensvatbaarheid van de monsters voor latere analyse. Als monsters verkeerd zijn opgeslagen, kunnen afbraak of ontleding optreden. Idealiter moeten de monsters worden opgeslagen in schroefdop amberkleurige flesjes uit de buurt van licht tot afbraak van lichtgevoelige soorten te voorkomen. Monsters ook bevroren worden bewaard bij -80 ° C tot ^23-25 ​​metaboliet degradatie voorkomen. Hoewel hier niet uitvoerig besproken worden monsters altijd bij 4 ° C bewaard in de autosampler lade tijdens LC-MS analyse. Dit zorgt ervoor dat alle monsters bewaard bij een constante temperatuur en veranderingen in de omgevingstemperatuur geen invloed op de viscositeit, oplosbaarheid of stabiliteit van de monsters. Het wordt aanbevolen dat de handmatige aspecten van deze procedure, zoals LLE en SPE, worden beoefend om het vertrouwen en comfort met de stappen die te krijgen.

Een paar beperkingen bestaan ​​voor deze techniek. Discrete scheiding van de hydrofobe en hydrofiele metabolieten is niet gegarandeerd als bepaalde verbindingen zal inherentently verdelen in twee fracties door hun chemische samenstelling en laadtoestand. Bovendien zoals getoond in figuur 4, onjuiste techniek tijdens de eiwitpellet extractiestap kan slechte reproduceerbaarheid metaboliet in zowel de monsters en kwaliteitscontrole. Dit beïnvloedt de statistieken, met name in kleine datasets, omdat de statistische power is niet beschikbaar. Daarom is het cruciaal dat deze stap exact hetzelfde elke keer voor elk monster worden uitgevoerd. Een andere beperking is de tijd. Hoewel er stop punten in dit protocol waar de monsters kunnen worden ingevroren en de prep ging de volgende dag, moet een hele dag worden gereserveerd om deze procedure uit te voeren. Ten derde niet elke verbinding in een biologisch monster kan worden geëvalueerd ion onderdrukking. Aangezien het niet mogelijk te bepalen hoe de matrix beïnvloedt elk individu metaboliet, de huidige optie is om de interne standaarden die theoretisch nabootsen sommige klassen endogenou evaluerens metabolieten. Tenslotte absolute identificaties niet alleen uitgevoerd met deze methode. Tandem MS in samenwerking met de database van zoekopdrachten en normen zijn nodig voor absolute metaboliet identificatie.

Een belangrijk onderdeel van metabolomics is de identificatie van verbindingen. Hoewel hier niet in detail besproken, werden kwaliteitscontrole monsters geanalyseerd met behulp van LC-MS. Meerdere monstervoorbereiding blanks en instrument blanks werden voorbereid voor gebruik als achtergrond aftrekken tot het aantal valse positieven te verminderen van verontreinigingen, wat leidt tot betrouwbaarder metaboliet hits. Na deze stap, werden het aantal "moleculaire kenmerken" gegroepeerd op basis van m / z, retentietijd en isotopenverhouding, en adducten van een lijst van feitelijke compounds. Hoewel de lijst van verbindingen uiterst beperkt was, waren de resultaten betrouwbaarder aangezien zij geen basis van meerdere adducten van dezelfde verbinding. De volledige methode is uitgebreid en laat Isolation hydrofobe metabolieten zoals neutrale lipiden, fosfolipiden, vetzuren, triglyceriden en steroïden en tegelijkertijd isoleren hydrofiele klassen in de waterige fractie, waarvan eicosanoïden, suikers, flavonoïden en aminozuren geïdentificeerd ^{12, 26.}

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Acetonitrile	Fisher Scientific	A955-4
Methanol	Fisher Scientific	L-6815
Chloroform	Fisher Scientific	C606-1
Hexane	Sigma Aldrich	34859
Azijnzuur	Sigma Aldrich	49199-50ML-F
Methyl tert-butyl ether	J.T. Baker	9042-03
Isopropyl alcohol	Sigma Aldrich	34965-2.5L
Water	Honeywell Burdick Jackson	365-4
OA-SYS verwarmingssysteem	Organomation Associates, Inc		Wordt gebruikt om monsters onder een constante stroom stikstof te houden bij 35 °C
12-positie vacuüm manifold	Phenomenex
Strata NH2 (55 µM, 70Å) 100 mg/ml SPE cartridges	Phenomenex	8B-S009-EAK
Glazen pipetpunten	Fisher Scientific	13-678-20C	Wordt gebruikt om monsters over te brengen naar SPE-kolom
Kunststof pipetpunten	USA Scientific	1182-1830	Wordt gebruikt wanneer glazen punten niet nodig zijn
Microcentrifugebuisjes	Fisher Scientific	02-681-320
Gegradueerde glazen pipetten	Fisher Scientific	13-678-27B	Wordt gebruikt om organische oplosmiddelen over te brengen tijdens monstervoorbereiding
Pyrex glazen kweekbuisjes	Corning Incorporated	99499-16X	Wordt gebruikt om waterige en lipidefracties op te slaan tot de volgende stap
Autosampler-violen	Agilent Technologies	5182-0545
Snap-dopviolen voor autosampler-violen	Agilent Technologies	5182-0541
Glazen inzetstukken	Agilent Technologies	5183-2085	Wordt gebruikt voor kleine monstervolumes
Mass Hunter Qualitative Analysis software	Agilent Technologies	Version B.06.00	Wordt gebruikt om retentietijden en drukcurves te monitoren
Mass Hunter Quantitative Analysis software	Agilent Technologies	Version B.05.02	Wordt gebruikt om kwaliteitscontrole en monstergegevens te analyseren
Mass Profiler Professional software	Agilent Technologies	Version B.12.50	Wordt gebruikt om statistieken, veranderingen en metabolietidentificatie te bepalen