Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In Situ Detectie van autoreactieve CD4 T-cellen in de hersenen en het hart met behulp van Hoofdhistocompatibiliteitscomplex Klasse II Dextramers

10.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51679

⸱

1 augustus 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, University of Nebraska, Lincoln, 2Center for Biotechnology, University of Nebraska, Lincoln, 3Nebraska Center for Virology and School of Biological Sciences, University of Nebraska, Lincoln

In dit artikel

Samenvatting

Is beschreven het protocol tot zelf-reactieve CD4 T-cellen te detecteren in de hersenen en het hart door directe kleuring met hoofdhistocompatibiliteitscomplex klasse II dextramers in dit rapport. Voor uitgebreide analyse is een betrouwbare methode om de frequentie van antigeen-specifieke CD4 + T-cellen in situ sommen ook ontwikkeld.

Samenvatting

Dit rapport toont het gebruik van major histocompatibiliteitscomplex (MHC) klasse II dextramers voor de detectie van autoreactieve CD4 T-cellen in situ bij myeline-proteolipide-eiwit (PLP) 139-151-geïnduceerde experimentele auto-immuunencefalomyelitis (EAE) bij SJL-muizen en hartmyosine-zwaar-ketting-α (Myhc) 334-352-geïnduceerde experimentele auto-immuunmyocarditis (EAM) bij A/J-muizen. Er werden twee sets cocktails van dextramerreagentia gebruikt, waarbij dextramers+ cellen werden geanalyseerd door middel van een laserscanningconfocale microscoop (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specifiek)/anti-CD4 en IAs/Theiler’s muisencefalitisvirus (TMEV) 70-86 dextramers (controle)/anti-CD4; en EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 en IAk/runde ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (controle)/anti-CD4. LSCM-analyse van hersensecties verkregen van EAE-muizen toonde de aanwezigheid van cellen die positief waren voor CD4 en PLP 139-151 dextramers, maar niet voor TMEV 70-86 dextramers, wat suggereert dat de kleuring verkregen met PLP 139-151 dextramers specifiek was. Evenzo toonden hartsecties bereid uit EAM-muizen ook de aanwezigheid van Myhc 334-352, maar niet van RNase 43-56-dextramer+ cellen, zoals verwacht. Verder is er ook een uitgebreide methode ontwikkeld om de frequenties van antigeenspecifieke CD4 T-cellen in de ‘Z’ seriële beelden kwantitatief te analyseren.

Inleiding

Gebruik van major histocompatibility complex (MHC) klasse II tetrameren voor de detectie van antigeen-specifieke CD4 T-cellen is een uitdaging geweest 1-7. Om de gevoeligheid van MHC klasse II tetrameren verbeteren, heeft het onderzoeksteam gecreëerd volgende generatie tetrameren, aangeduid "dextramers" 8. Dextramers bevatten dextran ruggengraten waarbij meerdere streptavidine-fluorofoor resten geconjugeerd, zodanig dat verschillende peptide-gebonden, gebiotinyleerde MHC monomeren kan worden bevestigd aan een dextran-molecuul 9. Zo kunnen grote aggregaten van MHC dextramers dat verschillende MHC-peptidecomplexen bevatten interageren met meerdere T-celreceptoren (TCR).

Deze groep recent bekomen dextramers voor diverse zelf-antigenen en aangetoond dat de detectiegevoeligheid van dextramers ongeveer vijf keer meer dan tetrameren 8. De experimentele systemen zijn experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) geïnduceerd met proteolipid eiwit (PLP) 139-151 in SJL muizen; EAE geïnduceerd met myeline oligodendrocyt glycoproteïne (MOG) 35-55 in C57BL / 6 muizen; en experimentele auto-immune myocarditis (EAM) geïnduceerd met cardiale myosine zware keten-α (Myhc) 334-352 in A / J muizen. Deze studie demonstreert het gebruik van PLP 139-151 - en Myhc 334-352 dextramers antigeen-specifieke CD4 T-cellen te detecteren in situ met specificiteit Door een directe kleuring protocol, waardoor de noodzaak om de signalen te versterken gebruiken fluorofoor antilichamen, een benaderen gewoonlijk toegepast met behulp van tetrameren. Daarnaast is een uitgebreide methode evalueren weefsels ook bedacht betrouwbaar sommen de frequentie van antigeen-specifieke CD4 T-cellen in situ 10. Detectie van antigeen-specifieke T-cellen in situ maakt afbakening van gebeurtenissen veroorzaakt door specifieke antigene stimuli van die veroorzaakt door omstanders activatie. Ook de in situ techniek ook provides mogelijkheden om de kinetiek van antigeen-specifieke T cel infiltratie in de doelorganen volgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Ethiek Verklaring:

Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor de zorg en het gebruik van proefdieren en door de Universiteit van Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE goedgekeurd.

1. Inductie van EAE

  1. EAE induceren bereiden peptide / compleet Freund's adjuvans (CFA) emulsie zoals beschreven in 11 de volgende wijzigingen: Stap 1.1:. Bereiden PLP 139-151 bij een concentratie van 1 mg / ml in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) Stap 1.4. gebruik 200 ul CFA emulsie die 100 ug PLP 139-151 per dier Stap 1.4.1: tien immunisatie van dieren bereiden 2 ml emulsie door het mengen van 1 ml PLP 139-151 (1 mg / ml in 1x . PBS) en een gelijk volume CFA Stap 1.5: injecteer 200 ul emulsie in gesplitste doses subcutaan in beide liezen (~ 75 pi elk) en borstbeen (~ 50 pi) van vijf tot zes weken oude female SJL / J muizen. Stappen 1.7 en 1.8 zijn niet van toepassing voor de inductie van EAE.

2. Klinische Scoring van EAE Muizen en oogsten van Cerebrums

  1. Bewaken van de dieren voor het uiterlijk van de klinische symptomen, en de score van de ziekte-ernst dagelijks vanaf dag 9 immunisatie als volgt: 0 - gezond; 1 - slappe staart of zwakte van de achterpoten, maar niet beide; 2 - slappe staart en zwakte van de achterpoten; 3 - gedeeltelijke verlamming van de achterpoten; 4 - volledige verlamming van de achterpoten; 5 - stervend of dood 12.
  2. Euthanaseren de muizen wanneer ze een neurologische score van 3 of 4 met behulp van CO 2 te bereiken. Om de muizen euthanaseren, eerste pre-vul de euthanasie kamer met CO 2 door de regulator van de CO 2-tank niet meer dan 6 psi en toestaan ​​dat dieren blijven binnen de kamer voor ongeveer 5 minuten om volledige verstikking bereiken. Week de geëuthanaseerd dieren in 70% alcohol. Onmiddellijk plaats de dieren op een absorberend kussen en met een paar sterieleekhoorntjesbrood en schaar het hart bloot te leggen door het doorsnijden van de borstholte. Prik de juiste oorschelpen en perfuse door het injecteren van 10 ml koud PBS 1x in de linker ventrikel van het hart.
  3. Graven de schedel door te knippen de schedel in een circulaire manier met behulp van een paar gebogen schaar, en zorgvuldig, flip de schedelbeenderen met een tang. Oogst de hersenen door stompe dissectie en met een schone scalpel, een aparte grote hersenen van de kleine hersenen. Plaats de grote hersenen in een buis met koude 1x PBS en laat de buis op ijs tot verwerking.

3. In Situ kleuring van Cerebral Secties met MHC klasse II (IA s) / PLP 139-151 Dextramers

  1. Bereid 4% PBS gebufferde laagsmeltende agarose, smelten door verhitten bij 50 ° C en laat het in een 40 ° C waterbad tot gebruik.
  2. Plaats de grote hersenen in een wegwerp diepe basis schimmel histologie cassette gehouden over ijs, en giet gesmolten (40 ° C) agarose. Onmiddellijk, druk op de hersenen zachtjesmet een tang om het weefsel onder te dompelen. Laat de cassette op ijs gedurende 15-20 minuten totdat het stollen is voltooid.
  3. Vul het vibratome bad met gekoelde 1x PBS. Vul de ruimte rond vibratome bad met ijsblokjes de temperatuur PBS tussen 0 en 2 handhaven ° C. Fix een schoon scheermesje in de vibratome en zet het mes hoek tot 15 °.
  4. Plaatsing van weefsel in vibratome. Knip overtollige agarose van alle wanden van de ingebedde weefsel en het ventrale oppervlak van de hersenen enigszins bloot.
    1. Smeer vibratome weefsel blok met super lijm en breng de agarose-ingebed weefsel over de verlijmde oppervlak door het plaatsen van de blootgestelde ventrale oppervlak van de hersenen over de lijm voor dwarse snijden. Verplaats het weefsel, zodra het weefsel is verdeeld over het blok.
    2. Plaats de vibratome blok met de agarose-ingebed weefsel op ijs, en laat de lijm drogen gedurende 15 minuten.
  5. In de tussentijd zet de weefsel chamBers een per putje van een 24-wells plaat. Vul de putjes die de weefselkamers met 1 ml koud 1x PBS, en laat de plaat op het ijs.
    1. Bereid de weefselkamers door het aanbrengen van een dunne nylon mesh aan de cut-uiteinde van een 25 ml polypropyleen pipet met behulp van superlijm; na het knippen van de overtollige gaas rond de pipet, snijd de pipet tot een lengte van 1 cm van het gaas.
  6. Laat de vibratome blad om het niveau van het bovenvlak van het weefsel; stel de vibratome snelheid tot 0,22 mm / sec en beginnen snijden met een voorwaartse beweging tot 200 micrometer dikke secties maken. Transfer een cerebrale sectie per putje met een aquarel zachte borstel in het weefsel kamers geplaatst in de putjes van een 24-wells plaat. Houd de plaat op ijs tot snijden voltooid is om weefsel degradatie te voorkomen. Opmerking: Volg deze stappen om te krijgen in totaal drie gekoppelde secties van drie verschillende gebieden van de hersenen dorsale om het ventrale oppervlak (figuur 2). Een deel vanelk paar (in totaal drie delen) die in drie afzonderlijke weefselkamers bestemd zijn voor kleuring met specifieke dextramers (IA s / PLP 139-151) en anti-CD4. Evenzo tweede reeks van drie secties die in drie afzonderlijke weefselkamers geplaatst zijn bestemd voor kleuring met controle dextramers (IA s / TMEV 70-86) en anti-CD4.
  7. Breng de drie weefselkamers met de voor kleuren met specifieke dextramers in drie putten in een 24-wells plaat met een kamer per putje in gedeelten die, 300 ui van een cocktail met allofycocyanine (APC)-geconjugeerde PLP 139-151 dextramers (2,5 ug / ml) en anti-CD4-fycoerythrine (PE, 5 ug / ml) in blokkerende oplossing (1x PBS met 2% normaal geit serum) werd eerder toegevoegd. Bedek de putjes met een deksel.
  8. Evenzo, de overdracht van de drie weefselkamers met de voor kleuring met controle dextramers in drie putten in een 24-wells plaat met een kamer per we sectiesll waarin 300 pl van een cocktail met APC-geconjugeerd TMEV 70-86 dextramers (2,5 ug / ml) en anti-CD4-PE (5 ug / ml) in blokkerende oplossing werd eerder toegevoegd. Bedek de putjes met een deksel. Opmerking: Raadpleeg Massilamany et al., 8 voor de bereiding van dextramers, en de dextran moleculen te bereiden dextramers werden vriendelijk verschaft door Immudex, Kopenhagen, Denemarken..
  9. Etiket van de putten, en wikkel de plaat met aluminiumfolie en plaats de plaat op een schommelende platform ingesteld op zachte rotaties gedurende 1,5 uur in het donker bij kamertemperatuur.
  10. Na de incubatieperiode was weefselcoupes op de schommelende platform in door de weefselkamers een nieuw putje met 1 ml koude 1x PBS en vermijd druppelen de inhoud van een putje in de andere. Herhaal het wassen driemaal, waardoor ten minste 10 minuten per wasbeurt. Zorg ervoor dat de coupes niet krijgen gedroogd als ze kunnen kleven aan de wanden van de kamer.
  11. Bevestig de secties door overmaking van het weefsel chammers in een nieuwe put in 24-wells plaat met 1 ml gefiltreerd PBS 4% gebufferde paraformaldehyde (pH 7,4) op een schommelende platform gedurende 2 uur onder zacht rotaties.
  12. Herhaal driemaal wassen zoals beschreven in stap 3.10.
  13. Plaats de gekleurde en vaste rubrieken op een schoon microscopisch preparaat met behulp van een aquarel zachte borstel. Veeg het overtollige water zonder de sectie aan te raken, en monteer het onderdeel met behulp van montage medium. Dek af met een microscopische dekglaasje en laat de dia drogen bij kamertemperatuur O / N in de donkere kamer.
  14. Bewaar de dia's in een lichtdichte dia opbergbox bij 4 ° C.

4. Inductie van EAM en verzamelen van Harten

  1. Laten EAM zoals beschreven in referentie 11.
  2. Euthanaseren de muizen op dag 21 immunisatie met behulp van schone kamer voorzien van CO 2 gasfles, en genieten van de dieren in 70% alcohol. Onmiddellijk plaats de dieren op een absorberend kussen en met behulp van een tang en schaar het hart bloots door snijden door de borstholte. Prik de juiste oorschelpen en perfuse door het injecteren van 10 ml koud PBS 1x in de linker ventrikel van het hart. Verzamel de hartjes en plaats in tubes met koude 1x PBS.

5. In Situ kleuring van Hart Secties met MHC klasse II (IA k) / Myhc 334-352 Dextramers

  1. Bereid 4% PBS gebufferde laagsmeltende agarose, smelten door verhitten bij 50 ° C en laat deze 40   ° C waterbad tot gebruik.
  2. Plaats het hart in een eenmalig diepe basisvorm histologie cassette op ijs gehouden en giet gesmolten 40 ° C agarose totdat het weefsel volledig ondergedompeld zoals beschreven in stap 3.2.
  3. Volg stap 3.3.
  4. Knip overtollige agarose van alle wanden van de ingebedde weefsel en de basis van het hart licht bloot. Smeer vibratome weefsel blok met super lijm en breng de agarose-ingebed weefsel over de verlijmde oppervlak door het plaatsen van het zichtbare oppervlak van dehart over de lijm. Verplaats het weefsel, zodra het weefsel is verdeeld over het blok.
    1. Plaats de vibratome blok met de agarose-ingebed weefsel op ijs, en laat de lijm drogen gedurende 15 minuten.
  5. Volg de stappen 3.5 en 3.6.
  6. Breng het hart delen met een aquarel zachte borstel in het weefsel kamers geplaatst in de putjes van een 24-wells plaat. Houd de plaat op ijs tot snijden voltooid is om afbraak van weefsel te voorkomen. Opmerking: Volg deze stappen om te verkrijgen in totaal acht gepaarde secties van de top naar de basis van het hart (figuur 2). Plaats alle secties in weefselkamers, toewijzing tot 3 secties per kamer. Een deel van elk paar (in totaal acht secties) is bestemd voor kleuren met specifieke dextramers (IA k / Myhc 334-352) en anti-CD4. Ook wordt een andere reeks van acht secties aangewezen voor kleuring met controle dextramers (IA k / RNase 43-56) en anti-CD4.
  7. Breng dedrie weefselkamers met de voor kleuren met specifieke dextramers in drie putten in een 24-wells plaat met een kamer per putje in gedeelten die, 300 ui van een cocktail met APC-geconjugeerd Myhc 334-352 dextramers (2,5 ug / ml) en anti-CD4-PE (5 ug / ml) in blokkerende oplossing werd eerder toegevoegd. Bedek de putjes met een deksel.
    1. Ook dragen de drie weefselkamers met de voor kleuring met controle dextramers in drie putten in een 24-wells plaat met een kamer per putje sectie waarin, 300 ui van een cocktail met APC-geconjugeerd RNase 43-56 dextramers (2,5 ug / ml) en anti-CD4-PE (5 ug / ml) in blokkerende oplossing werd eerder toegevoegd. Bedek de putjes met een deksel.
  8. Etiket van de putten, en wikkel de plaat met aluminiumfolie en plaats de plaat op een schommelende platform ingesteld op zachte rotaties gedurende 1,5 uur in het donker bij kamertemperatuur.
  9. Volg de stappen, 3,10-3,11
  10. Herhaal het wassen thrijs zoals in stap 3.10.
  11. Plaats de gekleurde en vaste delen (maximaal drie secties / glijbaan) op een schoon microscopisch preparaat met behulp van een aquarel zachte borstel. Veeg het overtollige water zonder het aanraken van de secties, en monteer de delen met behulp van montage medium. Dek af met een microscopische dekglaasje en laat de dia drogen bij kamertemperatuur O / N in de donkere kamer.
  12. Bewaar de dia's in een lichtdichte dia opbergbox op 4 ° C.

6. Analyse van Dextramer + (dext +) CD4 + T-cellen door confocale laser scanning microscoop (LSCM) (voor beide hersenen en het hart secties)

  1. Gebruik Nikon A1-Eclipse 90i confocale microscoop systeem voor routinematige scannen en acquisitie van beelden. Om te starten Klik geopend, de NOS Elements AR-software (versie 4.13).
    1. Kies "TRITC" en "Cy5" kanalen van het paneel. De excitatie / emissie golflengtes respectievelijk voor TRITC en Cy5 kanalen, 561,5 nm / 553-618 nm en 640,7 nm / 663-738 nm standaard verschijnen.
    2. Wijs de pseudocolors "groene" en "rood" voor de TRITC (CD4-PE) en Cy5 (dextramer-APC) kanalen, respectievelijk.
    3. Plaats de te onderzoeken op de microscopische podium glijbaan en handmatig scherp onder 100X vergroting. Stel "HV" naar 110 en offset "0". Klik op "Focus" en stel de "spanning" om de lasers te optimaliseren.
    4. Klik op "Focus"; scan de sectie van boven naar beneden, en zet de 'Z' niveau voor het acquisitie. Klik op "CH-serie" en het verwerven van het beeld sequentieel. Identificeer Dext + CD4 + T-cellen verschijnen als gele gestippelde cellen op basis van co-lokalisatie van signalen gegenereerd uit zowel de rode (dextramers) en groen (CD4) kanalen.
  2. Gebruik Olympus FV500-BX60 confocale microscoop voor eenvoudige kwantitatieve opsomming van dext + CD4 + T-cellen. Om te beginnenklik geopend, de FluoView software (versie 4.3).
    1. Selecteer de kleurstoffen "Cy3" en "Cy5" uit het drop-down menu, en klik op "Apply" om de betreffende lasers te laden. Let op: de excitatie / emissie golflengtes voor Cy3 (543 nm / pseudocolored "groene"; CD4-PE) en Cy5 (633 nm / pseudocolored "rood"; dextramer-APC) kanalen.
    2. Plaats de te onderzoeken in het microscopisch preparaat glijbaan, en stel handmatig scherp het onder lage vergroting (4x of 10x). Klik op "Focus", terwijl de Cy3 laser is op, en de focus van de inflammatoire focus.
    3. Verander de doelstelling om 100X vergroting. Stel de bestandsgrootte tot "512/512" uit het drop-down menu. Klik op "Focus" en de waarden voor "PMT", "Gain" passen en "Offset" parameters om de lasers afzonderlijk te optimaliseren voor Cy3 en Cy5.
    4. Klik op "Z stage" en klik vervolgens op "Focus", terwijl zowel de lasers op. Reeksde dikte van de "Z stage" door de "up" en "down" pijlen te klikken. Stel de "Z" interval 2 urn.
    5. Klik op "Stop", en kies "Seq123". Klik vervolgens op "XYZ" en beginnen te verwerven serie "Z" beelden voor het geselecteerde gebied binnen de inflammatoire focus. Sla de "Z serie beelden 'als AVI-bestanden. Beeldbestanden op te slaan, selecteert u het beeld van de "Z serial imago", en vervolgens opslaan als "tiff"-formaat.
  3. Onderzoeken drie gepaarde delen van de hersenen waar een set van drie delen werd gekleurd met IA s / PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 en de andere set van drie secties met IA s / TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4 te voeren kwantitatieve analyse.
    1. Evenzo, analyseren acht gepaarde secties voor hart, waarin een reeks van acht secties werd gekleurd met IA k / Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 en andere set van acht secties met RNase 43-56 dextramers/anti-CD4.
  4. Onderzoek 10-15 ontstekingsfoci per sectie in grote hersenen, en in elke focus, het verwerven van een reeks van 15 tot 25 seriële beelden achter elkaar.
    1. Onderzoeken van een totaal van 20 ontstekingsfoci uit alle acht onderdelen van het hart en van ieder focus verwerven 10-15 seriële beelden achter elkaar. Neem de 'Z' seriële beelden door het scannen van de dia's in een 'horizontaal-verticaal up-horizontaal-verticaal neergaand' beweging, zodat herhaling van de serie 'Z' binnen dezelfde scherpstelling wordt vermeden.
    2. Once 'Z' seriële beelden worden opgenomen, de naam van de bestanden door het identificeren van de glijbaan, de naam van de secties, en het aantal van de 'Z' seriële beelden genomen.
      1. Gebruik 'ImageJ' software dext + CD4 + T-cellen te tellen in verhouding tot het totale aantal CD4 + T-cellen. Selecteer het 'type teller' in 'ImageJ, check &# 8216; toon alle 'en beginnen te tellen door te klikken op het midden van elke cel en blijven tellen in verschillende' Z 'seriële beelden met behulp van kant pijlen. Na het tellen van alle CD4 T-cellen, kiest u een ander type teller en tel de CD4 + Dext + T-cellen. Open het tabblad resultaat het totale aantal getelde cellen met twee verschillende tellers krijgen.
      2. Om het totale aantal te verkrijgen, voeg het aantal cellen in alle Z-serie beelden die alle drie cerebrale afdelingen of de acht secties hart.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In dit verslag, in situ detectie van antigeen-specifieke autoreactieve CD4 T-cellen door directe kleuring met MHC klasse II dextramers beschreven. Vers gesneden cerebrale secties werden afgeleid van EAE muizen en gekleurd met cocktails met PLP 139-151 (specifieke) of TMEV 70-86 (controle) dextramers en anti-CD4. De bovenste panelen in Figuur 1 toont LSCM analyse van cerebrale secties costained met PLP 139-151 dextramers (rood) en CD4-antilichaam (groen), waar de dubbel-positieve cellen bleek ge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Unlike MHC klasse I tetrameren, het gebruik van MHC klasse II tetrameren voor routinetoepassingen blijft uitdagend, vooral voor de voorloper frequenties van lage affiniteit autoreactieve CD4 T-cellen, mede door hun activering afhankelijkheid 6,15-17 sommen. Onlangs werd dit probleem omzeild door het creëren van de volgende generatie van tetrameren, genaamd "dextramers," waardoor wij antigeen-specifieke CD4 T-cellen te detecteren voor een aantal auto-antigenen, zoals PLP 139-151, MOG 35-55 en Myhc 33...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten werden verklaard.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association en de Children's Cardiomyopathie Foundation (SDG2462390204001), en de National Institutes of Health (HL114669). CM is een ontvanger van een postdoctoraal research fellowship subsidie ​​van de Myocarditis Foundation, NJ.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CFASigma Aldrich, St Louis, MO5881Bewaar bij 4 °C
MTB  H37Rv extract Difco Laboratories, Detroit, MI231141Bewaar bij 4 °C
PTList Biologicals Laboratories, Campbell, CA181Bewaar bij 4 °C
1x PBS Corning, Manassas, VA21-040-CVBewaar bij 4 °C
Female A/J mice Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME646
Female SJL/J miceJackson Laboratories, Bar Harbor, ME686
Leur-lok steriele 1 ml spuitBD, Franklin Lakes, NJ309628
Leur-lok steriele 3 ml spuitBD, Franklin Lakes, NJ309657
Steriele naald, 18 GBD, Franklin Lakes, NJ305195
Steriele naald, 27 1/2 GBD, Franklin Lakes, NJ305109
3-weg stopcock Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OHMX5311L
Kerlix gaasverbandrollen Covidien, Mansfield, MA6720
KimwipesKimberly-Clark Professional, Roswell, GA34155
Agarose, Low Melting Point, Analytical GradePromega corporation, Madison, WIV2111
Immunopure normaal geitenserumThermo Scientific, Waltham, MA31873Bewaar bij -20 °C
Anti-muis CD4 geconjugeerd met PE-kleurstofeBioscience, San Diego, CA 12004185Bewaar bij 4 °C
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences, Hatfield, PA19202Bewaar bij 4 °C
Faramount Aqueous Mounting MediumDako, Carpinteria, CA10073021
Conical tube (15 ml)BD Biosciences, San Jose, CA352099
Conical tube (50 ml)BD Biosciences, San Jose, CA352070
24-well vlak bodem weefselkweek platenBD Biosciences, San Jose, CA356775
Waterverf #2 borstelsCharles Leonard, Inc. Hauppauge, NY73502
Eenvoudige Microscoop slides, maat: 3" x 1" x 1.2 mmFisher Scientific, Pittsburgh, PA1255010
Premium Dekglas, 22 x 22-1Fisher Scientific, Pittsburgh, PA12548B
Wegwerp diep basisvorm histologie cassettesLaboratory prodcust, Rochester, NYM-475-10
Loctite Super lijmHenkel Corporation, Westlake, OH1471879
ScheermessenGillette SuperSilver
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK)Neopeptide, Cambridge, MABewaar bij 4 °C
PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF)Neopeptide, Cambridge, MABewaar bij 4 °C
MHC class II/IAs PLP 139-151 of TMEV 70-86 dextramers geconjugeerd met APC-kleurstofBewaar bij 4 °C
MHC class II/IAk Myhc 334-352 of  of RNase 40-56 dextramers geconjugeerd met APC-kleurstofBewaar bij 4 °C
Dextran geconjugeerd SA-APCImmundex, Copenhagen, DemarkBewaar bij 4 °C
Steriele chirurgische scharen en pincettenINOX tool Corporation
Micro ovenGE Healthcare, Pittsuburgh, PA
Leica VT 1200 VibratomeLeica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL
Olympus BX 60  Laser scanning confocal microscopeOlympus America, Inc. Center Valley, PA
Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscopeNikon Inc. Melville, NY

Referenties

  1. Cecconi, V., Moro, M., Del Mare,, Dellabona, S., P,, Casorati, G. Use of MHC class II tetramers to investigate CD4+ T cell responses: problems and solutions. Cytometry A. 73 (11), 1010-1018 (2008).
  2. Ferlin, W., Glaichenhaus, N., Mougneau, E. Present difficulties and future promise of MHC multimers in autoimmune exploration. Curr Opin Immunol. 12, 670-675 (2000).
  3. Kwok, W. W., Ptacek, N. A., Liu, A. W., Buckner, J. H. Use of class II tetramers for identification of CD4+ T cells. J Immunol Methods. 268, 71-81 (2002).
  4. Landais, E., et al. New design of MHC class II tetramers to accommodate fundamental principles of antigen presentation. J Immunol. 183, 7949-7957 (2009).
  5. Nepom, G. T. MHC class II tetramers. J Immunol. 188, 2477-2482 (2012).
  6. Vollers, S. S., Stern, L. J. Class II major histocompatibility complex tetramer staining: progress, problems, and prospects. Immunology. 123, 305-313 (2008).
  7. Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
  8. Massilamany, C., Upadhyaya, B., Gangaplara, A., Kuszynski, C., Reddy, J. Detection of autoreactive CD4 T cells using major histocompatibility complex class II dextramers. BMC Immunol. 12, 1471-2172 (2011).
  9. Batard, P., et al. Dextramers: new generation of fluorescent MHC class I/peptide multimers for visualization of antigen-specific CD8+ T cells. J Immunol Methods. 310 (1-2), 136-148 (2006).
  10. Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS One. 9 (1), (2014).
  11. Massilamany, C., Khalilzad-Sharghi, V., Gangaplara, A., Steffen, D., Othman, S. F., Reddy, J. Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse. J Vis Exp. (88), e51654(2014).
  12. Massilamany, C., Steffen, D., Reddy, J. An epitope from Acanthamoeba castellanii that cross-react with proteolipid protein 139-151-reactive T cells induces autoimmune encephalomyelitis in SJL mice. J Neuroimmunol. 219 (1-2), 17-24 (2010).
  13. Donermeyer, D. L., Beisel, K. W., Allen, P. M., Smith, S. C. Myocarditis-inducing epitope of myosin binds constitutively and stably to I-Ak on antigen-presenting cells in the heart. J Exp Med. 182 (5), 1291-1300 (1995).
  14. Liao, L., Sindhwani, R., Leinwand, L., Diamond, B., Factor, S. Cardiac alpha-myosin heavy chains differ in their induction of myocarditis. Identification of pathogenic epitopes. J Clin Invest. 92 (6), 2877-2882 (1993).
  15. Cameron, T. O., Cochran, J. R., Yassine-Diab, B., Sekaly, R. P., Stern, L. J. Cutting edge: detection of antigen-specific CD4+ T cells by HLA-DR1 oligomers is dependent on the T cell activation state. J Immunol. 166 (2), 741-745 (2001).
  16. Novak, E. J., et al. Activated human epitope-specific T cells identified by class II tetramers reside within a CD4high, proliferating subset. Int Immunol. 13 (6), 799-806 (2001).
  17. Reddy, J., et al. Detection of autoreactive myelin proteolipid protein 139-151-specific T cells by using MHC II (IAs) tetramers. J Immunol. 170 (2), 870-877 (2003).
  18. Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
  19. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
  20. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. Chapter 17, Unit 17.14.11(2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

MHC klasse II dextramerenconfocale microscopieweefseldoorsnijdingexperimentele auto immuunencefalomyelitisexperimentele auto immuunmyocarditisdetectie van antigeenspecifieke T cellenlaser scanning confocale microscopieZ stack beeldanalysekleuring in weefselkamer
In Situ Detectie van autoreactieve CD4 T-cellen in de hersenen en het hart met behulp van Hoofdhistocompatibiliteitscomplex Klasse II Dextramers
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.