En extractie van speeksel DNA voor Next Generation Sequencing

Samenvatting

DNA-extractie uit speeksel kan een gemakkelijk beschikbare bron van DNA met een hoog moleculair gewicht leveren, met weinig tot geen degradatie/fragmentatie. Dit protocol biedt geoptimaliseerde parameters voor speekselverzameling/opslag en DNA-extractie om van voldoende kwaliteit en kwantiteit te zijn voor downstream DNA-tests met hoge kwaliteitseisen.

Samenvatting

De voorkeursbron van DNA in onderzoek naar menselijke genetica is bloed, of cellijnen afgeleid van bloed, aangezien deze bronnen grote hoeveelheden hoogwaardig DNA opleveren. DNA-extractie uit speeksel kan echter hoogwaardig DNA opleveren met weinig tot geen degradatie/fragmentatie dat geschikt is voor een verscheidenheid aan DNA-tests zonder de kosten van een flebotomist en kan zelfs per post worden verkregen. Op dit moment zijn er echter nog geen protocollen voor het verzamelen/extracteren van speeksel-DNA voor next generation sequencing gepresenteerd in de literatuur. Dit protocol optimaliseert de parameters van speekselverzameling/opslag en DNA-extractie om van voldoende kwaliteit en hoeveelheid te zijn voor DNA-tests volgens de hoogste normen, inclusief microarray-genotypering en next generation sequencing.

Inleiding

Verkrijgen van hoge kwaliteit DNA voor menselijke genetische studies is essentieel in de ziektegen ontdekkingsproces. Blood, maar die een invasieve procedure en ook duurder dan speeksel collectie, de voorkeur voor het maken geïmmortaliseerde cellijnen als een onuitputtelijke bron van DNA of iPSCs voor functionele studies en soms bloed DNA wordt gebruikt wanneer cellijnen beschikbaar. Echter, het verkrijgen van bloed vereist een getrainde phlebotomist en bloed heeft een kortere halfwaardetijd dan speeksel ^1. DNA van speeksel is goedkoper en gemakkelijker te verkrijgen, omdat het kan worden opgehaald en verzonden via de mail zonder de noodzaak van een phlebotomist, waardoor de potentiële proefpersoon zwembaden ver buiten het stroomgebied van ziekenhuizen en laboratoria ^2. Studie inschrijving kan worden verbeterd wanneer proefpersonen de mogelijkheid van het geven van een speeksel monster in plaats van bloed ^{3, 4.} Zorgen over de kwantiteit en kwaliteit van het DNA uit speeksel kunnen hebben beperkt het wijdverbreide onse ondanks talrijke studies recente studies die de geschiktheid van speeksel, met een gemiddelde van 4,3 x 10 ⁵ cellen per milliliter, voor het testen van DNA via oudere speekselmonsters methoden waarbij geen significante hoeveelheden speeksel ^{2, 3, 4, 5} hebben ^{verkregen, 6.} Terwijl een bescheiden literatuur bestaat die de geschiktheid van de hele speeksel afgeleide DNA voor genotypering toepassingen, waaronder-microarray gebaseerde methoden ^{8, 9, 10,} geen studies hebben onderzocht next generation sequencing (NGS). Het doel voor het optimaliseren van deze hele speeksel DNA-extractie protocol was om kwantiteit en kwaliteit voor de genetica toepassingen te maximaliseren in een kosteneffectieve manier die gemakkelijk wordt uitgevoerd in laboratoria met gemeenschappelijke reagentia en verbruiksgoederen.

DNA-extractie van speeksel vereist een aantal procedures: 1) het verzamelen en opslaan, 2) cellysis, 3) RNase behandeling, 4) eiwitprecipitatie, 5) ethanolprecipitatie, 6) DNA rehydratatie. De DNA Stabilization Buffer oplossing, beschrevenvoorheen ^2, adequaat functioneert zonder wijziging. Geen poging de RNase behandeling en DNA stappen rehydratatie optimaliseren gemaakt. Voor elke stap die nog overblijft, werden verschillende variabelen die van invloed kunnen de opbrengst geïdentificeerd. Elke variabele werd individueel gemanipuleerd en verbetering van opbrengst en kwaliteit werd statistisch onderzocht. Voor variabelen die werden naar opbrengst en / of DNA te verbeteren, worden de optimale waarden in de definitieve protocol.

Protocol

NB: Voorafgaand aan het verstrekken van speeksel alle proefpersonen gaven informed consent die voldoen aan de richtlijnen voor de behandeling van menselijke proefpersonen bij Nationwide Children's Hospital.

1 Speeksel Collection en opslag

1. Voorafgaand aan speeksel verzamelen, zorgen dat de mond van het onderwerp is vrij van voedsel of andere vreemde stoffen door het hebben van het onderwerp van hun mond te spoelen met water en het vermijden van het eten of drinken gedurende 30 minuten voor het verzamelen van het monster.
2. Open een 15 ml centrifugebuis met 2,5 ml van het DNA stabilisatie buffer ² en zorg ervoor om te voorkomen dat het aanraken van de binnenkant van de dop of buis, en hebben het onderwerp spuwen 2,5 ml speeksel in de bufferoplossing. Opmerking: Het verzamelen van meer dan 2,5 ml speeksel kan leiden tot degradatie van een monster onvoldoende verhouding van monster DNA stabilisatie buffer. Het verzamelen van te weinig speeksel zal verwachte opbrengsten van het protocol te verminderen. Om collectie volumes te evalueren, gebruiken de genummerde hellingen aan de kant van thij tube.
3. Plaats de dop en meng door omkeren tot het mengsel wordt gehomogeniseerd. Krachtig schudden is niet noodzakelijk. Bewaar de monsters bij kamertemperatuur kortstondige opslag of 4 ° C voor langdurige opslag (> 3 maanden).

2 eerste voorbereidingen en cellysis

1. Voorafgaand aan het starten van de winning, warmte een waterbad tot 37 ° C, en voor te bereiden een ijsemmer. Drie 15 ml conische centrifugebuizen nodig zal zijn voor elke gewonnen monster. De drie buizen worden gebruikt om de cel en eiwit pellet, de laatste geëxtraheerde gDNA, en isopropanol en ethanol supernatanten houden.
2. Ophalen monsters uit de opslag, en omkeren monsters meerdere keren vervolgens vortex met gemiddelde snelheid gedurende 15 sec.
3. Verdeel 2,5 ml monster in een schone centrifugebuis van 15 ml en voeg 5 ml Cell Lysis Solution. Meng het monster 50 maal door omkeren en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.

3 RNA verwijderen

1. Voeg 40 gl RNase A Solution bij 100 mg / ml en incuberen bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
2. Verwijder het monster uit het 37 ° C waterbad koel op ijs gedurende 3 minuten.
   1. Na RNase A incubatie, verhoog de temperatuur van het waterbad tot 65 ° C voor het DNA rehydratatie stap van het protocol.

4 Eiwit en Lipid Removal

1. Voeg 50 pl Proteinase K oplossing 20 mg / ml, meng meerdere malen door inversie en incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten. Opmerking: Dit is een mogelijke pauzeren punt voor het protocol. Na de toevoeging van het proteïnase K-oplossing kan het monster bij 4 ° C opgeslagen tot de extractie kan worden voltooid. Opslag bij 4 ° C gedurende maximaal 24 uur werd niet aangetoond dat het een significant effect op de extractie rendement of de DNA-kwaliteit hebben. Langdurige opslag in dit stadium nog niet is geëvalueerd.
2. Voeg 1,7 ml Protein Precipitation Solution, vortex krachtig gedurende 20 seconden bij hoge snelheid en plaats op ijs gedurende 10 minuten.
3. Wanneer de monsters op ijs afgekoeld gedurende 10 min gecentrifugeerd gedurende 10 minuten bij 3000 xg en 4 ° C. De geprecipiteerde eiwitten dient een hecht pellet blijven. Als de pellet is niet strak of de oplossing nog troebel is, kunnen de monsters op ijs gekoeld worden gedurende 5 minuten meer en centrifugeren herhaald. De monsters moeten worden bewaard op ijs om een ​​strakke pellet garanderen.

5 Isolatie en zuivering van gDNA

1. In een schone 15 ml centrifugebuis Pipetteer 5 ml isopropanol en 8 pi zuivere Glycogeen oplossing bij 20 mg / ml.
2. Giet het supernatant dat het gDNA van stap 4.3 in de buis met de Isopropanol en Glycogen Solution, achterlating het neergeslagen proteïne pellet. Nadat de supernatant toegevoegd, meng het monster 50 maal door omkeren en centrifugeer gedurende 30 minuten bij 3000 xg en 4 ° C.
3. Giet de supernatant langzaam in een schone 15 ml buis. Na verwijdering van het supernatant, voeg 1 ml 70% ethanolWas de pellet door langzaam schommelen en voorzichtig bewegen ethanol via pellet neergeslagen meerdere malen. Bewaar de ethanol in de buis.
4. Na de eerste wasbeurt, centrifugeer het monster gedurende 1 min bij 2000 xg en 20 ° C. Deze centrifugatiestap kan bij hetzij 4 ° C of 20 ° C. Geen significant effect van temperatuur is aangetoond voor deze stap.
5. Na de eerste wassen en centrifugeren van de pellet, giet langzaam de ethanol te wassen uit de tube en weggooien, vervolgens een tweede wasbeurt door herhalen van de stappen 5.3 en 5.4.
6. Na verwijdering van het supernatant van de tweede wasbeurt, de pellet aan de lucht drogen gedurende 15 minuten.
   1. Als het monster is niet helemaal droog, de lucht drogen voor nog eens 15 minuten.

6 Rehydratatie van gDNA

1. Nadat het monster is gedroogd, voeg 300 ul Tris-EDTA op de gedroogde pellet gDNA hydrateren.
2. Vortex het monster gedurende 5 sec met gemiddelde snelheid en plaats in een65 ° C waterbad gedurende 1 uur.
3. Verwijder de monsters uit het waterbad en incubeer O / N bij kamertemperatuur.
   Opmerking: Alle producten en reagentia gebruikte materialen in de tabel vermelde, en Tabel 4.

Resultaten

Om de optimale parameters te bepalen voor DNA-extractie van een reeks gekoppelde DNA extracties werd uitgevoerd. Een enkele speeksel monster werd gesplitst en elk deel daarop een van twee mogelijke waarden voor een gegeven variabele. Ten minste acht replicaten van elke gepaarde proef uitgevoerd (bijvoorbeeld, werd een speeksel monster porties verdeeld extractie testen met en zonder initiële 50 ° C incubatie). Optimalisatie is gebaseerd op vier standaard metrics: totale DNA opbrengst, de 260/280 waarde, de waard...

Discussie

Deze procedure is een geoptimaliseerde DNA-extractie protocol aanzienlijk verbeterd rendement van hoog moleculair gewicht DNA vergeleken met standaard werkwijzen, zonder dat DNA kwaliteit. De kritische stap met het grootste effect op de opbrengst van de meest was stap 5.2, die een langere centrifugatiestap tijdens ethanolprecipitatie dan elke gepubliceerde protocol hier beoordeeld, behalve een die niet op grote schaal werd verspreid ¹¹ bevat. Geen veranderingen in DNA kwaliteit waaraan deze langere centrifuga...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
15 ml Centrifuge Tubes	Fisher	12-565-268
Cell Lysis Solution	Qiagen	158908
Proteinase K	Sigma	P6556
Protein Precipitation Solution	Qiagen	158912
Isopropanol	Fisher	A416-4
Glycogen	EZ-BioResearch	S1003
70% Ethanol	Fisher	04-355-305
Tris-EDTA (TE)	Fisher	BP2473-1
NaCl	Fisher	AC194090010
Tris HCl	Fisher	BP1757-100
EDTA (0.5 M) Solution	Fisher	03-500-506
Sodium Dodecyl Sulfate	Fisher	BP166-100
Analog Vortex Mixer	Fisher	02-215-365
Centrifuge 5810R	Eppendorf	5811 000.010