Microschaal-Vortex bijgestaan ​​Electroporatie voor Sequential Molecular Delivery

Summary

Een microfluïdische vortex bijgestaan ​​elektroporatie platform is ontwikkeld voor sequentiële levering van verschillende moleculen in dezelfde cel populaties met een nauwkeurige en onafhankelijke dosering controle. Het systeem afmeting gebaseerd doelcel zuiveringsstap voorgaande elektroporatie geholpen om moleculaire levering efficiëntie en verwerkt levensvatbaarheid van de cellen te verbeteren.

Abstract

Elektroporatie wordt steeds prominenter in de afgelopen jaren, omdat het een zeer krachtige techniek voor lichamelijk introduceren niet-doordringende exogene moleculaire probes in cellen. Dit werk meldt een microfluïdische elektroporatie platform in staat om meerdere molecuul levering aan zoogdiercellen met nauwkeurige en moleculair-afhankelijke parameter controle. Vermogen van het systeem om cellen te isoleren uniforme grootteverdeling maakt minder variatie in electroporatie efficiency per gegeven elektrische veldsterkte; vandaar verbeterde levensvatbaarheid monster. Bovendien zijn de werkwijze visualisatie functie maakt waarneming van de fluorescerende moleculaire opname in real-time, nopen moleculaire levering parameterinstellingen maakt in situ efficiëntieverbetering. Om de enorme mogelijkheden van de gerapporteerde platform laten zien, macromoleculen met verschillende afmetingen en elektrische ladingen (bijvoorbeeld dextran met MW van 3.000 en 70.000 Da) warengeleverd aan uitgezaaide borstkanker cellen met hoge levering efficiëntie (> 70%) voor alle geteste moleculen. De ontwikkelde platform heeft het potentieel aangetoond voor gebruik in de uitbreiding van onderzoeksgebieden waar on-chip elektroporatie technieken kunnen nuttig zijn.

Introduction

De laatste jaren heeft het gebruik van elektrische pulsen cytosolische levering van extracellulaire moleculen vergemakkelijkt een aantrekkelijke manier manipuleren zoogdiercellen. ¹ Deze werkwijze, ook bekend als elektroporatie, omkeerbaar permeabilizes het celmembraan, waardoor inherent ondoorlaatbaar membraan moleculen toegang krijgen intracellulaire milieu van de cellen. Omdat vrijwel elk molecuul in het cytosol worden ingebracht via tijdelijke gemaakt poriën in het membraan van een type cellen middels elektroporatie wordt de techniek gemeld als meer reproduceerbaar en universeel, en efficiënter dan andere methoden die virus-gemedieerde chemische en opt....

Protocol

1 Celbereiding

1. Plaat 1 x 10 ⁵ cellen / ml van metastatische borstkanker cellijn MDA-MB-231 in een volume van 10 ml per weefselkweek T75 kolf in Leibovitz L-15 medium gesupplementeerd met 10% (v / v) foetaal runderserum en 1 % penicilline-streptomycine.
2. Incubeer MDA-MB-231 cellen in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 0% _CO2 omgeving.
3. Oogst cellen voor proeven 2 dagen na zaaien door het behandelen van cellen met 0,25% trypsine-EDTA gedurende 2 min en inactiveren enzymatische activiteit van trypsine door toevoeging van 8 ml van de groeimedia.
4. Pellet cellen door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 200....

Results

De ontwikkelde parallelle microfluïdische electroporator geleverd macromoleculen met verschillende afmetingen en elektrische ladingen in levende uitgezaaide borstkankercellen. Succesvolle moleculaire levering werd kwalitatief bepaald door het volgen veranderingen in fluorescentie-intensiteit van geëlektroporeerde baan cellen in situ en bevestigd door kwantitatieve metingen via flowcytometrie analyse. Figuur 4A toont dat 90% van de behandelde cellen respons Het 70.000 Da neutrale dextran. Voor d.......

Discussion

Met de nieuwe parallelized elektroporatie platform, 10-voudige verhoging van de overslag en de efficiëntie van multi-molecuul aflevering werd in aanvulling op alle verdiensten die de eerder ontwikkelde single-kamer-systeem biedt bereikt. ¹⁸ Voorheen beschikbaar verdiensten omvatten (i) voorzuivering van doelcellen uniforme grootteverdeling levensvatbaarheid versterking, (ii) nauwkeurige en individuele moleculaire doseringssturing, en (iii) lage operationele elektrische stroom. Fluorescerend gemerkte dextranen.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MDA-MB-231 cancer cell line	American Type Culture Collection (ATCC)	HTB-26
Leibovitz’s L-15 Medium	Cellgro, Mediatech, Inc.	10-045-CV
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco, Life Technologies	16000-044
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Cellgro, Mediatech, Inc.	21-030
Trypsin	Gibco, Life Technologies	25200-056
Flow Cytometer easyCyte HT	Millipore	0500-4008
Oxygen Plasma Cleaner	Technics Micro-RIE
Dektak 6M surface profiler	Veeco
KMPR 1050	Microchem
SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT	Dow Corning
Compressed Nitrogen gas	Airgas	NI 300
High Pressure Regulator	McMaster-Carr	6162K22
Downstream regulator	McMaster-Carr	4000K563
High-speed 3/2way-8 valve manifold	Festo
Inline Check Valve	Idex Health and Science	CV3320
5/32" OD x 3/32" ID Polyurethan tubes	Pneumadyne	PU-156F-0
1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes	Pneumadyne	PU-250PB-4
1/16" PEEK tubings	Festo	P1533
1/32" PEEK tubings	Idex Health and Science	P1569
PEEK tubing unions	Idex Health and Science	P881
Pulse Generator	HP	8110A
Aluminum Wire	Bob Martin Company	6061 ALUM
Oscilloscope	Agilent	DSO3062A
50 ml centrifuge tubes	VWR	21008-178
15 ml centrifuge tube	VWR	21008-216
T75 culture flask	VWR	82050-862
Dextran, Tetramethylrhodamine, 3,000 MW, Anionic	Gibco, Life Technologies	D3307
Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral	Gibco, Life Technologies	D1819
Dextran, Texas Red, 3,000 MW, Neutral	Gibco, Life Technologies	D3329