C. elegans heeft zich ontpopt als een nieuwe genetische model om gastheer-pathogeen interacties te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol te infecteren C. elegans met Salmonella typhimurium combinatie met een dubbele streng RNAi interferentie techniek om de rol van ontvangende genen bij afweer tegen Salmonella infectie onderzocht.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In het laatste decennium, C. elegans heeft zich ontpopt als een ongewerveld organisme om interacties tussen gastheren en ziekteverwekkers te bestuderen, met inbegrip van de afweer tegen gram-negatieve bacterie Salmonella typhimurium. Salmonella stelt persistente infectie in de darm van C. elegans en resulteert in vroege dood van de besmette dieren. Een aantal immuniteitsmechanismen geïdentificeerd in C. elegans te verdedigen tegen Salmonella infecties. Autophagy, een evolutionair geconserveerd lysosomale afbraak route, is aangetoond dat de Salmonella replicatie in C. beperken elegans en zoogdieren. Hier wordt een protocol beschreven te infecteren C. elegans met Salmonella typhimurium, waarbij de wormen worden blootgesteld aan Salmonella gedurende een beperkte tijd, vergelijkbaar met Salmonella-infectie bij mensen. Salmonella infectie aanzienlijk verkort de levensduur van C. elegans </ Em>. De essentiële Autofagie gen BEC-1 als voorbeeld, combineerden we deze infectie methode C. elegans RNAi voeden benadering en toonde dit protocol kan worden gebruikt om de functie van C. onderzocht elegans genen van de gastheer in de verdediging tegen Salmonella infectie. Sinds C. elegans hele genoom RNAi bibliotheken beschikbaar zijn, dit protocol maakt het mogelijk om uitgebreid te screenen op C. elegans genen die beschermen tegen Salmonella en andere intestinale pathogenen met behulp van genoom-brede RNAi bibliotheken.
Inleiding
De vrijlevende bodem nematode Caenorhabditis elegans is een eenvoudige en genetisch handelbaar modelorganisme gebruikt voor vele biologische vraagstukken te bestuderen. C. elegans overwegend bestaat als zelfbemestende hermafrodieten. Mannetjes worden spontaan gegenereerd door niet-scheiding van het X-chromosoom tijdens gametogenese 1,2. In aanwezigheid van overvloedig voedsel, C. elegans voortdurend te ontwikkelen door middel van vier larvale stadia tot volwassene. Temperatuur beïnvloedt ook C. elegans ontwikkeling; snellere ontwikkeling waargenomen bij hogere temperaturen. In het laboratorium, C. elegans is gek....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. XLD (Xylose Lysine desoxycholaat) Agar Plates
XLD agar is een selectieve groei medium voor Salmonella, die verschijnt als zwarte kolonies op XLD agar platen. Echter, als er geen problemen van verontreiniging, bijvoorbeeld een LB plaat kan worden vervangen.
- Weeg 5,5 g XLD agar en resuspendeer in 5 ml gedeïoniseerd water.
- Meng grondig tot alle agar is nat. Voeg 95 ml gedemineraliseerd water tot alle klontjes zijn verdwenen en het medium is volledig geresuspendeerd.
- Kook de middellange tot volledig oplossen (niet in een autoclaaf).
- Koel het medium bij kamertemperatuur tot 50 ° C.
- ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Bij 20 ° C, de gemiddelde levensduur van wild-type N2 wormen is 17 dagen (Figuur 2A en tabel 2). Salmonella-infectie vermindert aanzienlijk de mediane levensduur van N2 wormen tot 10,5 dagen (p = 0,0002, log-rank test) (Figuur 2A ).
Als een C. elegans gen een belangrijke rol in de verdediging tegen Salmonella infectie speelt, wordt voorspeld dat de remming gevoeligheid zal geven Salmonella infectie. In fei.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
C. elegans is een eenvoudige genetisch modelorganisme dat bacteriën eet als bron van voedingsstoffen. Zo is het gemakkelijk om de normale bacteriële voedsel te vervangen door een intestinale pathogeen interacties tussen C. onderzoeken elegans en de gekozen pathogeen. Hierin een protocol wordt beschreven aan Salmonella-infectie en C. combineren elegans RNAi voeden behandeling om de rol van ontvangende genen bij afweer tegen Salmonella infectie onderzocht. Vor.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Wij danken dr. Diane Baronas-Lowell voor kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door een FAU Charles E. Schmidt College of Science Seed Grant en een vergrijzende Scholarship van de Ellison Medical Foundation aan KJ
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| LB Broth | Fisher | BP9723-500 | |
| XLD agar | EMD Chemicals | 1.05287.0500 | |
| Bacto Agar | Fisher | DF0140-01-0 | |
| Peptone | Fisher | BP1420-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S671-500 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C69-500 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | 12481C50 | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | |
| Petri Dish 95 x 15 mm | Fisher | FB0875714G | |
| Petri Dish 60 x 15 mm | Fisher | 08-757-13A | |
| Falcon Serological pipet | Fisher | 13-668-2 | |
| Falcon Express Pipet-Aid | Fisher | 13-675-42 | |
| MaxQ6000 shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE6000-7 | |
| Incubator | Percival | I-36DL |
Referenties
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
- Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Aballay, A., Ausubel, F. M.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
