Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

RNA Catalyst als verslaggever voor het screenen van geneesmiddelen tegen RNA Bewerken in Trypanosomen

8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51712

⸱

22 juli 2014

 ,  , 
1Department of Biochemistry, McGill University, 2Institute of Parasitology, McGill University, 3McGill Centre for Bioinformatics, McGill University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Een zeer gevoelige ribozyme-gebaseerde test, toepasbaar voor high-throughput screening van chemicaliën die zich richten op het unieke proces van RNA-bewerking bij trypanosomatiden-pathogenen, wordt in dit artikel beschreven. Remmers kunnen worden gebruikt als hulpmiddelen voor hypothese-gedreven analyse van het RNA-bewerkingsproces en uiteindelijk als therapeutische middelen.

Samenvatting

Aanzienlijke vooruitgang is geboekt bij het bepalen van het mechanisme van mitochondriale RNA editing in trypanosomen. Ook heeft aanzienlijke vooruitgang geboekt in het identificeren van de onderdelen van de editosome complex dat RNA editing katalyseren. Het is echter nog niet duidelijk hoe deze eiwitten samenwerken. Chemische verbindingen die wordt verkregen uit een high-throughput-scherm tegen de editosome kunnen blokkeren of invloed hebben op een of meer stappen in de montage cyclus. Daarom zal de identificatie van nieuwe chemische verbindingen waardevolle moleculaire probes voor het ontleden van de editosome functie en assemblage. In eerdere studies, werden in vitro bewerken testen uitgevoerd met behulp van radio-gelabelde RNA. Deze testen zijn tijdrovend, inefficiënt en niet geschikt voor high-throughput doeleinden. Hier, een homogene fluorescentie-based "mix en meet" hammerhead ribozym in vitro reporter assay om RNA editing bewaken, wordt gepresenteerd. Slechts als gevolg van RNA editing vande hamerhaai ribozyme een fluorescentie resonantie energie-overdracht (FRET) oligoribonucleotide substraat ondergaat decollete. Dit resulteert in scheiding van de fluorofoor door de quencher waardoor een signaal produceert. Wanneer daarentegen de editosome functie wordt geremd, het fluorescentie signaal wordt gedoofd. Dit is een zeer gevoelige en eenvoudige test die algemeen voor monitoring van in vitro RNA editing of hoge doorvoer screening van chemische stoffen die de editosome functie kan remmen moeten zijn.

Inleiding

Het proces van RNA editing, een post-transcriptionele mRNA modificatie, werd voor het eerst ontdekt in trypanosomatids 1. Sindsdien is veel werk verricht bij het ​​bestuderen van het mechanisme achter RNA editing in Trypanosoma brucei 2,3. In een reeks enzymatische reacties, het editosome, een kerncomplex van ongeveer 20 eiwitten creëert rijpe mitochondriale mRNAs voor meerdere componenten van de energieopwekking oxidatieve fosforylering systeem. De volgorde van katalytische gebeurtenissen is endonucleolytische splitsing, uridylate (U) toevoegen of verwijderen, en ligatie, zoals gedicteerd door gids-RNA's (gRNAs) 4.

Naast de kern editosome complexe eiwitten, een aantal toebehoren factoren ook geïdentificeerd 5-7. Deze eiwitten worden meestal gezien gegroepeerd onafhankelijke complexen. De volgorde van de proteïne assemblage in de kern editosome complex en interactiepatronen van de kerncomplex de accessoirecomplexen moeten nog worden bepaald. Gericht op de RNA bewerkingsproces in trypanosomatids kan chemische dissectors bieden die helpen bij het bestuderen van de aanmaak en functie van de editosome complex. Bovendien, functionele studies op verschillende editosome eiwitten hebben aangetoond wezenlijkheid in verschillende levensfasen, met vermelding van hun potentieel als drug targets 8-12. Daarom kunnen de gevonden remmers van de editosome ook als lead verbindingen tegen trypanosomatids. Dit is tijdig, zoals thans beschikbare middelen tegen ziekten veroorzaakt door trypanosomatid zijn giftig, inefficiënt en duur 13,14.

Een efficiënte en gemakkelijk in vitro test moet de chemische universe specifieke remmers die RNA editing blokkeren verkennen. Drie assays zijn ontwikkeld en gebruikt voor het bewaken editosome activiteiten: (a) volledig door in vitro RNA editing assay 15, (b) vooraf gesplitst in vitro RNA editing assay 16,17, eennd (c) hammerhead ribozyme (HHR)-gebaseerde test 18. De eerste twee assays afhankelijk directe visualisatie van het bewerkte product (ATPase 6 mRNA) met behulp van radioactiviteit. De HHR-gebaseerde test gebruikt een gewijzigde versie van de ATPase 6 mRNA dat wordt gemodelleerd te gedragen als een ribozym na bewerking. De functionele ribozym vervolgens splitst specifiek een radioactief gemerkt RNA substraat, die als verslaggever. Recentelijk Moshiri et al.. Ontwikkelde een "meng en meet" HHR-gebaseerde in vitro reporter assay te controleren RNA editing waarbij het ​​radioactief gemerkte RNA-substraat wordt vervangen door een fluorescentie-resonantie-energieoverdracht (FRET) substraat 19. Het principe voordelen van deze test zijn: (a) het een snelle en makkelijke mix en meet type assay, de productie van actieve ribozym en substraat splitsing plaatsvinden gelijktijdig in dezelfde buis klein volume (bijvoorbeeld 20 pi), (b ) vermijdt het gebruik van radioactief gemerkt materiaal, (c) gevoeligheid eenfforded door fluorescentie instrumenten in een micro-titer plaat formaat, en (d) een hoge signaal-ruisverhouding. Met deze test wordt het effect van bekende RNA editing ligase remmers tegen gezuiverd editosome bevestigd 19. Dit experiment gevalideerd assay voor de snelle identificatie van RNA editing remmers, vooral tegen hele editosomes van T. brucei.

Figuur 1 is een uitvoerige stap-voor-stap schema van de fluorescentie gebaseerde in vitro RNA editing assay. Dit protocol kan worden gebruikt voor het bewaken RNA editing in vitro of gemakkelijk worden aangepast voor het screenen van bibliotheken van verbindingen van verschillende schalen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het onderstaande protocol beschrijft de procedure voor het uitvoeren van de fluorescentie gebaseerde RNA editing test. De test kan worden uitgevoerd in een PCR-buis, 96 putjes of 384 putjes afhankelijk van de omvang van het experiment. Vervolgens wordt de fluorescentie-signaal kan worden gelezen op een geschikte real-time PCR-detectie systeem. De test hier beschreven in de context van 384 putjes.

1. Kweken T. brucei Cellen

  1. Bereid een groeimedium voor T. brucei procyclische vorm cellen. Voor 1 liter medium:
    1. Los op 25,4 g SDM-79 poeder in 800 ml miliQ water.
    2. Voeg 2 g NaHCO3 en pH op 7,3 met 10 M NaOH.
    3. Voeg nanozuiver water tot een eindvolume van 900 ml, filter steriliseren.
    4. Voeg foetaal runderserum (FBS), penicilline-streptomycine-oplossing en hemine (2,5 mg / ml) tot eindconcentraties van 10% (v / v), 100 U / ml en 7,5 mg / L respectievelijk.
  2. Grow 300 ml T. brucei 1,7 A wildtype (procyclische vorm) cellen bij 28 ° C, onder schudden bij 70 rpm tot een dichtheid van 1,5 x 10 7 cellen / ml. 0,5 mg totaal eiwit, voldoende voor 600 bewerken reacties Dit moet 3 ml actieve editosome produceren met ~: NOTE.
  3. Oogst de cellen door centrifugatie bij 6.000 g gedurende 10 min bij 4 ° C.
  4. Was de pellet met 50 ml koud PBSG buffer (10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2PO 4, 145 mM NaCI en 6 mM glucose) en spin down de cellen weer door centrifugatie bij 10.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.

2. Isolatie van ruwe Mitochondriën

Opmerking: Alle stappen moeten worden uitgevoerd op ijs of bij 4 ° C tot editosome activiteit behouden.

  1. Resuspendeer de geoogste cellen in 30 ml DTE buffer (1 mM Tris-HCl pH 8,0 en 1 mM EDTA). Gebruik een 40 ml steriele Dounce homogenisator (voorgekoeld) aan het celmembraan verstoren door strijken en neer ten minste 10 keer op ijs.
  2. Voeg onmiddellijk 4.3 ml 60% sucrose (gew / vol, dwz 1,75 mol) aan het homogenaat tot een eindconcentratie van 0,25 M. Centrifugeer bij 15.800 xg gedurende 10 min bij 4 ° C, om bij voorkeur neerhalen mitochondria.
  3. Resuspendeer de pellet in mitochondriale 4,6 ml STM-buffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM sucrose en 2 mM MgCl2). Voeg 13,8 ul van 0,1 M CaCl2 en 4 pi RNase-vrij DNase I tot eindconcentraties van 0,3 mM en 9 U / ml. Incubeer het mengsel gedurende 1 uur op ijs.
  4. Voeg 4,6 ml STE-buffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM sucrose en 2 mM EDTA) aan de DNase I Centrifugeer inactiveren bij 15.800 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
  5. Resuspendeer de pellet in 400 ui lysisbuffer (10 mM Tris-HCl pH 7,2, 10 mM MgCl2, 100 mM KCl, 1 ug / ml pepstatine, 1 mM DTT, en 1 x volledige-EDTA-vrije proteaseremmer) en overbrengen in een microfugebuis.
  6. Voeg 10% Triton X-100 tot een eindconcentratie van 1% pernd incubeer het lysaat gedurende 15 minuten bij 4 ° C op een buis rotator.
  7. Schakel de mitochondriale lysaat met tweemaal centrifugeren bij 17.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C; behoud van de heldere supernatant telkens.

3. Editosome Zuivering

  1. Giet 10 ml 10% -30% (v / v) glycerol lineaire gradiënt (tabel 1) in een ultracentrifuge buis met 2x HHE gradiënt buffer (40 mM HEPES pH 7,9, 20 mM Mg (OAc) 2, 100 mM KCl, en 2 mM EDTA) en een gradiënt maker door het volgen van de handleiding.
  2. Verwijder voorzichtig 500 pi oplossing van de bovenkant van de glycerol gradiënt en voorzichtig laden 500 ul van de geklaarde lysaat mitochondriale. Spin bij 178.000 xg gedurende 6 uur bij 4 ° C met behulp van een ultracentrifuge.
  3. Verzamel 500 pi fracties achtereenvolgens van boven tot onderaan de helling bij 4 ° C. Snap dan bevriezen de fracties met vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C tot gebruik.

4. RNA bereiding

  1. Gloeien de respectieve DNA-matrijs die sequentie complementair aan T7 promotersequentie (tabel 2) met een T7 promoter-oligonucleotide (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') in een 1:1 molverhouding door verwarming bij 90 ° C gedurende 3 minuten en afkoelen bij kamertemperatuur gedurende tenminste 10 minuten.
  2. Transcriberen RNA met behulp van een in vitro transcriptie kit door het volgen van de handleiding.
  3. Stop de transcriptie reactie door het toevoegen van een gelijk volume van 7 M ureum kleurstof (7 M ureum, 0,05% Xyleen Cynol, en 0,05% Broomfenolblauw). Voer een filter gesteriliseerde 9% denaturerende polyacrylamidegel (9% acrylamide, 7 M ureum, 1x TBE).
  4. Gebruik de ultraviolette (UV) schaduwen met een kortegolf UV-lamp op te sporen en accijnzen respectieve RNA. Plaats de uitgesneden gelstuk in een microcentrifugebuis en voeg 400 ul gel elutiebuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM NaOAc, 1 mM EDTA en 0,25% SDS). Elueren nacht bij kamertemperatuur op een buis rotator.
  5. Precipitate de geëlueerde RNA door toevoeging van 1 ml van koude 100% ethanol en incubatie hetzij bij -80 ° C gedurende 30 minuten of -20 ° C overnacht.
  6. Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C, tot pellet door het RNA.
  7. Was de pellet met 1 ml 75% ethanol. Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
  8. Resuspendeer de RNA pellet adequate wijze RNase-free water om de gewenste concentraties te bereiken, zoals getoond in Tabel 2.

5. Fluorescentie-gebaseerde RNA bewerken Assay

  1. Voor een enkele reactie, combineer 1 pmol (1 pl) van preA6Rbz en 2,5 pmol (1 pl) van gA6Rbz (molaire verhouding 1:2,5) in een microfuge buis, incubeer bij 70 ° C gedurende 3 minuten en laat het zitten bij kamertemperatuur gedurende minste 10 minuten.
  2. Maak ondertussen een master mix met behulp van tabel 3, zonder de preA6Rbz en gA6Rbz, voor het bewerken reactie die 1x HHE buffer (25 mM HEPES pH 7,9, 10 mM Mg (OAc) 2, 50 mM KCl en 10 mM EDTA), 1 mMATP, 5 mM CaCl2, 16 ng / ul Torula gist RNA, 0,1% Triton X-100, en de gezuiverde editosome.
  3. Voeg getemperd preA6Rbz en gA6Rbz aan de master mix te voltooien.
  4. Pipetteer 18 ul van de master mix (tabel 3) in putjes bestaande uit 2 pl RNase-vrij water (putjes zonder verbindingen) of 2 ui 200 uM chemische verbindingen bevatten controlemonsters in de plaat volgens figuur 5.
  5. Dicht de plaat met een plaatafdichter en draai de plaat naar beneden, om eventuele luchtbellen te verwijderen. Incubeer bij 28 ° C gedurende 4 uur.
  6. Voeg 25 pmol (2 pl) van gA6Rbz concurrent aan elk putje. Zet een nieuwe sealer, draai de plaat naar beneden en leg hem op een real-time PCR machine. Programmeer het volgende experiment:
    Stap 1: 85 ° C gedurende 5 minuten; Stap 2: 24 ° C gedurende 10 min; Stap 3: Stop.
  7. Voeg 15 pmol (1 pl) van FRET substraat aan elk putje tot een eindvolume van 23 pi. Dicht de plaat met een frisse sealer.Snel draaien de plaat en plaats het terug op de real-time PCR machine.
  8. Programmeer een nieuw experiment met de volgende stappen:
    Stap 1: 37 ° C gedurende 1 min; Stap 2: Lees; Stap 3: Ga naar 1, 40 maal Stap; Stap 4: Stop.
  9. Setup de plaat door het selecteren van alle putten die het lezen nodig hebben en kiezen voor de FAM filter. Volume input 23 ul en start de run.
  10. Bereken de helling van de verkregen uit elk putje / monster een kinetische meting te verkrijgen door het uitzetten van de hellingen op een staafdiagram voor analyse waarden. OPMERKING: Een kinetisch gelezen verbetert de signaal-ruisverhouding tussen het monster en de achtergrond; als de achtergrond monster een helling dicht bij nul zou hebben. Een eindpunt lezing heeft een hogere achtergrondgeluiden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De nodige stappen voor het opzetten van een grootschalige scherm tonen, figuren 2-5 zijn representatief controle-experimenten betreffende de kwaliteit van de assay. Deze zijn essentieel controleproeven voor een consistente bepaling meerdaagse screening of vergelijking van verschillende schermen.

Het beoordelen van de fluorescentie-signaal-ruis verhouding

Om de stabiliteit en kwaliteit van de met fluoresceïne gemerkte oligoribonuc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Een nieuwe high-throughput screening methode om remmers tegen de RNA editing complex van Trypanosomen identificeren werd gepresenteerd, het verstrekken van een nieuw instrument voor drug discovery aan ziekten veroorzaakt door trypanosomatids tegen te gaan. FRET-gebaseerde ribozym test wordt veelvuldig gebruikt voor verschillende doeleinden 20-22; echter, hebben we de capaciteit van FRET-gebaseerde ribozym assay in vitro volgen van RNA editing activiteit 19 gebruikt. Deze assay zou kunnen w...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Najmeh Nikpour en Fiona Alum gaven suggesties en bewerkten dit manuscript. Het Department of Biochemistry aan de McGill University ondersteunde HM en VM met de CIHR Training Initiative in Chemical Biology. Dit werk werd ondersteund door de Canadian Institute of Health Research (CIHR) grant 119464 (aan R. S.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
SDM-79 MediumGibco by Life Technologies
Fetal Bovine SerumLife Technologies12483-020heat inactivation bij 55 °C gedurende 1 uur
Hemin, minimaal 80%SigmaH5533-10G
Penicilline-Streptomycine-oplossingFisher ScientificMT-30-002-CI
Dnase 1 recombinant, Rnase Vrij Roche4716728001
T7 RiboMax Express Large  schaal RNA  productiesysteemPromegaP1320
Kimble Kontes Dounce weefselmolen  Fisher ScientificK885300-0040  
Gradient Master, versie 5.25 Biocomp107-201M
Ultra Clear Tube, 13,2 mlBeckman Coulter344059
Optima L-100XP  Ultracentrifuge Beckman Coulter392052
SW 41 Ti ROTORBeckman Coulter331336
MicroSeal 'B' Seal, SealsBioradMSB1001
CFX 384 Touch Real-Time PCR DetectiesysteemBiorad185-5484
Acryel/Bis oplossing (19:1), 40% (w/v)Bio BasicA0006-500ML
Urea, moleculaire biologiekwaliteit, 1 kgLife TechnologiesAM9902

Referenties

  1. Benne, R., et al. transcript of the frameshifted coxII gene from trypanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA. Cell. 46, 819-826 (1986).
  2. Hajduk, S., Ochsenreiter, T. RNA editing in kinetoplastids. RNA biology. 7, 229-236 (2010).
  3. Aphasizhev, R., Aphasizheva, I. Uridine insertion/deletion editing in trypanosomes: a playground for RNA-guided information transfer. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 2, 669-685 (2011).
  4. Seiwert, S. D., Stuart, K. RNA editing: transfer of genetic information from gRNA to precursor mRNA in vitro. Science. 266, 114-117 (1994).
  5. Weng, J., et al. Guide RNA-binding complex from mitochondria of trypanosomatids. Molecular. 32, 198-209 (2008).
  6. Hashimi, H., Zikova, A., Panigrahi, A. K., Stuart, K. D., Lukes, J. TbRGG1, an essential protein involved in kinetoplastid RNA metabolism that is associated with a novel multiprotein complex. RNA. 14, 970-980 (2008).
  7. Ammerman, M. L., et al. Architecture of the trypanosome RNA editing accessory complex, MRB1. Nucleic Acids Res. 40, 5637-5650 (2012).
  8. Huang, C. E., O'Hearn, S. F., Sollner-Webb, B. Assembly and function of the RNA editing complex in Trypanosoma brucei requires band III protein. Molecular and cellular biology. 22, 3194-3203 (2002).
  9. Carnes, J., Trotter, J. R., Peltan, A., Fleck, M., Stuart, K. RNA editing in Trypanosoma brucei requires three different editosomes. Molecular and cellular biology. 28, 122-130 (2008).
  10. Hearn, S. F., Huang, C. E., Hemann, M., Zhelonkina, A., Sollner-Webb, B. Trypanosoma brucei RNA editing complex: band II is structurally critical and maintains band V ligase, which is nonessential. Molecular and cellular biology. 23, 7909-7919 (2003).
  11. Schnaufer, A., et al. An RNA ligase essential for RNA editing and survival of the bloodstream form of Trypanosoma brucei. Science. 291, 2159-2162 (2001).
  12. Tarun, S. Z., et al. KREPA6 is an RNA-binding protein essential for editosome integrity and survival of Trypanosoma brucei. RNA. 14, 347-358 (2008).
  13. Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A. Chemotherapy of trypanosomiases and leishmaniasis. Trends in parasitology. 21, 508-512 (2005).
  14. Denise, H., Barrett, M. P. Uptake and mode of action of drugs used against sleeping sickness. Biochemical pharmacology. 61, 1-5 (2001).
  15. Seiwert, S. D., Heidmann, S., Stuart, K. Direct visualization of uridylate deletion in vitro suggests a mechanism for kinetoplastid RNA editing. Cell. 84, 831-841 (1996).
  16. Igo, R. P., Palazzo, S. S., Burgess, M. L., Panigrahi, A. K., Stuart, K. Uridylate addition and RNA ligation contribute to the specificity of kinetoplastid insertion RNA editing. Molecular and cellular biology. 20, 8447-8457 (2000).
  17. Igo, R. P. Jr, et al. Role of uridylate-specific exoribonuclease activity in Trypanosoma brucei RNA editing. Eukaryotic cell. 1, 112-118 (2002).
  18. Wang, B., Salavati, R., Heidmann, S., Stuart, K. A hammerhead ribozyme substrate and reporter for in vitro kinetoplastid RNA editing. RNA. 8, 548-554 (2002).
  19. Moshiri, H., Salavati, R. A fluorescence-based reporter substrate for monitoring RNA editing in trypanosomatid pathogens. Nucleic Acids Res. 38, e138(2010).
  20. Jenne, A., et al. Rapid identification and characterization of hammerhead-ribozyme inhibitors using fluorescence-based technology. Nature. 19, 56-61 (2001).
  21. Hartig, J. S., et al. Protein-dependent ribozymes report molecular interactions in real time. Nature. 20, 717-722 (2002).
  22. Famulok, M. Allosteric aptamers and aptazymes as probes for screening approaches. Current opinion in molecular therapeutics. 7, 137-143 (2005).
  23. Teng, B., Burant, C. F., Davidson, N. O. Molecular cloning of an apolipoprotein B messenger RNA editing protein. Science. 260, 1816-1819 (1993).
  24. Jurica, M. S. Searching for a wrench to throw into the splicing machine. Nature chemical biology. 4, 3-6 (2008).
  25. Spahn, C., Prescott, C. Throwing a spanner in the works: antibiotics and the translation apparatus. Journal of molecular medicine. 74, 423-439 (1996).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Trypanosoom-editosoomhigh-throughput screeningfluorescent reporterassayhammerhead-ribozymFRET-substraatmitochondriale RNA-editingin vitro-assayRNA-editing-remmersglycerolgradiënt
RNA Catalyst als verslaggever voor het screenen van geneesmiddelen tegen RNA Bewerken in Trypanosomen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.