Methodenartikel

DNA-affiniteit-gezuiverd Chip (DAP-chip) methode om Gene Doelen bepalen voor bacteriële Twee componenten Regulatory Systems

15.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51715

⸱

21 juli 2014

 ,  , 
1Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

In dit artikel

Samenvatting

Deze video artikel beschrijft een in vitro microarray gebaseerde methode om het gen doelstellingen en bindingsplaatsen bepalen voor twee componenten systeem respons toezichthouders.

Samenvatting

In vivo methoden, zoals chip-chip zijn goed gevestigde technieken die worden gebruikt om de wereldwijde gendoelstellingen bepalen voor transcriptiefactoren. Ze zijn echter van weinig nut in het verkennen van bacteriële tweecomponenten regulerende systemen met ongekarakteriseerde activatie. Dergelijke systemen reguleren transcriptie wanneer geactiveerd in de aanwezigheid van unieke signalen. Aangezien deze signalen zijn vaak onbekend is, kan de in vitro microarray gebaseerde methode in deze video artikel beschreven worden gebruikt om gendoelstellingen en bindingsplaatsen voor respons toezichthouders bepalen. Deze DNA-affiniteit-gezuiverde-chip werkwijze kan worden gebruikt voor elke gezuiverde regulator een organisme met een genoom gesequenced. Het protocol omvat waarbij het gezuiverde gelabeld eiwit binden aan genomisch DNA geschoren en affiniteit zuiveren van het eiwit gebonden DNA, gevolgd door fluorescentie labeling van DNA en hybridisatie met een aangepaste tegels array. Voorafgaand stappen die kunnen worden gebruikt om de analyse te specifi optimaliserenc regulatoren worden beschreven. De door de matrix gegevensanalyse pieken worden gebruikt bindingsplaats motieven, die vervolgens experimenteel bevestigd voorspellen. Het motief voorspellingen kunnen verder worden gebruikt om gendoelstellingen van orthologe respons regulatoren bepalen nauw verwante soorten. We tonen de toepasbaarheid van deze methode door het bepalen van het gen doelen en bindingsplaats motieven en daarmee de functie voor een sigma54-afhankelijke respons regulator DVU3023 in de milieu-bacterie Desulfovibrio vulgaris Hildenborough voorspellen.

Inleiding

Het vermogen van bacteriën om te overleven en gedijen kritisch afhankelijk van hoe goed zij kunnen waarnemen en reageren op verstoringen in hun omgeving, en dit op zijn beurt afhankelijk is van de signaaltransductie systemen. Het aantal signaleringssystemen een bacterie codeert is genoemd zijn "microbiële IQ" en kan een indicatie van zowel de variabiliteit van haar omgeving en de mogelijkheid om meerdere signalen te detecteren en fine-tunen zijn reactie 1 zijn. Twee componenten signaaltransductie-systemen (TCS) zijn de meest voorkomende signaleringssystemen die door bacteriën, en bestaan ​​uit een histidine kinase (HK) dat de externe signaleert en stuurt via fosforylering een effector response regulator (RR) 2. RR een grote productie domeinen en dus verschillende effector functies, maar de meest voorkomende reactie is transcriptionele regulatie via een DNA-bindend domein 1. De signalen waargenomen en de bijbehorende functies van de vast merendeel van TCS onbekend blijven.

Hoewel in vivo werkwijzen zoals chip-chip routinematig worden gebruikt voor de bepaling van genomische bindingsplaatsen van transcriptiefactoren 3, kunnen ze alleen worden gebruikt voor bacteriële tweecomponenten systeem RR als de activerende voorwaarden of signalen bekend zijn. Vaak zijn de omgevingsfactoren die een TCS activeren zijn moeilijker te bepalen dan hun gendoelstellingen. De in vitro microarray gebaseerde test hier beschreven kan worden gebruikt om effectief en snel bepalen gendoelstellingen en functies van TCS voorspellen. Deze test maakt gebruik van het feit dat RR kunnen worden gefosforyleerd en dus geactiveerd in vitro gebruik van kleine moleculen donors zoals acetyl fosfaat 4.

In deze werkwijze, genaamd DAP-chip voor DNA-affiniteit-gezuiverde-chip (figuur 1), de RR gen van belang wordt gekloneerd met een His-tag in E. coli, en vervolgens gezuiverd gelabeld proteïne mag bind om genomische DNA geschoren. Het eiwit gebonden DNA wordt vervolgens verrijkt door affiniteit zuivering, zijn de verrijkte en input-DNA geamplificeerd, fluorescerend gemerkte, samengevoegd en gehybridiseerd aan een array die tegels op maat is gemaakt om het organisme plaats (figuur 1). Microarray experimenten kunnen artefacten en dus extra stappen worden gebruikt om de test te optimaliseren. Een dergelijke stap is om te proberen een doel bepalen RR onderzochte middels elektroforetische mobiliteit shift assays (EMSA) (zie workflow in figuur 2). Dan, na binding aan genomisch DNA en de DAP stappen het eiwitgebonden en input-DNA onderzocht door qPCR of de positieve doelstelling wordt verrijkt in de eiwitgebonden fractie ten opzichte van de inputfractie, hetgeen bevestigt optimale bindingsomstandigheden voor de RR (figuur 2). Na scala hybridisatie worden de gegevens geanalyseerd om pieken van hogere intensiteit signaal dat aangeeft genomische loci vinden waar de eiwit had gebonden. Functies kunnen worden voorspeld RR basis van de gendoelstellingen verkregen. De beoogde genomische loci worden gebruikt bindingsplaats motieven, die vervolgens experimenteel gevalideerd middels EMSA's (figuur 2) te voorspellen. De functionele voorspellingen en gendoelstellingen de RR kan worden uitgebreid tot nauw verwante soorten die orthologe RR coderen door het scannen van de genomen soortgelijke bindende motieven (figuur 2). De DAP-chip methode kan een schat aan informatie voor een TCS waar voorheen was er geen. De werkwijze kan ook worden gebruikt voor transcriptionele regulator indien het eiwit kan worden gezuiverd en DNA bindende voorwaarden kan worden bepaald, en voor elk organisme plaats met een genoomsequentie beschikbaar.

figure-introduction-1
Figuur 1. Het DNA-affiniteit-gezuiverde chip (DAP-chip) strategie 7. De RR-gen van het organisme van belang wordt gekloneerd met een carboxy-eindstandige His-tag in een E. coli-expressie stam. Gezuiverd His-gemerkt eiwit wordt geactiveerd door fosforylering met acetyl fosfaat en gemengd met geschoren genomisch DNA. Een portie van de bindingsreactie wordt opgeslagen als input DNA, terwijl de rest wordt onderworpen aan affiniteitszuivering met Ni-NTA hars. De ingang en de RR-gebonden DNA zijn gehele genoom versterkt, en gelabeld met Cy3 en Cy5, respectievelijk. Het gemerkte DNA wordt samengevoegd en gehybridiseerd met een reeks tegels, dat vervolgens wordt geanalyseerd om de gendoelstellingen bepalen. Figuur aangepast en herdrukt met de creative commons licentie van 7.

figure-introduction-2
Figuur 2. Samenvatting van de workflow. Voor elk gezuiverd getagd protein, beginnen met het bepalen van een doel met behulp van EMSA. Laat eiwit aan genomisch DNA en DNA-affiniteit-zuiveren (DAP) en hele genoom binden versterken (WGA) de verrijkte en input DNA. Als een gen doelwit is bekend, gebruik qPCR zodat de target dat is verrijkt in de eiwitgebonden fractie. Als er geen doel kon worden bepaald, gaat u rechtstreeks naar DNA-etikettering en-array hybridisatie. Als verrijking door qPCR niet kon worden waargenomen, herhaal dan de eiwit-gDNA bindend en DAP-WGA stappen met verschillende hoeveelheden eiwit. Gebruik array analyse om pieken te vinden en in kaart hen om genen te richten. Gebruik de upstream-regio's van target genen bindingsplaats motieven voorspellen. Valideren van de motieven experimenteel gebruik van EMSA's. Gebruik het motief om de genomen van verwante soorten coderen orthologen van de RR in studie te scannen, en zo goed voorspellen genen gericht in die soorten. Op basis van de gendoelstellingen verkregen, kan de fysiologische functie RR en de orthologen worden voorspeld. Figuur aangepast en herdrukt met de creatieve commons licentie van 7.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerking: Het onderstaande protocol is op maat gemaakt voor de bepaling van gendoelstellingen van de RR DVU3023 uit de bacterie Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. Het kan worden aangepast aan andere transcriptionele regulator plaats.

1. Clone en Zuiver RR

  1. Kloon de RR-gen, in het bijzonder DVU3023, van D. vulgaris Hildenborough in een Escherichia coli-expressievector zodanig dat het gen C-eindstandig His-gelabeld en expressie onder de controle van een T7 promoter.
    Opmerking: Verscheidene klonen methoden worden gebruikt en wordt bepaald door de onderzoeker. Alternatieve affiniteitslabels kunnen ook worden gebruikt.
  2. Transformeer de expressie-construct in E. coli BL21 (DE3) expressie stam.
  3. Grow up 1 L van de BL21 expressie stam bij 37 ° C. Op mid-log-fase, voeg IPTG tot 0,5 mM tot eiwit expressie te induceren. Continue groei bij kamertemperatuur gedurende 24 uur.
  4. Centrifugeer cellen bij 5000 g gedurende 10 min bij 4 ° C. Resuspendeer cellen in lysisbuffer (20 mM natriumfosfaat, pH 7,4, 500 mM NaCl, 40 mM imidazool, 1 mg / ml lysozym, 1x benzonase nuclease). Lyse cellen met een Franse pers bij 4 ° C.
  5. Centrifugeer lysaat bij 15.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Filteren met een 0,45 pm spuitfilter.
  6. Was een 1 ml Ni Sepharose FPLC op een instrument met 10 ml wasbuffer (20 mM natriumfosfaat, pH 7,4, 500 mM NaCl, 40 mM imidazool).
  7. Plaats lysaat op de kolom. Kolom was met 20 ml wasbuffer.
  8. Elueer DVU3023 met een gradiënt van 0-100% elutiebuffer (20 mM natriumfosfaat, pH 7,4, 500 mM NaCl, 500 mM imidazool).
  9. Laad geëlueerde fracties op een ontzoutingskolom, en was met een ontzouting buffer (20 mM natriumfosfaat pH 7,4, 100 mM NaCl).
  10. Centrifuge eiwitmonster in een hoog molecuulgewicht cutoff centrifuge filter om het eiwitconcentraat. Voeg tot 0,1 mM DTT en 50% glycerol en bewaar eiwit bij -20 ° C.
    Opmerking: zuiveringsmethoden moeten afzonderlijk worden geoptimaliseerd voor elk eiwit onder studie.

2. Bepaal Gene Doel voor RR Met behulp van elektroforetische mobiliteit (EMSA)

  1. PCR amplificeren 400 bp stroomopwaarts van de kandidaat-target-gen DVU3025, met behulp van D. vulgaris Hildenborough genomisch DNA als template, en een voorwaartse ongelabelde primer en een reverse 5'-biotine-gelabelde primer.
    Opmerking: Tips om een ​​kandidaat targetgen selecteren: Vaak RR's binden de bovenstroomse gebieden van hun eigen gen / operon, of ze kunnen proximaal gecodeerde genen reguleren. Als de RR heeft orthologen in andere soorten, op zoek naar genen die zijn geconserveerd in de buurt. Alternatieve methoden omvatten het kiezen van kandidaat-genen gebaseerd op regulon voorspellingen (bijv. RegPrecise 5), of het voorspellen sigma54-afhankelijke promotors 6 voor RR's die zich sigma54-afhankelijk zijn.
  2. Voer het PCR product op een 1% agarosegel, uitgesneden 400 bp sized product, en zuiveren het DNA met behulp van een gel extractie opruimen kit.
  3. Meng DVU3023 eiwit (0,5 pmol) 100 fmol van gebiotinyleerd DNA substraat in 10 mM Tris HCl, pH 7,5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 25% glycerol en 1 ug / ml poly dI.dC (niet specifiek competitief DNA) in een totaal volume van 20 pl. Ook het opzetten van een reactie zonder enige eiwit als controle. Incubeer de reactie bij kamertemperatuur op de bank voor 20 minuten.
  4. Opmerking: Dit zijn vermeld en andere reactiecomponenten kunnen worden toegevoegd afhankelijk van de RR plaats standaardomstandigheden. Indien de activering wordt gewenst, voeg 50 mM acetyl fosfaat aan het reactiemengsel (vaak bronrecords wordt DNA in vitro binden zonder activatie).
  5. Pre-run een prefab mini 6% polyacrylamide-0.5x TBE gel in 0,5 x TBE buffer bij 100 V gedurende 30 minuten. Voeg 5 gl 5x laadbuffer (0,1% broomfenolblauw, 0,1% xyleencyanol, 30% glycerol in 1x TBE) de bindingsreacties en de belasting 18 ul van de reactie op de gel. Uitgevoerd bij 100 V gedurende 2 uur.
    Opmerking: Om oververhitting, wat kan leiden tot dissociatie van het eiwit-DNA-complexen, vul de buitenste bufferkamer in het elektroforese systeem loopbuffer zodanig dat de meerderheid van de gel geïsoleerd door buffer voorkomen. Alternatief kan de gel bij 4 ° C worden uitgevoerd
  6. Snijd een geladen nylon membraan om de grootte van de gel en weken in 0,5 x TBE minstens tien minuten. Verwijder de gel uit de cassette. Snijd het even welke randen van de gel en sandwich de gel en membraan tussen twee dikke filtreerpapier gedrenkt in 0,5 x TBE, en plaatsen in een semi-droge blotapparaat en uitgevoerd bij 20 V gedurende 30 minuten.
  7. Plaats het membraan in een commerciële UV-licht crosslinker instrument en stel de tijd tot 3 minuten.
    Opmerking: Het membraan kan nu droog opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende enkele dagen alvorens naar de volgende stap.
  8. Gebruik een los verkrijgbare chemiluminescentiedetectie kit die een streptavidine-mierikswortel peroxida teltse conjugaat aan de blot volgens instructies van de fabrikant ontwikkeld.
  9. Afbeelding de blot met een computer aangesloten op een CCD-camera uitgerust en zoek een verschuiving van de mobiliteit van DNA substraat in aanwezigheid van de RR, wat aangeeft dat de RR bindt het DNA getest.
    Opmerking: De specificiteit van de eiwit-DNA verschuiving kan worden getest door in de reactie een overmaat niet-gemerkt competitief DNA, die moet elimineren of de verschuiving gezien verlagen.

3. Controleer Target Enrichment na Genomic DNA-eiwit Binding

  1. Genomic DNA-eiwit binding reactie
    1. Shear genomisch DNA met een gemiddelde grootte van 500 bp door sonicatie 100 ul genomisch DNA (bij concentraties 100-200 ng / ul) in een 1,5 ml microcentrifugebuis met een micropunt met 9 lage amplitude pulsen van 1 seconde, 2 seconden kloof tussen elk.
      Opmerking: Als het DNA spat aan de zijkanten van de buis, draai is de inhoud na elke 3 pulsen. De exacte omstandigheden gebruiktzal variëren met de ultrasoonapparaat instrument. De afgeschoven DNA fragmenten kunnen variëren van 100-1000 bp, maar de gemiddelde grootte moet binnen 400-600 bp. Teveel afschuiving kan tot minder intacte bindingsplaatsen, en te veel of te weinig afschuiving wordt bibliotheken preparaat beïnvloeden tijdens de verdere gehele genoom amplificatie stappen.
    2. Meng 2-3 ug geschoren genomisch DNA met RR-eiwit (0,5 pmol DVU3023) in 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM DTT, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 25% glycerol en 50 mM acetyl fosfaat. Incubeer reacties bij 25 ° C gedurende 30 minuten. Breng 10 pl van deze reactie naar een 1,5 ml buis en label als input DNA.
      Opmerking: Acetyl fosfaat wordt toegevoegd aan het eiwit activeren door in vitro fosforylatie. Fosforylering stimuleert DNA-binding, maar veel RRs DNA binden ook in vitro zonder activering 7. De hoeveelheid eiwit toegevoegd aan het reactiemengsel hangt af van de activiteit van het eiwit prep. De EMSA kan worden gebruikt om te kiezenimize dit bedrag.
  2. Affiniteit zuiveren het eiwit gebonden DNA
    1. Voeg 30 ul van Ni-NTA agarose hars een 0,6 ml microcentrifugebuis. Centrifugeer bij 100 xg gedurende 1 minuut om de hars te verzamelen op de bodem, en verwijder het supernatant. Voeg 100 ul wasbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 25% glycerol), flick de buis te mengen en centrifugeer bij 100 xg gedurende 2 minuten. Verwijder supernatant.
    2. Voeg de resterende 90 pl van de bindingsreactie de gewassen Ni-NTA-hars en incubeer in een roterende schudder gedurende 30 minuten.
    3. Centrifugeer bij 100 xg gedurende 2 minuten, en verwijder het supernatant (ongebonden DNA). Voeg 100 ul van wasbuffer, flick de buis om inhoud te mengen, en centrifugeer bij 100 xg gedurende 2 minuten. Verwijder supernatant. Herhaal de wasstap nog twee keer.
    4. Voeg 35 ul elutiebuffer (20 mM natriumfosfaatbuffer pH 8, 500 mM NaCl, 500 mM imidazool) aan de hars en door vortexen gemengd. Incubeer op de bank bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Centrifugeer bij 100 xg gedurende 2 minuten. Breng de bovenstaande om een ​​nieuwe 1,5 ml buis en label als de eiwit-gebonden DNA-fractie.
    5. Voeg ook 35 ul elutiebuffer met de ingang DNA.
    6. Zuiveren de ingang en de eiwitgebonden DNA fracties met behulp van een PCR zuivering kit.
  3. Hele genoom versterken de ingang en-eiwit gebonden DNA-monsters.
    1. Voeg 10 ul van de input en eiwitgebonden DNA PCR buizen scheiden. Voeg 1 ul van 10x fragmentatie buffer, 2 ui Bibliotheek bereiding buffer en 1 ui Library Stabilisatie-oplossing aan elk monster. Meng goed door vortexen. Verhit in een thermocycler bij 95 ° C gedurende 2 minuten, en chillen op het ijs.
      Opmerking: Het uitgangspunt hoeveelheid DNA ten minste 10 ng teneinde voorkomen dat er amplificatie vertekening.
    2. Voeg 1 ul van Bibliotheek Bereiding enzym, meng door pipetteren en incubeer thermische cycler bij 16 ° C/20 min., 24 ° C/20 min, 37 ° C gedurende 20 min, 75 ° C / 5 min, En op 4 ° C.
    3. Aan elke buis, voeg 47,5 ul van water, 7,5 ul van 10x versterking master mix, en 5 pl polymerase. Goed mengen en verwarm bij 95 ° C / 3 min, gevolgd door 20 cycli van 94 ° C/15 sec, 65 ° C / 5 min. Houd reacties bij 4 ° C.
    4. Zuiver het geamplificeerd DNA monsters met behulp van een PCR zuivering kit en meten DNA-concentratie spectrofotometrisch.
  4. Controleer doel verrijking in het eiwit gebonden DNA met behulp van qPCR
    1. Ontwerp qPCR primers tot 200 bp van het stroomopwaartse gebied van de EMSA-geverifieerde target-gen (DVU3025) met behulp van een vrij beschikbare primer design software versterken.
    2. Opgezet drievoud qPCR reacties voor elke DNA sjabloon met elke primer set. Bereid een master mix voor elke primer set. 1x master mix bevat 10 pl 2x SYBR Green qPCR mix, 0,5 uM van elke primer en water tot een totaal van 18 pl. Aliquot 18 ul van de master mix per putje van een 96-wells PCR-plaat.
    3. Verwaterdee het versterkt en gezuiverd input en-eiwit gebonden DNA-monsters tot 5 ng / ul met water en gebruik als DNA-template. Voeg 2 pl DNA-matrijs aan de putjes.
    4. Dicht de plaat met een ultra heldere qPCR afdichtfilm, spin down plaat in een centrifuge bij 200 xg / 1 min. Plaats plaat in een real-time qPCR machine. Cyclus als volgt met de bijbehorende software qPCR: 95 ° C / 1 min en 40 cycli van 95 ° C/10 sec, 59 ° C/15 sec en 70 ° C/35 sec.
    5. Ook het opzetten van drievoud qPCR reacties met primers om stroomopwaarts gebieden van een niet-verwante gen (negatieve controle) te versterken.
    6. Bereken ΔC T door aftrekking van de waarde van CT-eiwit gebonden DNA van die van de ingang DNA. Bereken voudige verrijking van target-gen in het eiwit gebonden DNA als 2 ΔC T.
      Opmerking: Als het doel bovenstroomse gebied werd verrijkt in de eiwit-gebonden DNA versus de ingang DNA, geeft dit aan dat de binding reacties en affiniteit zuivering waren successful. Ga verder met stap 4. Als verrijking van het doel stroomopwaartse gebied niet werd waargenomen, herhaal de bindingsreacties (stap 3.1) met verschillende hoeveelheid eiwit.

4. DNA Labeling en Array hybridisatie

  1. Etiket Input DNA met Cy3 en verrijkte DNA met Cy5
    oot: Cy3 en Cy5 kleurstoffen zijn lichtgevoelig en de zorg moeten worden genomen om blootstelling aan licht tot een minimum te beperken.
    1. Meng 1 ug DNA met 40 pi Cy3/Cy5-labeled 9-meren en volume aan te passen tot 80 pl met water.
    2. Warmte denatureren bij 98 ° C gedurende 10 min in het donker (in een thermocycler). Snel chill op ijs gedurende 2 minuten.
    3. Voeg 2 pl Klenow polymerase (3'-5'-exo - 50.000 U / ml), 5 mM dNTP en 8 pi water om elke reactie, meng en incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur in het donker (in een thermocycler).
    4. Naar EDTA 50 mM tot de reactie en NaCl-oplossing 0,5 M. stoppen
    5. Doorvoermonsters 1,5 ml buisjes containing 0,9 volume isopropanol, incubeer in het donker gedurende 10 minuten en gecentrifugeerd bij 12.000 xg gedurende 10 minuten. De pellet moet roze voor Cy3-gelabeld DNA en blauw voor Cy5-gelabelde DNA.
    6. Was pellet met 80% ethanol (500 ul) en gecentrifugeerd bij 12.000 xg gedurende 2 minuten. Lucht drogen pellets gedurende 5-10 minuten in het donker.
      Opmerking: Pellets kunnen worden bewaard bij -20 ° C.
    7. Resuspendeer pellet in 25 ul water. Meet DNA-concentratie spectrofotometrisch.
    8. Zwembad samen 6 pg elk van de Cy3-en Cy5-gelabelde DNA in een 1,5 ml buis en vacuüm drogen in een centrifuge op laag vuur in het donker (cover de centrifuge deksel als het transparant).
      Opmerking: Pellets kunnen worden bewaard bij -20 ° C tot klaar voor hybridisatie.
  2. Microarray hybridisatie
    1. Draai de hybridisatie systeem van 3-4 uur voorafgaand aan gebruik en de temperatuur tot 42 ° C.
    2. Bereid een hybridisatie-oplossing master mix zodanig dat 1x oplossing bevat 11,8 ul 2x hybridisatie buffer, 4,7 pl hybridisatie Component A en 0,5 pi oligo uitlijning.
    3. Resuspendeer de pellets in 5 pi water. Voeg 13 ul van dit mengsel aan het monster. Vortex gedurende 15 seconden incuberen bij 95 ° C in een droog bad gedurende 5 minuten. Houd de monsters bij 42 ° C in de hybridisatie systeem tot aan het laden.
    4. Bereid de microarray slide-mengersamenstel, volgens het protocol van de fabrikant.
    5. Plaats de mixer-schuifsamenstel binnen de hybridisatie-systeem. Belasting 16 pi van het monster in de vulopening, sluit de poorten met een zelfklevende folie, zet mengen op in het systeem, en hybridiseren gedurende 16-20 uur bij 42 ° C.
    6. Bereid 1x wasbuffers I (250 ml), II (50 ml) en III (50 ml) door verdunning van de 10x handel verkrijgbare buffers in water, en elke DTT toe aan 1 mM. Warm Buffer I bij 42 ° C.
    7. Schuif de mixer-dia in een demontage tool, en plaats in een schotel met warme Buffer I. Schil de mixer af onder krachtig shaking de demontage gereedschap met de hand.
    8. Plaats de dia in een container met 50 ml Wasbuffer I en schud krachtig gedurende 2 minuten met de hand.
    9. Transfer glijden in een tweede container met 50 ml Wasbuffer II en schud krachtig gedurende 1 minuut met de hand.
    10. Transfer dia in een derde container met 50 ml Wasbuffer III, en schud krachtig gedurende 15 seconden met de hand.
    11. Snel dep de randen van de dia op een papieren handdoek en leg in een rekje. Centrifugeer bij 200 xg gedurende 2 min aan de dia drogen. Plaats binnen slide geval, wikkel het met folie en bewaar in een exsiccator.
  3. Het scannen van de Array
    1. Plaats de dia in de microarray scanner volgens de instructies van het instrument.
    2. Gebruik een scanner software om de golflengten stellen als 532 nm = Cy3 en 635 nm = Cy5, en de eerste photomultiplier winsten tussen 350 en 400.
    3. Voorbeeld van de dia om de array op de dia te lokaliseren. Selecteer de array regio scannen.
    4. Scan de array en pas de photomultiplier instellingen zodanig dat de array functies zijn meestal geel. Het histogram moet de rode en groene bochten gesuperponeerd of zo dicht bij elkaar mogelijk te tonen. De curven moet eindigen boven de 10 -5 genormaliseerde tellingen bij verzadiging.
    5. Bespaar zowel 532 en 635 nm beelden afzonderlijk.
  4. Array Data Analysis
    1. Importeer de afbeeldingen in een array analyse software. Met behulp van de software, maakt u twee rapporten pair (. Paar) voor elke array (voor Cy3 en Cy5 beelden). Maak geschaalde log 2 verhouding bestanden met behulp van het paar bestanden. Gebruik log 2 verhouding bestanden om te zoeken naar de pieken met een schuifraam van 500 bp. Wijs de piek loci van de upstream-regio's van gendoelstellingen.
    2. Controleer of de positieve doelgroep (bepaald met EMSA en bevestigd door qPCR, DVU3025 in dit voorbeeld) wordt weergegeven in het bovenste toppen.
      Opmerking: Als de positieve doelstelling niet behoort tot de top hits, is het mogelijk dat de RR onder consiafschaffen heeft verschillende gendoelstellingen en repliceren DAP-chips kunnen worden uitgevoerd en pieken voor alle replicaten kunnen worden gebruikt om een ​​lijst op te genereren.

5. Binding Site Motif Prediction and Validation

  1. Ophalen sequenties voor upstream regio's (400 bp) voor de top gendoelstellingen zoals gegenereerd door DAP-chip analyse. Solliciteer MEME op deze sequenties door Microben Online (meme.nbcr.net) om motieven te voorspellen.
    Opmerking: Enhancer bindende eiwitten zoals sigma54-afhankelijke regulatoren kunnen enkele honderden basenparen stroomopwaarts van de startplaats te binden. Voor andere transcriptiefactoren, een kortere regio zoals 200 bp stroomopwaarts zal voldoende zijn.
  2. Ontwerp boven en onder streng DNA-oligomeren dat de voorspelde bindingsplaats motief geflankeerd door 10 basen aan beide zijden bevatten. Bestel de bovenste streng 5 'gebiotinyleerd.
  3. Meng de bovenste en onderste streng oligo's in verhouding 1:1,5 in 10 mM Tris HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA en 50 mM NaCl ineen totaal reactievolume van 20 pl in PCR-buisjes. Verwarm tot 95 ° C gedurende 5 min in een thermische cycler, gevolgd door langzame afkoeling tot 25 ° C. Verdun tienvoudige en gebruiken als wild type dsDNA substraat voor EMSA.
  4. Bereid gemodificeerde substraten met dezelfde stappen als hierboven, maar de opzet oligomeren tot 4-6 vervangingen uit te voeren in de geconserveerde bases van de bindende motief.
  5. Opgezet bindingsreacties met de RR en de wild-type of gewijzigde substraten en onderzoeken met behulp van EMSA, zoals beschreven in stap 2.
  6. Opmerking: De voorspelde motief wordt gevalideerd als de RR bindt het wildtype substraat maar niet de gewijzigde.

6. Behoud van Motif in Overige verwante bacteriesoorten

  1. Selecteer genoom van belang dat orthologen van DVU3023 bevatten. Verkrijgen volgorde en annotatiebestanden voor de genomen van de NCBI website.
  2. Gebruik een programmeertaal zoals Perl scripts die gebruik maken van het motief sequenties uit de DAP-chip doelstellingen om een ​​pos bouwen schrijvenvulle gewogen matrix en gebruik de matrix om soortgelijke motieven aanwezig in andere gesequenced genoom scoren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De bovengenoemde werkwijze werd toegepast voor de globale gendoelstellingen van de RR bepalen het model sulfaatreducerende bacterie Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7. Dit organisme heeft een groot aantal TCS vertegenwoordigd door meer dan 70 RR, waarin de meerdere mogelijke signalen die het detecteert en reageert. In vivo analyses van de functies van deze signaleringssystemen zijn moeilijk uit te voeren omdat hun signalen en dus hun activerende voorwaarden zijn onbekend. Hier werd de DA...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De DAP-chip hier beschreven methode is succesvol gebruikt voor de gendoelstellingen bepalen meerdere bronrecords in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7 waarvan een hier weergegeven als een representatief resultaat. Voor RR DVU3023, het kiezen van een kandidaat-gen doelwit was eenvoudig. DVU3025 is gelegen direct achter de RR-gen, en de RR en target genen worden bewaard in verschillende Desulfovibrio soorten, en bovendien DVU3025 heeft een voorspelde sigma54-afhankelijke promotor. De EMSA ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken Amy Chen voor haar hulp bij de voorbereiding van de video-shoot en voor het aantonen van de techniek. Dit werk uitgevoerd door ENIGMA: Ecosystems and Networks Integrated met Genes and Molecular Assemblies (http://enigma.lbl.gov), een wetenschappelijk Focus Area Program bij het Lawrence Berkeley National Laboratory, werd gesteund door de Office of Science, Bureau van biologische en Environmental Research, van het Amerikaanse ministerie van Energie onder contract nummer DE-AC02-05CH11231.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
HisTrapFF kolom (Ni-Sepharose kolom)GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, VS17-5255-01
Akta explorer (FPLC instrument)GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, VS
HiPrep 26/10 Desalting kolomGE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, VS17-5087-01
Qiaquick Gel extractie kitQiagen Inc, Valencia, CA, VS28704
Biotine-gelabelde oligonucleotidenIntegrated DNA TechnologiesN/A
6% polyacrylamide-0.5x TBE voorgegoten mini DNA retardatie gelLife Technologies, Grand Island, NY, VSEC63652BOXAlternatief kunt u uw eigen gel gieten.
Nylon membraanEMD Millipore, Billerica, MA, VSINYC00010
Trans-Blot SD Semi-dry elektroforese overdrachtscelBiorad, Hercules, CA, VS170-3940
Extra dik blot papier, 8 x 13,5 cmBiorad, Hercules, CA, VS170-3967
UV crosslinker Model XL-1000Fisher Scientific11-992-89
Nucleic Acid chemiluminescent detectie kit (Pierce)Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, VS89880
Ni-NTA agarose harsQiagen Inc, Valencia, CA, VS30210
GenomePlex Whole genome versterkingskit (fragmentatie buffer, bibliotheek voorbereidingsbuffer, bibliotheek stabilisatie oplossing, bibliotheek voorbereidingsenzym, 10x versterking master mix, WGA polymerase)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VSWGA2-50RXN
Nanodrop ND-1000Thermo Scientific, Wilmington, DE, VSVoor kwantificering van DNA
Perfecta Sybr Green SuperMix, met ROXQuanta biosciences95055-500Elke Sybr Green PCR mix kan worden gebruikt
PlateMax Ultra heldere hitte verzegelende film voor qPCRAxygen
[header]
96-well heldere lage profiel PCR microplaatLife Technologies, Grand Island, NY, VSPCR-96-LP-AB-C
Applied Biosystems StepOne Plus Real time PCR systeemLife Technologies, Grand Island, NY, VS4376600Elk real time PCR systeem kan worden gebruikt
Qiaquick PCR zuiveringskitQiagen Inc, Valencia, CA, VS28104Elke PCR opruimingskit kan worden gebruikt
Cy3/Cy5-gelabelde nonamerenTrilink biotechnologies, San Diego, CA, VSN46-0001, N46-0002
Klenow polymerase 50.000 U/ml, 3'-5' exo-New England Biolabs, Ipswich, MAM0212M
Hybridisatie systeemRoche-Nimblegen, Madison, WI, VSN/ADit bedrijf maakt geen arrays of gerelateerde items meer, dus alternatieve bronnen zoals Agilent of Affymetrix moeten worden gebruikt.
Op maat gedrukte microarrays en mixersRoche-Nimblegen, Madison, WI, VSN/A
Hybridisatie kit (2x Hybridisatie buffer, Hybridisatie component A, Uitlijning oligo)Roche-Nimblegen, Madison, WI, VSN/A
Wash buffer kit (10x Wash buffer I, II, III, 1 M DTT)Roche-Nimblegen, Madison, WI, VSN/A
GenePix 4200A microarray scannerMolecular Devices, Sunnyvale CA, VSDit model is vervangen door superieure exemplaren
GenePix Pro microarray softwareMolecular Devices, Sunnyvale CA, VS
Nimblescan v.2.4, ChIP-chip analyse softwareRoche-Nimblegen, Madison, WI, VSN/A

Referenties

  1. Galperin, M. Y. Diversity of structure and function of response regulator output domains. Curr Opin Microbiol. 13, 150-159 (2010).
  2. Casino, P., Rubio, V., Marina, A. The mechanism of signal transduction by two-component systems. Curr Opin Struct Biol. 20, 763-771 (2010).
  3. Aparicio, O., Geisberg, J. V., Struhl, K. Chromatin immunoprecipitation for determining the association of proteins with specific genomic sequences in vivo. Curr Protoc Cell Biol. 17 (17), (2004).
  4. McCleary, W. R., Stock, J. B. Acetyl phosphate and the activation of two-component response regulators. J Biol Chem. 269, 31567-31572 (1994).
  5. Novichkov, P. S., et al. RegPrecise web services interface: programmatic access to the transcriptional regulatory interactions in bacteria reconstructed by comparative genomics. Nucleic Acids Res. 40, 604-608 (2012).
  6. Studholme, D. J., Buck, M., Nixon, T. Identification of potential sigma(N)-dependent promoters in bacterial genomes. Microbiology. 146 (12), 3021-3023 (2000).
  7. Rajeev, L., et al. Systematic mapping of two component response regulators to gene targets in a model sulfate reducing bacterium. Genome Biol. 12, 99(2011).
  8. Crooks, G. E., Hon, G., Chandonia, J. M., Brenner, S. E. WebLogo: a sequence logo generator. Genome Res. 14, 1188-1190 (2004).
  9. Barbieri, C. M., Mack, T. R., Robinson, V. L., Miller, M. T., Stock, A. M. Regulation of response regulator autophosphorylation through interdomain contacts. J Biol Chem. 285, 32325-32335 (2010).
  10. Bourret, R. B. Receiver domain structure and function in response regulator proteins. Curr Opin Microbiol. 13, 142-149 (2010).
  11. Gao, R., Stock, A. M. Molecular strategies for phosphorylation-mediated regulation of response regulator activity. Curr Opin Microbiol. 13, 160-167 (2010).
  12. Hung, D. C., et al. Oligomerization of the response regulator ComE from Streptococcus mutans is affected by phosphorylation. J Bacteriol. 194, 1127-1135 (2012).
  13. Ladds, J. C., et al. The response regulator Spo0A from Bacillus subtilis is efficiently phosphorylated in Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett. 223, 153-157 (2003).
  14. Wen, Y., Feng, J., Scott, D. R., Marcus, E. A., Sachs, G. Involvement of the HP0165-HP0166 two-component system in expression of some acidic-pH-upregulated genes of Helicobacter pylori. J Bacteriol. 188, 1750-1761 (2006).
  15. Liu, X., Noll, D. M., Lieb, J. D., Clarke, N. D. DIP-chip: rapid and accurate determination of DNA-binding specificity. Genome Res. 15, 421-427 (2005).
  16. Gossett, A. J., Lieb, J. D. DNA Immunoprecipitation (DIP) for the Determination of DNA-Binding Specificity. CSH Protoc. 2008, (2008).
  17. Mascher, T., et al. The Streptococcus pneumoniae cia regulon: CiaR target sites and transcription profile analysis. J Bacteriol. 185, 60-70 (2003).
  18. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).
  19. Lefrancois, P., Zheng, W., Snyder, M. ChIP-Seq using high-throughput DNA sequencing for genome-wide identification of transcription factor binding sites. Methods Enzymol. 470, 77-104 (2010).
  20. Ho, J. W., et al. ChIP-chip versus ChIP-seq: lessons for experimental design and data analysis. BMC Genomics. 12, 134(2011).
  21. Liu, X., Lee, C. K., Granek, J. A., Clarke, N. D., Lieb, J. D. Whole-genome comparison of Leu3 binding in vitro and in vivo reveals the importance of nucleosome occupancy in target site selection. Genome Res. 16, 1517-1528 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Bacteri le twee componentensystemenbinding van responsregulatorenbinding aan genomisch DNAaffiniteitszuiveringtiling microarray hybridisatieelectrophoretic mobility shift assayvalidatie van motiefvoorspellingidentificatie van gen doelwittenSigma54 afhankelijke regulator

Gerelateerde artikelen