Array CGH voor de detectie van genomische kopij varianten heeft G-gestreepte karyotype analyse vervangen. Dit artikel beschrijft de technologie en de toepassing ervan in een diagnostische dienst laboratorium.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Array comparative genomic hybridisatie (Array CGH) voor detectie van genomische kopij Varianten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Array-CGH voor de detectie van genomische kopienummervarianten heeft de G-gebandde karyotypeanalyse vervangen. Dit artikel beschrijft de technologie en de toepassing ervan in een klinisch diagnostisch dienstlaboratorium. DNA geëxtraheerd uit een monster van een patiënt (bloed, speeksel of andere weefselsoorten) wordt gelabeld met een fluorochroom (ofwel cyanine 5 of cyanine 3). Een referentie-DNA-monster wordt gelabeld met het tegenovergestelde fluorochroom. Er volgt een opruimstap om niet-geïncorporeerde nucleotiden te verwijderen voordat de gelabelde DNA's worden gemengd en opnieuw gesuspendeerd in een hybridisatiebuffer en aangebracht op een array bestaande uit ongeveer 60.000 oligonucleotide-sondes van loci in het hele genoom, met een hoge sondendichtheid in klinisch belangrijke gebieden. Na hybridisatie worden de arrays gewassen, vervolgens gescand en worden de resulterende beelden geanalyseerd om de rode en groene fluorescentie voor elke sonde te meten. Software wordt gebruikt om de kwaliteit van elke sondemeting te beoordelen, de verhouding van rode tot groene fluorescentie te berekenen en potentiële kopienummervarianten te detecteren.
Inleiding
Het is vele jaren bekend dat deleties of extra exemplaren van chromosomale segmenten veroorzaken verstandelijke beperking, dysmorfie en congentical misvormingen, en in sommige gevallen leiden tot genetische syndromen 1. Echter, de enige technologie beschikbaar tot het midden van de jaren 2000 voor het genoom-brede detectie van deze veranderingen was G-gestreepte chromosoom analyse, die een resolutie van rond 5-10Mb heeft, afhankelijk van de regio en de aard van de onbalans, en dat kan niet detecteren abnormale chromosomen waar materiaal is vervangen door een gebied van een ander chromosoom met hetzelfde bandenpatroon. Bijkomende cytogenetische technieken z....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bij de etikettering Reactie
- Vóór, pre-aliquot cyanine 3 en 5 gelabeld dUTPs, ongelabelde nucleotiden en willekeurige primers gebruikt bij de concentraties producent aanbevolen in 96-well platen en bewaar bij -20 C gebruiksklaar. Voor de toepassing van dit protocol, portie 10,5 ul van de juiste gelabeld dUTP en 10,5 ul ongelabelde nucleotiden en random primers aan elk putje.
- Ontdooi de kant-en-klare 96-well plaat nucleotiden en primers bij 4 ° C gedurende 1 uur, beschermd tegen licht.
- Eenmaal ontdooid, evenwicht deze plaat bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 min, beschermd tegen licht.
- Equilibreer DNA monsters bij 6....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Elke probe op een matrix gehybridiseerd wordt gevisualiseerd als een mengsel van rode en groene fluorochromen (zie figuur 1). De verhouding van rood naar groen fluorescent signaal voor elke probe wordt gekwantificeerd door de scanner en de bijbehorende software uitzet deze als log2 afstemmen op hun genomische positie en gebieden identificeert die buiten ingestelde grenzen. De resulterende array sporen laten interpretatie van de regio's geïdentificeerd als genomically onevenwichtig. Bijvoorbeeld, het.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Array CGH zal niet evenwichtig herschikkingen of ploidie afwijkingen zoals triploïdie detecteren. Bovendien kunnen lage niveau mozaïek onevenwichtigheden niet worden gedetecteerd. Echter, array CGH heeft een hogere resolutie voor CNV detectie dan G-gestreepte chromosoom analyse die het heeft vervangen in veel cytogenetica laboratoria. Daarom is de huidige gouden standaard voor genoom-brede CNV detectie. Zij kan worden vervangen door next-generation sequencing technologie in de toekomst, maar op dit moment, de kosten en .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs hebben geen dankbetuigingen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| CGH microarray 8 x 60K | Agilent | G4126 | |
| Array CGH wasbuffers | Agilent | 5188-5226 | |
| Array CGH hybridisatiebuffer | Agilent | 5188-5380 | |
| Minelute zuiveringskit | Qiagen | 28006 | |
| Array CGH labelkit | Enzo | ENZ-42672-0000 |
Referenties
- Miller, D. T., et al. Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies. Am. J. Hum. Genet. 86, 749-764 (2010).
- Ahn, J. W., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
