Array comparative genomic hybridisatie (Array CGH) voor detectie van genomische kopij Varianten

Summary

Array CGH voor de detectie van genomische kopij varianten heeft G-gestreepte karyotype analyse vervangen. Dit artikel beschrijft de technologie en de toepassing ervan in een diagnostische dienst laboratorium.

Abstract

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient’s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Introduction

Het is vele jaren bekend dat deleties of extra exemplaren van chromosomale segmenten veroorzaken verstandelijke beperking, dysmorfie en congentical misvormingen, en in sommige gevallen leiden tot genetische syndromen ^1. Echter, de enige technologie beschikbaar tot het midden van de jaren 2000 voor het genoom-brede detectie van deze veranderingen was G-gestreepte chromosoom analyse, die een resolutie van rond 5-10Mb heeft, afhankelijk van de regio en de aard van de onbalans, en dat kan niet detecteren abnormale chromosomen waar materiaal is vervangen door een gebied van een ander chromosoom met hetzelfde bandenpatroon. Bijkomende cytogenetische technieken z....

Protocol

1. Bij de etikettering Reactie

1. Vóór, pre-aliquot cyanine 3 en 5 gelabeld dUTPs, ongelabelde nucleotiden en willekeurige primers gebruikt bij de concentraties producent aanbevolen in 96-well platen en bewaar bij -20 C gebruiksklaar. Voor de toepassing van dit protocol, portie 10,5 ul van de juiste gelabeld dUTP en 10,5 ul ongelabelde nucleotiden en random primers aan elk putje.
2. Ontdooi de kant-en-klare 96-well plaat nucleotiden en primers bij 4 ° C gedurende 1 uur, beschermd tegen licht.
3. Eenmaal ontdooid, evenwicht deze plaat bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 min, beschermd tegen licht.
4. Equilibreer DNA monsters bij 6....

Results

Elke probe op een matrix gehybridiseerd wordt gevisualiseerd als een mengsel van rode en groene fluorochromen (zie figuur 1). De verhouding van rood naar groen fluorescent signaal voor elke probe wordt gekwantificeerd door de scanner en de bijbehorende software uitzet deze als log2 afstemmen op hun genomische positie en gebieden identificeert die buiten ingestelde grenzen. De resulterende array sporen laten interpretatie van de regio's geïdentificeerd als genomically onevenwichtig. Bijvoorbeeld, het.......

Discussion

Array CGH zal niet evenwichtig herschikkingen of ploidie afwijkingen zoals triploïdie detecteren. Bovendien kunnen lage niveau mozaïek onevenwichtigheden niet worden gedetecteerd. Echter, array CGH heeft een hogere resolutie voor CNV detectie dan G-gestreepte chromosoom analyse die het heeft vervangen in veel cytogenetica laboratoria. Daarom is de huidige gouden standaard voor genoom-brede CNV detectie. Zij kan worden vervangen door next-generation sequencing technologie in de toekomst, maar op dit moment, de kosten en .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CGH microarray 8 x 60K	Agilent	G4126
Array CGH wash buffers	Agilent	5188-5226
Array CGH hybridisation buffer	Agilent	5188-5380
Minelute purification kit	Qiagen	28006
Array CGH labelling kit	Enzo	ENZ-42672-0000