Een eenvoudige Behavioral Assay for Testing visuele functie in Xenopus laevis

Summary

Xenopus laevis kikkervisjes liever zwemmen op de witte kant van een zwart / witte tank. Dit gedrag wordt gestuurd door hun visie. Op basis van dit probleem presenteren we een eenvoudige test om de visuele functie kikkervisjes testen.

Abstract

Meting van de visuele functie in de kikkervisjes van de kikker, Xenopus laevis, laat screenen op blindheid in levende dieren. Optokinetische reactie een-visie gebaseerde, reflexieve gedrag is waargenomen bij alle geteste vertebraten. Tadpole ogen zijn klein, zodat de staart flip respons werd gebruikt als alternatieve maatregel, die een vakman om de subtiele reactie opnemen vereist. We ontwikkelden een alternatief gedrag assay gebaseerd op het feit dat kikkervisjes liever zwemmen op de witte zijde van een tank wanneer geplaatst in een tank met zowel zwarte als witte zijkant. De hier gepresenteerde test is een goedkope, eenvoudige alternatief dat een reactie die gemakkelijk gemeten creëert. De opstelling bestaat uit een statief, webcam en geneste testen tanks, direct beschikbaar in de meeste Xenopus laboratoria. Dit artikel bevat een film die het gedrag van kikkervisjes, voor en na verbreken van de oogzenuw. Om de functie van een oog te testen hebben we ook vertegenwoordigers omvattenwoordiger resultaten van een kikkervisje waarbij elk oog onderging netvlies axotomy op opeenvolgende dagen. Toekomstige studies zouden een geautomatiseerde versie van deze test te ontwikkelen voor het testen van de visie van veel kikkervisjes in een keer.

Introduction

Xenopus laevis zijn gebruikt als modelorganisme om de vorming oog te bestuderen. De ogen snel te ontwikkelen, groeien naar volwassenheid in minder dan een week voor het testen van genen of wegen die een effect hebben op de visuele ontwikkeling en functie hebben. Om visuele functie te testen, heeft de optokinetische en optomotor respons gebruikt in zebravis en Xenopus kikkervisjes, respectievelijk ^1,2. Omdat de ogen van Xenopus kikkervisjes zijn relatief kleiner dan de zebravis, deze test vereist het gebruik van gespecialiseerde apparatuur en opgeleid personeel om de subtiele staart-flip en oog-beweging te detecteren in Xenopus. Een meer robuuste gedrag in Xenopus is de voorkeur voor zwemmen in een tank met een witte achtergrond, die hierin ³ wordt beschreven. Bij het plaatsen van een kikkervisje in een half zwart / half-witte tank, het pre-metamorfe kikkervisje snel zwemt naar de witte kant van de tank. Hiervoor gebruikten we deze assay om te bepalen of pluripotente cel-afgeleideogen waren functioneel ^4. Hier melden wij een gedetailleerde versie van deze test, die kan worden gebruikt om de visuele functie van premetamorphic Xenopus kikkervisjes testen.

Deze test is eenvoudiger dan de optomotor respons test, omdat het vereist slechts een gemonteerde digitale camcorder, digitale camera software en standaard uitrusting in de meeste Xenopus laboratoria. Bovendien, de geregistreerde respons vereist geen speciale training tally resultaten. Onze vertegenwoordiger resultaten tonen aan dat dezelfde groep van kikkervisjes, dubbele retinale axotomy hebben ondergaan, zwemmen willekeurig rond de tank. We hebben ook het gedrag test resultaten van een representatieve kikkervisje, toont hoe een oog kan worden getest visuele responsie. Een werkblad opgenomen zodat getallen tijdens de test verkregen kan worden ingebracht en geanalyseerd. Dit werkblad kan gebruikt worden om te bepalen of de geteste kikkervisjes hebben een visuele reactie.

Protocol

Animal Care

De Xenopus laevis kikkervisjes die in deze studie werden gekweekt, gehouden en behandeld volgens de procedures door Upstate Medical University IACUC en de Gids goedgekeurd voor de Zorg en gebruik van proefdieren.

. 1 Pre-gedrag instellen: Kikkervisjes

1. Verkrijgen bevruchte Xenopus embryo van een commercieel beschikbare bron of in vitro bevruchten eicellen, zoals eerder beschreven ^6.
2. Plaats blastula om neurale plaat stadium embryo's bij 18 ˚ C in 60 mm platen met 0,1 x MMR [10 X Marc's Modified Ringer's (MMR) oplossing voorraad (10 mM _MgCl2, 20 mM KCl, 20 mM _CaCl2, 50 mM HEPES; 1 M NaCl, pH 7,5, geautoclaveerd en opgeslagen bij kamertemperatuur)] met 50 ug / ml gentamicine antibioticum. Wijzig 0,1 x MMR elke dag en verwijder alle dode embryo's.
3. Zodra het embryo bereiken Nieuwkoop en Faber stadium ~ ^27-30 juli, schakelen the embryo's in 0,1 x MMR zonder antibioticum darm bacteriële groei mogelijk te maken.
4. Groeien de kikkervisjes tot ze de voeding stadium (fase 45) te bereiken en hen te verplaatsen naar 100 mm gerechten Petri gevuld met 0,1 x MMR. Voed ze brandnetel poeder supernatant om de andere dag voor een week, het veranderen van de 0,1 x MMR op de tussenliggende dag.
5. Na een week in de 100 mm petrischaal, verplaats dieren halve liter tanks gevuld met kikker water [0,5 g / L direct oceaan en 2 mM natriumfosfaat dibasisch (Na ₂ HPO _4: mw 141,96) pH 6,8]. Voed ze zoals in stap 2.4, maar verander alleen water 2-3 keer per week als het water troebel. Handhaving van de dieren in een 12 uur light/12 donker licht cyclus met de lichten aanzetten om 06:00.
6. Plaats de halve liter tank met de proefpersonen op een witte ondergrond, zoals een lab bankje underpad, ten minste 12 uur O / N, voorafgaand aan het testen.
7. Test kikkervisjes in stadium 45 tot 50 zoals beschreven in stap 3 hieronder.

. 2 Pre-gedrag instellen: Equipment

1. Vernietiging van een deel van het laboratorium voor het gedrag assay. Het moet in een rustige, weinig verkeer met standaard TL-verlichting.
2. Bereid het testen tanks voor de dieren.
   De geneste halve gallon testen tanks zijn samengesteld uit twee delen: een binnenste tank die water en kikkervisjes zal houden; en een buitenste tank met de visuele stimulus.
   1. Voor de binnentank, een kleine markering op de buitenhoeken met een sharpie, 5 cm van de bodem; dit is de waterlijn (figuur 1A, groene stippellijn).
   2. Ook voor de binnentank, vul de Divets in de tank (op de hoeken en het midden) met een inerte stof, zoals Sylgard elastomeer. OPMERKING: De kikkervisjes zal blijven hangen in deze gebieden als ze niet ingevuld
   3. Voor de buitentank dekken precies een helft van de buitenkant van een tank met zwarte elektrische tape en de andere helft met de witte tissuepapier Figuur 1B.
3. Plaats de tanks op hetinenten draaitafel.
4. Stel de webcam / statief zodat het boven het testen tanks. Stel de camera visualisatie van het testgebied toe, zoals getoond in figuur 1C.
5. Sluit de webcam aan op een computer met QuickTime Player geïnstalleerd ^5. Zet de camera aan. In QuickTime Player, onder File, selecteer 'Nieuw voor filmopname.' Het gedrag test setup zal zichtbaar zijn op de computer meteen.
6. Draperen een lichtgewicht katoenen doek over de gehele setup om externe stimuli die kikkervisje gedrag van invloed kunnen verminderen, evenals, verminderen gereflecteerd licht op het oppervlak van het water.
7. Zorg ervoor dat de luminantie onder de doek maatregelen tussen 35-50 cd / m ^2.

3. Gedrag Assay

1. Vul het binnenste testen tank om de 5 cm water merk in stap 1.2.1 met kikker water.
2. Met behulp van een kleine netto-, beweeg het dier in het binnenste testen tank.
3. Open QuickTime software op de computer en met behulp van de buitenste tank als een gids, zorg ervoor dat de camera in staat om te visualiseren en registreren de testafdeling.
4. Schrijf de naam dier, datum en tijd op een stuk papier en opnemen met de camera.
5. Plaats het proefvat in de buitenste tank met de zwarte kant van de tank naar rechts Figuur 2.
6. Start het opnemen van de film onmiddellijk na het regelen van de tank en de ingestelde timer gedurende 2 minuten.
7. Als de timer piept, verwijder de binnenste testtank, draait de buitenste tank 180 ° en plaats het binnenste proef tank in de buitenste tank. Start de timer. Let op: de zwarte kant moet nu aan de andere kant.
8. Herhaal stap 3.7, acht keer voor een totaal van tien studies. Gebruik figuur 2 als een gids, het controleren van elke proef.
9. Herhaal het gedrag assay twee verschillende dagen.

4. Netvlies axotomy

1. Plaats dier in 0,02% tricaïne tot ze niet meer reagereneen staart knijpen met een # 3 tang.
2. Smelt 1% agarose in 0,1 x MMR en vervolgens toe te voegen aan een 60 mm petrischaal. Eenmaal afgekoeld, een kleine rechthoekige graszode in de agarose en voeg het kikkervisje de graszode met wat 0.02% tricaïne, zodat het dier gedeeltelijk is ondergedompeld in de vloeistof.
3. Pierce de huid op een hoek van 45 graden achter de dorsale regio van het oog met een 25 G naald, terwijl schoren het dier tegen forceps aan de andere kant.
4. Het verzorgen van de ader, die naast de oogzenuw ligt niet aan knip, zorgvuldig te bereiken in het gat met # 5 tang, knip de oogzenuw en draai het uit de weg. Als er ernstige bloeden vanwege ongeluk knippen de slagader, dan snel plaats het dier in 2% tricaïne te euthanaseren. LET OP: 2% tricaïne oplossing kan gevoelloosheid veroorzaken bij de mens. Deze oplossing moet worden behandeld met handschoenen.
5. Om het dier herstellen na operatie, plaatst dier 100 mm petrischaal met 0.7X MMR en 50 ug / ml gentamicine gedurende 20 minuten. Next, overdracht kikkervisje naar vuilwatertank met kikker water. Laat dier rust O / N.
6. De volgende ochtend, het testen van de visuele functie zoals hierboven beschreven (stappen 3,1-3,9).

5. Analyze Results

1. Na de proeven worden afgewerkt, het meten van de hoeveelheid tijd die het kikkervisje blijft op de zwarte kant van de tank.
   1. Handmatig bekijk de video's met behulp van software die de tijd weergeeft en maakt veelvuldig pauzeren. Kijk naar de video display tijd. Noteer het begin van de twee min proces, dat is wanneer de binnentank succes genest binnen het buitenste reservoir en vierkante gezien de camera.
   2. Met de positie van de ogen van de kikkervisje te bepalen welke kant van de tank de dieren zwemmen op. Definieer oversteken van een kant van de tank naar de andere wanneer beide ogen zwart / witte lijn hebben overschreden.
2. Noteer het begin en einde van elk interval (in seconden) dat het dier besteedt aan de zwarte kant. Pauzeren en opnieuwwind de video om nauwkeurigheid te garanderen. Totaal de sec binnen elke proef.
3. Input deze nummers in de bijgevoegde Gedrag werkblad. Het werkblad zal de ratio van de tijd dat het dier besteed aan de witte kant door het aftrekken van de tijd besteed aan de zwarte kant van de tank van de totale 120 sec proef en delen door de totale tijd in seconden berekenen [(120 - totaal seconden besteed aan de zwarte kant) / 120 sec]. De gemiddelden werkblad deze ratio over alle 10 proeven.
4. Gebruik een student T-test, gepaarde, tweezijdige verdeling te bepalen of de proeven tussen dagen zijn significant (p ≤ 0,05).

Results

Eerdere rapporten is gebleken dat premetamorphic Xenopus kikkervisjes liever zwemmen op de witte kant van een zwart / witte tank en noemde deze test, de achtergrondkleur voorkeur Assay ³ We hebben deze test veranderd om de visuele functie van beide ogen van kikkervisjes in te testen minder dan een week. Zo kunnen hun ogen worden verzameld voor histologisch onderzoek.

We zien hier hoe de reactie door visuele signalen. In Film 1, de kikkervisjes in de linke...

Discussion

Wij rapporteren hier een eenvoudige visie geleide gedrags test die gemakkelijk kan worden uitgevoerd in minder dan een week minimaal geschoold laboratoriumpersoneel. Terwijl andere testen vereisen gespecialiseerde apparatuur en expertise in het gedrag van dieren, deze test kan een snelle test om visuele functie te bepalen. Een andere gedrags assay Visual Avoidance test ontwikkeld om te bepalen hoe de tectum bijdraagt ​​aan visuele waarneming bij Xenopus ^10. Deze test meet ruimtelijke afstemming en co...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/2 Gallon Flex-Tank with Cover	eNasco	SB19271M	Size: 5-3/8" x 7" x 3-3/4"
Zwarte elektrische tape
Wit tissuepapier
Grote inoculatie draaischijf	VWR	50809-022	Size: Dia 114,3 x  H 76,2 mm (4 1/2  x  3")
Durasorb onderlaken	VWR	82004-836	Size: 43,2 x 60,1 cm (17 x 24")
Kimwipe	Krackeler Scientific, Inc.	1945-34155-CS
Standaard statief		Various
iSight camera of webcam	Apple	M8817LL/A	Goed voor grotere kikkervisjes maar kleine zijn moeilijk te zien
Draagbare computer	Apple/PC	Various	We gebruikten een 13" MacBook, 2 GHz Intel Core 2 Duo met MacOSX Lion 10.7.5
MiniDV handycam camcorder	SONY	DCR-HC42	Aangesloten via firewire op de computer met een 6-geleider en 4-geleider alpha FireWire 400
Handycam station	SONY	DCRA-C121	Dit kan worden gebruikt voor het aansluiten van firewire op camera
QuickTime Player software	Quicktime	Version 10.1
26 G Naald (5/8" lengte)	VWR	BD305115
Dumont #5 Pincet	Fine Science Tools	11295-10
Beschikbare items
Gentamicinesulfaat [50 mg/ml]	Fisher Scientific	17-528Z	Opgeslagen bij RT
Sylgard 184 siliconen elastomeer	Fisher Scientific	NC9644388
Instant ocean	Doctors Foster and Smith	CD-116528	Stock oplossing = 100 g/L opgeslagen bij RT
Natriumfosfaat dibasisch	Sigma Aldrich	S0876	Stock oplossing = 0,4 M opgeslagen bij RT
In vitro bevruchte embryo's	eNasco	LM00490MX	100 embryo's/eenheid