Celoppervlaktemerker Mediated Zuivering van iPS Cell Intermediates van een Herprogrammeerbare muismodel

Samenvatting

Muis embryonale fibroblasten kunnen met lage efficiëntie worden gereprogrammeerd tot geïnduceerde pluripotente stamcellen door de geforceerde expressie van transcriptiefactoren Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. De zeldzame tussenproducten van de herprogrammeringsreactie worden via FACS geïsoleerd door middel van labeling met antilichamen tegen celoppervlaktemarkers Thy-1.2, Ssea-1 en Epcam.

Samenvatting

Mature cellen kunnen opnieuw worden geprogrammeerd naar een pluripotente toestand. Deze zogenaamde geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) kunnen zich ontwikkelen tot alle celtypen in het lichaam en hebben daarom een enorm potentieel voor toepassingen in de regeneratieve geneeskunde. Traditioneel worden iPS-cellen gegenereerd door virale introductie van transcriptiefactoren Oct-4, Klf-4, Sox-2 en c-Myc (OKSM) in fibroblasten. Reprogrammering is echter een inefficiënt proces waarbij slechts 0,1-1% van de cellen terugkeert naar een pluripotente toestand, waardoor het moeilijk is om het reprogrammeringsmechanisme te bestuderen. Een bewezen methodologie die het mogelijk heeft gemaakt om het reprogrammeringsproces te bestuderen, is om de zeldzame intermediaire producten van de reactie te scheiden van de refractaire bulkpopulatie. In het geval van muis-embryonale fibroblasten (MEF's) hebben wij en anderen eerder aangetoond dat reprogrammeringscellen een duidelijke reeks veranderingen ondergaan in het expressieprofiel van celoppervlaktemarkers die kunnen worden gebruikt voor de scheiding van deze cellen. Tijdens de vroege stadia van OKSM-expressie verliezen succesvol reprogrammeringscellen de fibroblastidentiteitmarker Thy-1.2 en reguleren ze de pluripotentie-geassocieerde marker Ssea-1 op. De laatste overgang van een subset van Ssea-1-positieve cellen naar de pluripotente toestand wordt gemarkeerd door de expressie van Epcam tijdens de late stadia van reprogrammering. Hier bieden we een gedetailleerde beschrijving van de methodologie die wordt gebruikt om reprogrammeringsintermediairen te isoleren uit culturen van reprogrammerings-MEF's. Om de experimentele reproduceerbaarheid te verhogen, gebruiken we een herprogrammeerbare muisstam die is gemodificeerd om een transcriptioneel transactivator (m2rtTA) onder controle van de Rosa26-locus en OKSM onder controle van een doxycycline-responsief promotor uit te drukken. Cellen geïsoleerd uit deze muizen zijn isogene en drukken OKSM homogeen uit na toevoeging van doxycycline. We beschrijven in detail de oprichting van de herprogrammeerbare muizen, de afstamming van MEF's en de daaropvolgende isolatie van intermediairen tijdens reprogrammering naar iPS-cellen via fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS).

Inleiding

Embryonale stamcellen (ES) cellen zijn afgeleid van de binnenste celmassa van de blastocyst embryo's ^1. Onder de juiste kweekomstandigheden ze zichzelf te vernieuwen en blijven pluripotent. In 2006 Yamanaka en collega's toonden aan dat volwassen cellen in zogenaamde geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen kunnen worden geherprogrammeerd door geforceerde expressie van de transcriptiefactoren oktober-4, Klf-4, Sox-2, c-Myc (OKSM) ^2. iPS cellen, zoals embryonale stamcellen, kunnen aanleiding geven tot alle celtypes van het lichaam te geven, maar zij niet onder de ethische discussie rondom het genereren van ES-cellen ^3. Bovendien iPS cellen dragen de belofte van gepersonaliseerde regeneratieve geneeskunde en houd enorm potentieel voor toepassingen zoals de ziekte van modellering en in vitro drug screening ^4,5. Om voor het herprogrammeren van de technologie om dit potentieel te vervullen, de fundamentele mechanisme van nucleaire herprogrammering moet volledig worden begrepen. Echter, de inspanningen om de herprogrammering pat ontledenHWAY werden gehinderd door het feit dat slechts een zeer klein aantal cellen te herprogrammeren (0,1-1%). Succesvol herprogrammering fibroblasten gemeld een afzonderlijke evenementen: een mesenchymale aan epitheliale transitie ^6-10 en, in de laatste fase van herprogrammering, activering van het endogene kern pluripotentie netwerk ^11-14 ondergaan. Wij en anderen ^12,13,15-17 onlangs werd een lijst van celoppervlak markers dat zorgt voor de scheiding van zeldzame tussenproducten van de vuurvaste massa bevolking. Herprogrammering muis embryonale fibroblasten (MEF) ondergaan veranderingen in de expressie van Thy-1.2, Ssea1 en EpCAM (onder andere) in de 2 weken durende herprogrammeringsproces ^15. Vroeg tijdens het herprogrammeren van een subset van MEF neerwaarts reguleren van de expressie van fibroblast identity marker (Thy-1.2) en start de uiting van de-pluripotency bijbehorende marker SSEA-1 ^12. Tijdens de laatste fase van de herprogrammering Ssea1-positieve cellen Reactivaten endogene pluripotency genen zoals Oct-4 ^10-13,15. Deze laatste overgang wordt aangegeven op het celoppervlak door detecteerbare expressie van EpCAM (zie figuur 1) of in een later stadium PECAM ^15. Onlangs, O'Malley et al. Beschreven het gebruik van CD44 en iCAM1 alternatief of aanvulling op Thy-1.2 en SSEA-1 voor de identificatie van herprogrammering tussenproducten. We hebben eerder FACS geëxtraheerd herprogrammering tussenproducten van dag 0, dag 3, dag 6, dag 9 en dag 12 herprogrammering culturen en van gevestigde iPS cellijnen basis van deze celoppervlak markers ^15,18. Om de hierna beschreven herprogrammering systeem voorwaarden we zien bij de enkele cel niveau dat hoewel de populaties rustige homogeen, er een zekere mate van heterogeniteit in de geïdentificeerde tussenliggende populaties. Opgemerkt wordt dat slechts een subset van cellen in deze populaties kunnen doorstromen naar de respectieve volgende stage van het herprogrammeringsproces en leiden tot iPS cel kolonies op verschillende efficiënties, die uitgebreid vooraf ^15,19 hebben gekenmerkt. Bovendien zal de herprogrammering efficiëntie van deze populaties ook afhankelijk van de re-plating en kweekomstandigheden. Om experimentele reproduceerbaarheid verhogen we een herprogrammeerbare muizenstam die is ontworpen om een transcriptionele transactivator (m2rtTA) onder controle van de Rosa26 locus en een polycistronisch OKSM cassette onder controle van een doxycycline reagerende promotor ^20,21 expressie. Met behulp van dit muismodel omzeilt de ongewenste neveneffecten van de traditionele virale methoden van iPS cel generatie, dat wil zeggen, een heterogene populatie start met cel naar cel variabiliteit in het aantal en de locatie van integratie plaatsen van virale inserts. Twee transgene muis stammen (OKSM, m2rtTA), verkrijgbaar als homozygote oprichter dieren bij het Jackson Laboratory, moeten worden overgestoken om de reprogra vestigenmmable muismodel (zie figuur 2). In dit manuscript beschrijven we in detail hoe MEF ontlenen, het genereren van iPS cellen, en het isoleren van de herprogrammering tussenproducten in verschillende stadia van het conversieproces door FACS.

Protocol

1 Instrument instellingen / Bereiding van het reagens / Genotyping

1. Bereid iPS celmedium: Supplement 500 ml Knockout DMEM medium met 75 ml foetaal runderserum (FBS), 5 ml L-glutamine, 5 ml niet-essentiële aminozuren, 500 ul β-mercaptoethanol, 5 x 10 ⁵ stuks Leukemie remmende factor ( LIF). Verwijzen wij u naar Materialen Lijst voor product en informatie over de aanschaf van gebruikte reagentia in het kader van dit manuscript.
2. Bereid MEF medium: Supplement 500 ml DMEM medium met 50 ml FBS, 5 ml L-glutamine, 5 ml niet-essentiële aminozuren, 5 ml natrium pyruvaat, 500 ul β-Mercaptoethanol.
3. Bereid invriesmedium: voor 10 ml, combineer 9 ml FBS met 1 ml DMSO.
4. Bereid gelatine beklede schotels Opslaan 3-5 ml 0,1% varkensgelatine oplossing voor een T75 kolf geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende ten minste 10 min en zuig vlak voor gebruik.
5. Bereid FACS labeling medium: voor 10 ml, combineren 9,9 ml PBS met 0,1 ml FBS.
6. Voereneen genotypering PCR voor de Rosa26 m2rtTA locus: Voer reacties met Taq DNA polymerase volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik een aangepaste _{MgCl2-concentratie} van 3,5 mM en de volgende 3 primers: oIMR8052: 5 'GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC 3', oIMR8545: 5'AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT 3 ', oIMR8546: 5' GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG 3 '. Cycling omstandigheden: 94 ° C gedurende 3 min; 35 cycli van (94 ° C gedurende 30 seconden, 65 ° C gedurende 1 min, 72 ° C gedurende 1 min); 72 ° C gedurende 2 min; houden op 12 ° C. Verwachte product grootte: 650 bp voor wild-type allel en 340 bp voor het mutante allel.
7. Voer een genotypering PCR voor de collageen-StemCa / OKSM locus: Voer reacties met Taq DNA polymerase volgens de instructies. Gebruik een gemodificeerde _{MgCl2-concentratie} van 2,5 mM en de volgende primers 3: col / FRT-B: 5 'CCCTCCATGTGTGACCAAGG 3', col / frtA1: 5 'GCACAGCATTGCGGACATGC 3', col / frtC1: 5 'GCAGAAGCGCGGCCGTCTGG 3 '. Cycling omstandigheden: 95 ° C gedurende 1 min: 2 cycli van (94 ° C gedurende 30 seconden, 70 ° C gedurende 45 seconden), 6 cycli (94 ° C gedurende 30 seconden, 68 ° C gedurende 45 seconden) en 30 cycli van (94 ° C gedurende 20 seconden, 60 ° C gedurende 1 min); 72 ° C gedurende 5 min; houden op 12 ° C. Verwachte product grootte: 331 bp voor wild-type allel en 551 bp voor het mutante allel.
8. Voer alle centrifugatiestappen bij 400 xg gedurende 3 min bij 4 ° C.

2 Generatie van muis embryonale fibroblasten

1. Voer een getimede paring tussen een dier van de OKSM stam met een lid van het andere geslacht van de m2rtTA stam. Harvest embryo's op embryonale dag 13,5 bij het ruimen van de moeder en het verwijderen van de baarmoeder hoorn. Voorafgaand aan verwijdering van de baarmoeder hoorn, spuit de buikstreek met een 80% ethanoloplossing, microbiële contaminatie te voorkomen.
2. Breng de baarmoeder hoorn een 10 cm weefselkweek schotel met 10 ml steriel fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Gebruik gesteriliseerd chirurgische kwaliteit schaar om de uterushoorn in stukken met een embryo (zie figuur 3A, B).
3. Gebruik een dissectie microscoop (ideaal gelegen op een weefselkweek kap) en gesteriliseerde tang om voorzichtig te verwijderen van de baarmoeder envelop en de extra-embryonale vliezen rond elk embryo. Breng elk embryo een afzonderlijk 10 cm schaal met 10 ml PBS.
4. Ga door verwijderen van de embryo hoofd, ledematen, staart en inwendige organen (hart, lever, darm etc.) met de tang (zie figuur 3C). Breng het hoofd van de embryo's in een 1,5 ml buis en vries beneden zodat het kan worden gebruikt voor genotypering indien nodig.
5. Transfer romp van de embryo's in een lege 10cm plaat en maken gebruik van twee chirurgische mesjes voor het embryo blad voor de mond gedurende 2 minuten. Voeg 200 ul trypsine / EDTA oplossing bovenop het gehakte embryo en incubeer gedurende 3-5 minuten bij kamertemperatuur. Verder hakken eens 2 minuten, voeg 2 ml MEF media in activeren trypsine, en vervolgens over te dragen in een 15 ml buis.
6. Gebruik een pipet 1.000 III verder mechanisch dissociëren het weefsel door voorzichtig pipetteren. Over te dragen aan een gelatine gecoate 10 cm schotel en voeg een extra 10 ml van MEF media. Opmerking: Zowel normoxische en hypoxische incubators kan gebruikt worden voor cultuur, zie discussie voor meer informatie.
7. Na 24-48 uur de plaat dicht moet worden bedekt met MEFs.
8. Alternatief kunnen de cellen dan worden verder vermeerderd of beneden bevroren. Voor het invriezen van cellen, verwijder de cultuur media, spoel de schaal met 10 ml PBS om sporen van media en overlay verwijderen met 3 ml trypsine / EDTA-oplossing. Incubeer gedurende 3-5 minuten bij 37 ° C, inactiveren trypsine digestie door het toevoegen van 5 ml van MEF media en overbrengen in een 15 ml centrifugebuis. Spin down en resuspendeer de pellet in 3 ml bevriezing media. Transfer naar 3 cryovials en neer te bevriezen in een cel bevriezing container.

3 herprogrammeren van MEF

ove_content "> NB: Pellet cellen door centrifugatie bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en gebruik normoxische weefselkweek incubators voor herprogrammering Het kan gunstig zijn om afleiden en vergroten MEFs onder hypoxische omstandigheden (5% zuurstof, zie bespreking voor meer gegevens. ).

1. Snel ontdooien lage passage cryovial (P0-P1, 2-3 miljoen cellen) in een waterbad (37 ° C) en breng het in een buis met 10 ml voorverwarmde MEF media. Pellet cellen, resuspendeer in 12 ml verse MEF media, over in een gelatine gecoate T75 cultuur vat, en laat de cellen om te herstellen voor 24-48 uur voordat u verder gaat. Opmerking: MEF kan ook direct na afleiding worden gebruikt.
2. Na verwijdering van kweekmedia, wassen MEFs met PBS en cellularize door bedekken met een trypsine / EDTA-oplossing (3 ml gedurende 3-5 minuten bij 37 ° C). Quench trypsine door toevoeging van 5 ml van MEF media en cellen verder dissociëren door voorzichtig mengen met een pipet 10 ml. Bepaal het aantal cellen met een hemocytometer.
3. Voor reprogramming experimenten zaad MEFs op gelatine beklede T75 kolven bij dichtheden van 6,7 x 10 ³ cellen / cm ² (~ 0.5 miljoen cellen per kolf) in iPSC media die 2 ug / ml doxycycline. Zie tabel 1 betrekking seeding aanbevelingen circa 2 miljoen herprogrammering tussenproducten voor elk tijdstip te verkrijgen. Opmerking: herprogrammeren begint met de toevoeging van doxycycline (2 ug / ml) aangevuld medium
4. Voor de eerste 6 dagen vervangen media elke dag vers doxycycline iPSC aangevuld medium (12 ml medium per T75 fles). Voorbij dit punt media verlengen dagelijks als er hoge celaantallen. Het dubbele van het volume van de cultuur als media veranderingen slechts om de andere dag kan worden uitgevoerd.
5. Oogst herprogrammering tussenproducten op de vereiste tijdstippen (suggestie: Dagen 3, 6, 9, 12) door media, spoelen met geschikt volume PBS (10 ml voor een T75 kolf) en bedekken met trypsine-EDTA-oplossing (3 ml van een T75 fles). Incubategedurende 3-5 minuten bij 37 ° C en doven door het toevoegen van 5 ml iPSC media gevolgd door voorzichtig pipetteren.
6. Telling celsuspensie met een hemocytometer (zie hierboven), pellet door centrifugeren, zuig de supernatant en resuspendeer cellen in 10 ml PBS om alle sporen van trypsine te verwijderen. Pellet cellen opnieuw, aspireren supernatant en ga verder met stap 4.1 van de herprogrammering tussenproducten isoleren. Opmerking: Cellen ondergaan herprogrammering kan gecryopreserveerd en ontdooid FACS isolatie in een later stadium.
7. Om volledig geherprogrammeerd iPS culturen te vestigen, groeien cellen in-DOX gratis iPSC media voor een verdere 4-7 dagen. Opmerking: herprogrammeren succesvol kweken wordt een groot aantal kolonies op dag 12 bevatten (zie figuur 4). Gedurende deze tijd zal afwijkende iPS cellen die moeten nog OKSM uitdrukking verdwijnen.
8. Als alternatief voor de resterende volledig geherprogrammeerd iPS culturen uitdragen: aanvankelijk, zaad bestraalde MEF bij een dichtheid van 15 x 10 ³ cellen / cm ² in 12 ml van iPSC media op een gelatine gecoate T75 kolf op een dag of 6 uur voorafgaand aan de experimenten.
9. Vervolgens cellularize iPS celculturen door het verwijderen van media, spoelen de T75 kolf met 10 ml PBS, bedekken met 3 ml trypsine-EDTA-oplossing en incuberen gedurende 3-5 minuten bij 37 ° C. Quench trypsine door toevoeging van 5 ml iPSC media gevolgd door voorzichtig mengen, overbrengen naar een 15 ml conische buis, draai af en vervolgens geresuspendeerd in 10 ml iPS media.
10. Breng 500 pi van de celsuspensie op de bestraalde MEF (T75 fles) en laat de kweken groeien gedurende 4-5 dagen. Opmerking: Gevestigde iPS culturen kunnen gecryoconserveerd of worden gebruikt voor experimenten. Klonale cellijnen kunnen worden verkregen door het uitkiezen iPSC individuele kolonies onder een stereomicroscoop ^22.
11. Cryo behouden samenvloeiende iPSC culturen, zoals beschreven in 2.8 voor MEF.

4 Antibody Labeling

1. Resuspendeer celpellets van herprogrammering culturen, zoals bereid in paragraaf 3, inFACS labeling medium aangevuld met antilichamen (anti-Thy-1.2 Pacific Blue 1: 400, anti-SSEA-1 biotine 1: 400 en anti-EpCAM Fitc 1: 400). Gebruik 200 ul aangevuld etikettering mix per 5.000.000 cellen en incubeer op ijs.
2. Na 10 min tik zachtjes de buis om de cellen te resuspenderen en incubeer gedurende een extra 10 minuten op ijs. Voeg 10 ml koud PBS per buis en spin down.
3. Voor elke buis te worden gemerkt bereiden 200 ui labeling medium aangevuld met 1 ul streptavidine-PeCy7 (1: 200) per 5.000.000 cellen. Wanneer cellen gepelleteerd voorzichtig zuig het supernatant en resuspendeer in een geschikt volume van labeling medium aangevuld met Streptavidine-PeCy7.
4. Houd cellen op ijs gedurende 10 minuten, tikt u op om mengen, incubeer gedurende nog eens 10 minuten op ijs, voeg 10 ml koud PBS per buis, spin down en zuig supernatant.
5. Resuspendeer celpellets in labeling media gesupplementeerd met propidium jodide (PI) (2 ug / ml) bij ongeveer 1 x 10 ⁷ cellen / ml. Verwijder celklonten door het passeren van de suspensie door een 70 pm zeef. Transfer cellen om een ​​geschikte FACS buis en bewaar ze op ijs.
6. Maak afzonderlijke monsters met afzonderlijke antilichamen (anti-Thy-1.2, anti-SSEA-1 en anti-EpCAM). OPMERKING: Deze zijn nodig om de kleur compensatie in de drie kanalen gebruikt in de analyses uit te voeren. Bovendien zijn ongelabelde cellen nodig om spanningen en poorten voor het sorteren. Idealiter iPS cellen worden gebruikt voor compensatie: voorraden van 0,5-1 x 10 ⁶ iPS cellen gehandhaafd op bestraalde MEF worden opgeslagen in cryovials in vloeibare stikstof. De aanwezigheid van MEFs is essentieel om een ​​signaal in de Thy-1.2 kanaal te komen.
7. Ontdooi een cryovial van iPS cellen zoals beschreven voor MEF (hoofdstuk 3). Na centrifugatie wordt resuspendeer cellen in 800 gl labeling buffer en 200 ul van dit monster gereserveerd als ongelabelde controle.
8. Gebruik de overblijvende cellen als compensatie controles. Verdeel cellen tussen drie buizen van 15 ml en voeg antilichamenals volgt: Pacific Blue compensatieregeling: voeg 0,5 pl van de anti-Thy-1.2 Pacific Blue antilichaam. FITC compensatie tube: voeg 0,5 pl van de anti-EpCAM antilichaam FITC. Pe-Cy7 compensatieregeling: 0.5 ul van de SSEA-1 anti-biotine antilichaam.
9. Houd cel-antilichaam monsters op ijs gedurende 10 minuten, meng door te tikken en incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
10. Spoelmonsters met 10 ml koud PBS om ongebonden antilichaam te verwijderen, draaien cellen af ​​en zuig de supernatant. Resuspendeer celpellets in 200 ui FACS labeling media.
11. Voor anti-SSEA-1-biotine gelabelde monsters, voeg een Streptavidine-PeCy7 conjugaat (1 gl per 200 gl cellen). Label cellen zoals beschreven voor primaire antilichaam (SSEA-1-biotine).
12. Haal alle monsters waaronder de ongelabelde controle door een 70 urn zeef en voeg PI (2 ug / ml). Transfer cellen FACS buizen en blijf op ijs totdat vereist.

5 FACS Isolatie van Intermediates

OPMERKING:Cellen worden gesorteerd met behulp van een Fluorescence Activated Cell Sorter met 405 nm, 488 nm en 560 nm excitatie lasers en 100 urn nozzle.

1. Stel spanningen voor voorwaartse en zijwaartse verstrooiing waardoor de celpopulatie goed zichtbaar. Teken een hek rondom cellen zoals in figuur 5A om vuil sluiten. Opmerking: het bedoelde gebruik van spanningen op de cel sorter kan complex zijn en vereist een ervaren operator FACS.
2. Gebruik voorwaartse verstrooiing (FSC) hoogte versus FSC gebied om aggregaten (figuur 5B) uit te sluiten.
3. Visualiseer de PI-kanaal versus FSC tot poort in op de PI negatieve levende cellen (figuur 5C).
4. Gebruik de ongelabelde cellen aan de spanningen voor de fluorescerende kanalen PB FITC / GFP, Pe-Cy7 passen. Idealiter plaats de celpopulatie aan het ondereinde van het desbetreffende kanaal.
5. Stel poorten met het ongelabelde controle cellen, zoals weergegeven in figuur 6A, B om sub fractie de herprogrammering cultgelen in dag 3, 6 en 9 populaties: SSEA-1 / Thy-1.2 + cellen; SSEA-1 / Thy-1.2-cellen; en de herprogrammering tussenproducten SSEA-1 + / Thy-1.2-cellen.
6. Verder op te splitsen van de Dag 9 SSEA-1 + / Thy-1.2-fractie met behulp van de Pe-Cy7 versus Fitc vlek; trekken hekken rond de SSE-a1 + / EpCAM + cellen en de SSEA-1 + / Epcam- cellen. Stel poorten met de ongelabelde controle cellen zoals getoond in figuur 6C, D.
7. Prefill geschikte collectie buizen met iPS cel media (1-2 ml) voor het sorteren van de gewenste subpopulaties (zie Figuur 7 voor representatieve FACS profielen voor MEF, Dag 3 / Dag 6 / Dag 9 / Dag 12 culturen en iPS cellen).
8. Voeren FACS sortering volgens produceert protocol.
9. Na FACS isolatie indienen cellen moleculaire profilering (RNA / eiwit-extractie, chromatine immunoprecipitatie DNA methyloom analyse etc.). Alternatief kunnen de verschillende celfracties gekweekt.

Resultaten

Na dissectie, disaggregatie en plating van een E13.5 muis embryo wordt een 10 cm schaal wordt naar confluentie bereiken in ongeveer 1 tot 2 dagen. In dit stadium is het normaal dat de cultuur om wat aanhangende stukjes weefsel die niet goed zijn cellularized bevatten. Deze verdwijnt na passage.

Bij doxycycline inductie, het herprogrammeren van MEF ondergaan verschillende morfologische veranderingen. Rond dag 6 dienen de snelle kolonie-achtige vlekken beginnen te ontstaan ​​(Figuur 4C). Deze zullen blijven groeien in omvang bij nader cultuur (zie figuur 4D, E). Een goede herprogrammering experiment moet leiden> 500 kolonies per T75 die aanvankelijk werd geënt met 5 x 10 ⁵ cellen (Figuur 4E). Opgericht iPS culturen bezitten karakteristieke koepelvormige kolonies en moet meestal verstoken van gedifferentieerde cellen (Figuur 4F) zijn. Af en toe extra passage van iPS cultures kan worden verplicht om ongedifferentieerde / gedeeltelijk geherprogrammeerd cellen te verwijderen; Een confluente fles cellen kunnen worden gesplitst in een verhouding van 01:10 op een feeder-laag van bestraalde MEFs.

Zoals hierboven vermeld, zijn morfologische en moleculaire veranderingen tijdens herprogrammering weerspiegeld door veranderingen in de FACS profielen Thy-1.2, SSEA-1 en uiteindelijk EpCAM (zie figuur 7A-F). Zoals eerder ^12,15 gemeld, terwijl MEF zijn overwegend positief voor Thy-1.2 en negatief voor de andere markers, Dag 3 culturen al kijken duidelijk anders. Een groot deel van de cellen begonnen met neerwaarts reguleren van de expressie van Thy-1.2 en een zeer klein deel van deze Thy-1.2 negatieve cellen positief voor SSEA-1, het werkelijke herprogrammering tussenproduct voor dit tijdstip wordt. Het aantal herprogrammering tussenproducten die kunnen worden geëxtraheerd uit Dag 3 culturen zeer onvoorspelbaar als het percentage van SSEA-1 + / Thy-1.2-meestal in een bereik tussen 1-10% van viable cellen. Op dag 6 en 9 een verhoogd percentage van SSEA-1 +-cellen, gewoonlijk ruim boven 10%, kan worden gedetecteerd. Rond dag 12 een subset van SSEA-1 positieve cellen kan worden vastgesteld dat positief label voor EpCAM. Dag 12 culturen, zoals Dag 3 culturen vertegenwoordigt een knelpunt bij de zuivering van tussenproducten, als het percentage SSEA-1.2 + / EpCAM + cellen is variabel en meestal vallen in het bereik van slechts 2-4% van alle levende cellen. Het verwachte aantal herprogrammering tussenproducten weergegeven in tabel 1 geldt slechts als een ruwe benadering. Opgericht bonafide iPS cellijnen zal sterk positief zijn voor SSEA-1 en EpCAM.

Figuur marker 1 Surface veranderingen tijdens de herprogrammering pad: Neerregeling van fibroblast identity marker Thy-1.2 wordt gevolgd door een up-regulatie vanSSEA-1. De overgang van een subset van SSEA-1-positieve cellen in de richting van een pluripotente toestand wordt aangegeven door overname van EpCAM- rond dag 12. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2 Schematische weergave van de herprogrammeerbare muismodel. M2rtTA expressie onder controle van de alomtegenwoordige actieve Rosa26 locus in aanwezigheid van doxycycline (DOX) de m2rtTA eiwit bindt aan een tetracycline afhankelijke promoter (tetOP) en collageen 1A1 (COL1A1) locus resulteert in de expressie van de vier-factor cassette. Twee bicistronische cassettes zijn verbonden door een interne ribosoom intreedlocatie (IRES). Open leesramen voor Oct-4 / Klf-4 en Sox-2 / c-Myc zijn fu sed door zelf-splitsende F2A en E2A- sequenties, respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3 Embryo dissectie: (A) Transfer baarmoedertak in een 10 cm schaal gevuld met 10 ml PBS en (B) in stukken met een embryo. (C) met behulp van een tang te bevrijden van de embryo's van extra embryonaal weefsel en verwijder het hoofd, de ledematen, de staart en de inwendige organen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

les / ftp_upload / 51728 / 51728fig4highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 4 morfologische veranderingen gedurende de herprogrammering. Kolonie-achtige vlekken zichtbaar worden in de culturen die vanaf dag 6. Bonafide iPSCs worden gekenmerkt door een overkoepelde gevormde morfologie. (A) Dag 0 / MEF, (B) Dag 3, (C) Dag 6, (D) Dag 9, (E) Dag 12, (F) iPS celcultuur. Schaalbalk:. 200 pm Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5 Basic FACS setup. (A) Uitsluiten puin met Side versus voorwaartse verstrooiing Area vlek. (B)Aggregaten van niet-puin te sluiten door gating op enkele cel populatie met Forward Scatter omgeving versus Forward Scatter High vlek. (C) Uitsluiten dode cellen van enkele cel populatie door gating op PI laag evenementen met PI kanaal versus Forward Scatter Area vlek. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6 Gating. (A, B) De ongelabelde controlecellen ingesteld poorten voor Thy-1.2 + / SSEA-1-cellen, Thy-1.2-/ SSEA-1-cellen en Thy-1.2-/ SSEA-1 + cellen. (C) Gebruik de ongelabelde regelcellen om poorten voor EpCAM- positieve en EpCAM- negatieve cellen. (D) SSEA-1 + / Thy-1.2-cellen kunnen worden gescheidenin een EpCAM positieve en in een EpCAM negatieve bevolking. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 7 Thy-1.2 versus SSEA-1 FACS vlekken in verschillende stadia van de herprogrammering proces. (A) Dag 0 / MEF, (B) Dag 3, (C) Dag 6, (D) Dag 9, (E) Dag 12, (F) iPS celcultuur.

Tabel 1 Aanbevolen zaaien dichtheid, fles nummer en de verwachte uitkomst voor P1 MEF van een embryo heterozygoot voor OKSM en m2rtTA. Klik here aan een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Dag	Aantal T75 kolven gezaaid op dag 0	Totaal aantal Ssea1 + cellen na FACS	Totaal aantal Ssea1 + / EpCAM + cellen na FACS
3	8	2 miljoen
6	4	2 miljoen
9	4	2 miljoen
12	10	10 miljoen	2 miljoen

Discussie

Om met succes te herprogrammeren MEF in iPS cellen en herprogrammering tussenproducten zuiveren bij hoge hoeveelheid is het essentieel om bewust te zijn van de factoren die een invloed hebben op de algehele efficiëntie hebben. Vooral de partij FBS gebruikt iPS media aanvulling kan een nadelig effect hebben. In het algemeen positieve ervaringen waren met Embryonale stamcellen (ES) cellen gekwalificeerde FBS maar batch testen van sera van verschillende leveranciers kan een goedkoper alternatief te identificeren.

Een andere factor is dat de gevolgen voor herprogrammering efficiëntie is het genotype van MEF ^15,20. Hoewel MEF afgeleid van heterozygote muizen (Het) voor zowel de OKSM en m2rtTA locus kan herprogrammeren, homozygousity aan een of beide loci resulteert in hogere rendementen herprogrammering. Inderdaad, MEF afkomstig van nakomelingen van OKSM en m2rtTA kruisen tonen een stijging van de herprogrammering efficiëntie in de volgende volgorde (OKSM / m2rtTA): het / het tabel 1 zijn voor haar / het dier). In het zeldzame geval van een mannelijke homo / homo dier wordt vastgesteld, kan een harem paring met meerdere m2rtTA vrouwtjes worden opgezet. Alle nakomelingen van deze kruisingen worden Het / homo voor de OKSM / m2rtTA loci, respectievelijk. Bovendien is de snelle genotypering worpen aanbevolen als grotere nesten worden verkregen bij gebruik van jongere muizen gefokt (6-15 weken oud).

Bovendien is het gebruik van lage passage MEF voor herprogrammering benadrukt ^23. Als MEF werden afgeleid en uitgebreid in een normoxisch weefselcultuurincubator raden we alleen gebruik maken van deze cellen tot passage 2 Echter, als de experimentator heeft toegang tot een laag zuurstofgehalte incubator (5% zuurstof) voor de afleiding en de uitbreiding van MEF, passage nummers liefst 3 nog steeds goede resultaten ²³ opleveren.

Indien de onderzoeker ondervindt problemen met herprogrammering, zoals uiteengezet, de meest waarschijnlijke verklaringen hoge passage nummers bij de dox Bovendien onjuiste genotype van de muizen en het gebruik van FBS dat is niet bevorderlijk voor iPS celgeneratie. In zeldzame gevallen waargenomen dat MEFs niet konden herprogrammeren zelfs onder ideale omstandigheden. In deze gevallen spontaan de novo deletie binnen open leesraam de m2rtTA werd geïdentificeerd als de onderliggende reden.

Deze methode is met succes aangepast aan SSEA-1 + tussenproducten via magnetische celisolatie (MACS) extract. Er is een duidelijk voordeel in tijd met MACS echter de zuiverheid SSEA-1 + celpopulaties 'wordt verlaagd tot 80-90%, in plaats van meer dan 95%, die afhankelijk van het type experiment de cellen bestemd kunnen opleveren Een probleem. Aldus werd een optie is om MACS gebruiken verrijken SSEA-1 + cellen gevolgd door FACS voor zuiverheid en / of breuk te verhogen in SSEA-1 + / + EpCAM en SSEA-1 + / Epcam- cellen.

"> Terwijl de iPS cellen die door de geschetste protocol en muizenmodel is aangetoond dat pluripotent zijn en effectief bij aan alle weefsels van chimere dieren ^15,20, een verlaagd vermogen om embryo volledig uit deze iPS cellen via tetraploïde complementatie produceren geweest ²⁴ aangetoond. Aberrant methylatie patronen op Dlk-DIØ3 gencluster geïdentificeerd als de oorzaak ^24. echter toevoeging van ascorbinezuur in een concentratie van 50 ug / ml aan de media tijdens herprogrammering tetraploïde complementatie bevoegde iPS cellen ²⁴ produceren. Houd er rekening mee dat een alternatief herprogrammeerbare muismodel ontwikkeld om de herprogrammering factoren op een andere stoichiometric uiten kan tetraploïde bevoegde iPS cellen te produceren, zelfs in de afwezigheid van ascorbinezuur behandeling ^25. Echter, in onze handen cellen van deze stam herprogrammeren tegen aanzienlijk lagere frequentie in vergelijking de hierin gebruikte muis modusl.

De in dit manuscript beschreven methodologie laat de scheiding van herprogrammering tussenproducten van de vuurvaste grootste deel van de bevolking en moet worden gezien als waardevol instrument om te ontleden en te begrijpen van de herprogrammering proces, het verwijderen van de vorige beperkingen van het hebben van een unfractioned bevolking gebruikt voor profiling (bijvoorbeeld, hoge signaalruis van de vuurvaste cellen). De antilichaam combinatie hierin beschreven maakt isolatie van tussenproducten van muizencellen met hoge zuiverheid, maar het is mogelijk dat aanvullende celoppervlak markers worden ontdekt in de toekomst waarmee tussenproducten verkregen bij nog hogere zuiverheid. Let SSEA-1 expressie is geen kenmerk van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen en daarom dit protocol kan niet worden gebruikt herprogrammering cellen van menselijke oorsprong. Concluderend kan herprogrammering tussenproducten eenmaal geïsoleerd met de beschreven werkwijze worden toegepast voor moleculaire analyses waaronder expressie profiling, chromatine immunoprecipitatie methyloom analyse en eiwit assays.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anti-mouse CD90.2 (Thy1.2) Pacific Blue	eBioscience	48-0902-82
Anti-Human/Mouse SSEA-1 Biotin	eBioscience	13-8813
Streptavidin PE-Cy 7	eBioscience	25-4317-82
Anti-Mouse CD326(Epcam) Fitc	eBioscience	48-5791-82
Sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA)	Life Technologies	11140-050
Embryonic Stem Cell qualified Foetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	10439024
Trypsin-EDTA (0.25%)	Life Technologies	25200-056
GlutaMAX	Life Technologies	35050-070
β-Mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023
DMSO (Dimethyl Sulfoxide)	Sigma-Aldrich	D8418
Penicillin/streptomycin	Life Technologies	15140
Propidium Iodide solution (PI)	Sigma-Aldrich	P4864-10ML
Gelatine from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890
Doxycyclin hyclate	Sigma-Aldrich	33429-100MG-R
Leukemia Inhibitory Factor (LIF)	Millipore	ESG1107
DMEM High Glucose	Life Technologies	11960-044
DPBS (Dulbecco's phosphate buffer saline)	Life Technologies	14190-144
KnockOut DMEM	Life Technologies	10829-018
Irradiated MEFs	Life Technologies	S1520-100
75-cm2 Tissue culture flasks	Corning/BD Bioscience	430641
15-ml centrifuge tubes	Corning/BD Bioscience	430791
50-ml centrifuge tubes	Corning/BD Bioscience	430829
Disposable surgical blades	Clifford Hallam	SM0501
Cryogenic vials	Corning/BD Bioscience	430487
70 µm Cell strainer	BD Bioscience	352340
Taq DNA Polymerase	Life Technologies	10342-020