Protocol voor Biofilm Streamer Vorming in een microfluïdische apparaat met micro-pijlers

Samenvatting

Protocollen voor de studie van biofilmvorming in een microfluïdisch apparaat dat poreuze media nabootst, worden besproken. Het microfluïdische apparaat bestaat uit een array van micro-pillaren en de biofilmvorming door Pseudomonas fluorescens in dit apparaat wordt onderzocht.

Samenvatting

Verschillende bacteriële species bezitten het vermogen om te hechten aan oppervlakken en koloniseren ze in de vorm van dunne films genaamd biofilms. Biofilms die groeien in poreuze media zijn voor verschillende industriële en ecologische processen, zoals de behandeling van afvalwater en _CO2 vastlegging relevant. We gebruikten Pseudomonas fluorescens, een Gram-negatieve aërobe bacterie, om biofilmvorming in een microfluïdische apparaat dat werkt poreuze media onderzoeken. De microfluïdische inrichting bestaat uit een array van micro-posten, die zijn vervaardigd met behulp van zachte lithografie. Vervolgens biofilmvorming in deze apparaten met stroom werd onderzocht en we tonen de vorming van biofilms draadvormige bekend als streamers in ons apparaat. De gedetailleerde protocollen voor de fabricage en assemblage van microfluïdische apparaat worden hier voorzien, samen met de bacteriecultuur protocollen. Gedetailleerde procedures voor experimenten met de microfluïdische apparaat worden ook gepresenteerd samen met de representatieveresultaten.

Inleiding

Onlangs toonden we aan bacteriële biofilmvorming dynamiek in een microfluïdische apparaat dat poreuze media ¹ nabootst. Bacteriële biofilms zijn in wezen kolonies van oppervlakte geaggregeerd bacteriën die worden omhuld door extracellulaire polymere stoffen (EPS) ^2-4. Deze dunne films bacteriën kan vormen in bijna elke denkbare niche variërend van gladde oppervlakken de veel complexere habitat poreuze media. Valiei et al. ¹ gebruikte een microfluïdische inrichting met een reeks micro-pijlers te simuleren een poreuze media structuur en bestudeerd biofilmvorming in deze inrichting als functie van de stroomsnelheid. Zij vonden dat in een bepaalde flow regime, draadvormige biofilms bekend als streamers begon te ontstaan ​​tussen de verschillende pijlers. Wimpels kan worden vastgebonden op een of beide uiteinden aan vaste oppervlakken, maar de rest van de structuur wordt gesuspendeerd in vloeistof. Streamer vorming begint meestal na een eerste laag van biofilm heeft gevormd en het formaation kan de evolutie van biofilm langdurige dicteren dergelijke complexe habitats. Onlangs hebben een aantal onderzoekers de dynamiek van de streamer vorming onderzocht. Yazdi e.a.. ⁵ bleek dat de streamers in wervelende stromen afkomstig van een oscillerende luchtbel kan vormen. In een ander experiment, Rusconi e.a.. ⁶ onderzochten het effect van het kanaal kromming en geometrie kanaal op de vorming van streamers. Zij vonden dat de streamers in gebogen secties microkanalen kunnen vormen en streamer morfologie heeft betrekking op motiliteit. Recent onderzoek heeft aangetoond dat streamers brede vertakkingen in verschillende natuurlijke en kunstmatige scenario's kunnen hebben als ze kunnen fungeren als voorlopers van de vorming van volwassen structuren in poreuze interfaces, leiden tot een snelle en katastrofisch biofilm proliferatie in een biomedische systemen, en ook aanzienlijke flow veroorzaken structuur interactions, etc ^1,7-9.

Biofilm streamers vormen i vaakn complexe habitats zoals poreuze media. Inzicht biofilmgroei in poreuze media omgeving is verschillende ecologische en industriële processen relevante zoals biologische afvalwaterzuivering ^10, onderhouden goed boring integriteit in situaties zoals _CO2 afvang ¹¹ en verstopping van poriën in de bodem ^12. Waarnemen biofilmvorming in dergelijke complexe habitats vaak moeilijk als gevolg van de ondoorzichtigheid van poreuze media. In dergelijke situaties kan microfluidics gebaseerd poreuze media platforms blijken uiterst voordelig als zij toestaan ​​dat real-time en in situ monitoring. Een ander voordeel van microfluïdische is de mogelijkheid om meerdere bioreactoren bouwen op een bio-microfluidic platform en tegelijkertijd zorgen voor online monitoring en / of opname van sensoren. De flexibiliteit meerdere laboratoriumexperimenten uitvoeren in een apparaat en het vermogen om significante relevante gegevens te verzamelen voor nauwkeurige statistische analyse is een belangrijke bijwoordantage van microfluïdische systemen ^13,14.

In de context van de bovenstaande discussie, zou begrijpen streamer vorming dynamiek in een poreuze media milieu gunstig verscheidene toepassingen. In deze studie hebben we de ontwikkeling van het protocol voor het onderzoek streamer vorming in een apparaat dat bootst poreuze media. Fabricage van de microfluïdische platform nodige maatregelen voor celcultuur en experimenten beschreven. In onze experimenten werd de wildtype bacteriële stam van Pseudomonas fluorescens P. toegepast. fluorescens, nature in de bodem, speelt een belangrijke rol bij het ​​handhaven bodemecologie ^15. De bacteriestam werkzaam waren genetisch gemanipuleerd groen fluorescent eiwit (GFP) constitutief.

Protocol

Voer de testprotocollen hier in de hieronder beschreven volgorde. Microfabricage protocollen voor het creëren van microfluïdische platform worden besproken in Stap 1 Stap 2 wordt de bacteriecultuur protocol (figuur 2), en Stap 3 betreft de montage van de experimentele opstelling (figuur 3). Ten slotte wordt de werkelijke experimentele stap beschreven in stap 4.

1 Chip Fabrication Procedure

OPMERKING: De juiste veiligheidsprocedures moeten worden gevolgd voor de hieronder beschreven processen. Raadpleeg de institutionele veiligheidsfunctionaris voor details.

1. Het ontwerp van de masker met een geschikte software (bijvoorbeeld L-Edit). Het kanaal ontwerp bestaat uit een hoofdgebouw micro-kanaal van de breedte 625 micrometer. Het centrale gebied van het kanaal bevat een array van micro-posten 50 micrometer diameter, afstand 25 urn elkaar (zie brief Files).
2. Print dit ontwerp op glas (5 "x 5" sodakalkglas), Die een dikte van 0,09 "heeft en bekleed met ongeveer 70 nm dikke laag chroom (Cr), maskerprocedures om een ​​fotomasker te bereiden. Gebruik AZ400K ontwikkelaar voor 1 min. Vervolgens etsen de Cr-laag met Cr etsmiddel voor ongeveer 1 min Gebruik aceton te strippen de resist en maak hem schoon met koud piranha-oplossing. (H ₂ SO ₄ en H ₂ O ₂ in een verhouding van 3: 1).
3. Fotolithografie
   1. Reinig een standaard 4 "silicium wafer chemisch met piranha-oplossing gedurende 20 minuten.
   2. Spoel de wafer met DI-water en droog het.
   3. Verwarm de wafer op een hete plaat (200 ° C gedurende 15 min).
   4. De vacht van de silicium wafer met fotolak. Hier, de positieve fotoresist AZ4620 werd spin-gecoat op een silicium wafer bij 2000 rpm gedurende 25 sec tot 12,5 urn dikke laag te verkrijgen.
   5. Verwijder het oplosmiddel door zacht bakken van de wafer op een hete plaat door drijvende de wafer gedurende 90 seconden op stikstofstroom bij 100 ° C. Dan houd het in vacuüm bij thij dezelfde temperatuur gedurende 60 sec.
   6. Plaats de wafer in een donkere doos voor 24 uur voor uitdroging.
   7. Maak de wafer aan UV-licht om het ontworpen patroon overbrengen naar de fotoresist.
   8. Dompel de wafer in fotolak ontwikkelaar oplossing (AZ400K) voor 240 sec. Spoel daarna de wafer met isopropyl alcohol en drogen door in een stroom stikstofgas.
4. ICP-DRIE (inductief gekoppeld plasma - Deep Reactive Ion ets) Proces
   1. Solliciteer DRIE etsen. Kies de gewenste etsdiepte volgens einddiepte vereist voor toestel (50 urn in dit onderzoek). Fotoresist werkt als een maskerende laag tijdens dit proces.
   2. Verwijder de resterende fotolak met aceton en het reinigen van de wafer.
5. PDMS (polydimethylsiloxaan) Gieten
   1. Gebruik trichloromethylsilane (TCMS) voor silaniseren het silicium meester mal. Giet 2 of 3 druppels trichloromethylsilane in een flacon en plaats het in een exsiccator naast desilicium meester schimmel. Laat 2-3 uur voor het silaneren proces te voltooien.
   2. In een afzonderlijke houder, meng de Sylgard 184 siliconenbasis met verharder gewichtsverhouding van 10: 1 tot PDMS bereiden. Ontgas de PDMS door het aan voorwaarden (ongeveer 2 uur) stofzuigen.
   3. Zet het silicium meester schimmel in een houder. Vervolgens giet de PDMS op silicium meester mal de PDMS stempel te vormen. Zorg ervoor dat belletjes vormen niet in het PDMS tijdens dit proces.
   4. Genezen van de PDMS gedurende 2 uur bij 80 ° C.
   5. Verwijder de PDMS stempel van de meester mal. Snij vervolgens de PDMS stempel in afzonderlijke microchips. Gebruik ten slotte een snij-kern om gaten te boren voor de inlaat (s) en de aansluiting (en).
6. Verlijmen van PDMS aan Glass
   1. Expose de cover slip en PDMS stempel zuurstof plasma gedurende 30 sec. Bond PDMS stempel op de cover slip.
   2. Om een ​​goede afdichting tussen de PDMS stempel en dekglas bereiken, hybridiseren de inrichting door deze in oven bij 70 ° C gedurende 10 minuten.

2 Bacteriële Cultuur

OPMERKING: Proper bioveiligheid protocollen moeten worden gevolgd voor Steps 2-4. Raadpleeg de institutionele veiligheidsfunctionaris voor details.

1. Bereid LB agarplaten
   1. Voeg 20 g Luria-Bertani (LB) agar (Miller) poeders en 500 ml ultrazuiver water in een 1 L kolf. Roer tot het poeder op te lossen.
   2. Steriliseren in autoclaaf bij 15 psi, 121 ° C gedurende 15 minuten.
   3. Laat de kolf op een bankje of in een waterbad in de bioveiligheid kap afkoelen tot 50-55 ° C.
   4. Voeg het antibioticum Tetracycline tot een uiteindelijke concentratie van 50 ug / ml te bereiken. Meng goed door werveling.
   5. Giet het mengsel in platen. Vul elke plaat tot 1/2 - 2/3 vol.
   6. Flame luchtbellen kort om ze pop als ze vormen. Verhard luchtbellen moeilijk bacteriekweek via spreiden.
   7. Laat de platen overnacht afkoelen bij kamertemperatuur.
   8. Wanneer ze zijn cool,zet borden terug in hun mouw, sluit de zak, label (antibiotica en datum), en bewaar bij 4 ° C.
      OPMERKING: Bedek de voorraad van de platen met aluminiumfolie, zo licht deactiveert veel antibiotica.
2. LB Broth Voorbereiding
   1. Voeg 20 g Luria-Bertani (LB) bouillon (Miller) poeders en 1 L van ultrapuur water in een kolf. Roer tot het poeder op te lossen.
   2. Steriliseren in autoclaaf bij 15 psi, 121 ° C gedurende 15 minuten.
   3. Laat fles op een bankje of in een waterbad in de bioveiligheid kap afkoelen tot 50-55 ° C.
   4. Voeg het antibioticum tetracycline tot een uiteindelijke concentratie van 50 ug / ml te bereiken. Meng goed door werveling.
   5. Wanneer ze afgekoeld zijn, plaatst u de gelabelde fles bij 4 ° C.
      OPMERKING: Bedek de fles met aluminiumfolie, zo licht deactiveert veel antibiotica.
3. Cultuur Bacteriën op een LB Agar Plate (Dit protocol maakt gebruik van Pseudomonas fluorescens)
   1. Neem de bacteriële voorraad uit de diepvries (-80 °; C) en plaats het op het ijs.
   2. Plaats de -80 ° C bacteriële voorraad en een LB-agar plaat in een bioveiligheid kap.
   3. Streak de bacteriestam op een LB-agar plaat in een zigzag patroon. Bedek de agar plaat en incubeer bij 30 ° C 's nachts. Tenslotte worden opgeslagen plaat in de koelkast bij 4 ° C.
4. Bereid de Bacteriële Solution (S1)
   1. Giet 50 ml LB-bouillon-medium naar een kolf geautoclaveerd. Voer deze bewerking in een bioveiligheid kap.
   2. Transfer een enkele bacteriële kolonie van de LB-agar plaat aan de kolf. Deze operatie moet ook worden uitgevoerd in een bioveiligheid kap.
   3. Plaats de kolf in een shaker incubator bij 30 ° C en 150 rpm gedurende voldoende tijd (4 uur).
5. Bereid de Verdun Bacteriële Solution (S2)
   1. Giet 5 ml LB-bouillon media in een steriele plastic buis.
   2. Verdun S1 door mengen met LB-bouillon media. Vervolgens geschud oplossing. Verdun de oplossing te komen van de gewenste optischeal dichtheid (OD gemeten bij 600 nm = 0,1).
      OPMERKING: Biofilm experimenten doorgaans OD-waarden in deze omgeving in dienst.

3 Bereid de opstelling van de proef

1. Met een pincet verbinding flexibele kunststofbuizen (0,20 "ID) in de inlaat (s) en uitlaat (s) van de microchip. De inlaten en uitlaten zijn vooraf geboord in de PDMS deel van de microchip (stap 1.5.5). In dit onderzoek , de microchip bestaat uit twee inhammen en een stopcontact.
2. Vul de spuit (en) met bacteriële oplossing (S2-oplossing) en verwijder alle luchtbellen in de spuit (en).
3. Sluit de spuit tip (s) (30 G 0.5 "stompe naald) in de inlaat buis (s). Sluit vervolgens afvoerbuis (s) op de verpakking te verspillen.

4 Voer het Experiment

1. Sluit de spuit (en) aan de spuit tip (s).
2. Plaats en fix spuit (en) op de injectiepomp. Plaats dan de microchip onder een optische microscoop met objectieven van desired vergroting (bijvoorbeeld 40X). Bedek de microchip met een levende cel kamer inrichting een constante temperatuur omgeving voor bacteriegroei (30 ° C voor P. fluorescens) handhaven.
3. Stel de pomp naar de gewenste stroomsnelheid niveau (bijvoorbeeld 10 ul / uur) en initiëren fluïdum pompen.
4. Zodra bacteriën worden aangebracht in de kamer, is de vorming van biofilm ook begonnen. Biofilmvorming en rijping zich meestal over een periode van enkele uren of zelfs dagen. Observeren en foto's maken van biofilm groei door de microscoop.

Resultaten

Met behulp van bovenstaande microfabricage protocol werd een PDMS microfluïdische gebaseerd is geconstrueerd. Figuur 1 toont de scanning elektronenmicroscoop (SEM) beelden van de PDMS apparaat. Figuur 1a toont de ingangssectie van de inrichting. Een vork-achtige ingang wordt gecreëerd om de druk het hoofd te egaliseren over het apparaat. Verdere SEM beeldvorming toonde ook aan dat de pilaar muren bijna verticale (Figuur 1b). De gekweekte bacteriële oplossing (fi...

Discussie

We hebben laten zien een eenvoudige microfluïdische apparaat dat poreuze media nabootst voor het bestuderen van biofilm ontwikkeling in complexe habitats. Er zijn verschillende belangrijke stappen die de uitkomst van de experimenten bepalen. Zij omvatten geometrie apparaat. Terwijl de paal geometrie kan variëren, voldoende porie-ruimte voor streamers te vormen noodzakelijk. Bovendien Valiei et al. ¹ hebben aangetoond dat streamer vorming treedt alleen in bepaalde Luchtdebiet. Bij een flow lager dan e...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Fluorescente microscoop	Nikon
LB agar	Fisher	BP1425-500	suspensie 40 g in 1 L gezuiverd water
LB bouillon	Fisher	BP1427-500	suspensie 20 g in 1 L gezuiverd water
Bioveiligheidskast	Microzone Corporation
Petrischaal	Fisher	875712	steriele 100 mm x 15 mm polystyreen petrischaal
Incubator shaker	New Brunswick Scientific		Excella E24 incubator shaker serie
50 ml gesteriliseerde centrifugeerbuis	Corning	430828	Polypropyleen RNase-/DNase-vrij
Tetracycline vrije basis	MP Biomedicals	103012	50 μg/ml
SYLGARD 184 silicon	Dow Corning Corporation	68037-59-2	Elastomeer basis en uithardingsmiddel
Positieve fotoresistor (AZ4620)
Kunststof buis	Cole-Parmer