Protocollen voor een efficiënte bereiding van homogene monsters van spintmijten, aantasting van experimentele installaties, en beoordeling van plantaardige schade, zoals vereist voor studies van planten-plaaginteractie werden ontwikkeld.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Toepassing van twee-gespot spintmijt
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De twee-spotted spint, Tetranychus urticae, is een alomtegenwoordige polyfage geleedpotige herbivoor die zich voedt met een opmerkelijk breed scala aan soorten, met meer dan 150 van de economische waarde. Het is een belangrijke plaag kas gewassen, vooral Solanaceae en Cucurbitaceae (bijvoorbeeld tomaten, aubergines, peper, komkommer, courgette) en kas sierplanten (bijvoorbeeld rozen, chrysanten, anjers), jaarlijkse veldgewassen (zoals maïs, katoen, sojabonen en suikerbieten), en in eeuwige culturen (alfalfa, aardbeien, druiven, citrusvruchten, en pruimen) 1,2. Naast de extreme polyphagy dat het een belangrijke landbouwongedierteinsect, T. maakt urticae heeft de neiging om resistent te worden tegen een breed scala van insecticiden en acariciden die worden gebruikt voor de controle 3-7.
T. urticae is een uitstekend experimenteel organisme, aangezien het een snelle levenscyclus (7 dagen bij 27 ° C)en kan gemakkelijk worden gehandhaafd op een hoge dichtheid in het laboratorium. Methoden om genexpressie (met inbegrip van in situ hybridisatie en antilichaamkleuring) assay en expressie van spint endogene genen met behulp van RNA-interferentie te inactiveren zijn ontwikkeld 8-10. Onlangs heeft de gehele genoomsequentie van T. urticae is gemeld, het creëren van een mogelijkheid om deze plaag herbivoor ontwikkelen als modelorganisme met gelijkwaardige genomische hulpbronnen die al bestaan in sommige van haar waardplanten (Arabidopsis thaliana en de tomaat Solanum lycopersicum) 11. Samen zouden deze modelorganismen inzichten in moleculaire grondslagen van planten-plaag-interacties te bieden.
Hier, een efficiënte methode voor snelle en eenvoudige verzameling van een groot aantal volwassen vrouwelijke mijten, de toepassing ervan op een experimentele waardplant, en de beoordeling van de plant schade door spint voeding worden beschreven. De gepresenteerde protocol enables snelle en efficiënte inning van honderden mensen op elk ontwikkelingsstadium (eitjes, larven, nimfen, volwassen mannetjes en vrouwtjes) die kunnen worden gebruikt voor de volgende experimentele toepassing.
Inleiding
Plant-plaaginteractie is een onderwerp van groot wetenschappelijk en economisch belang. Het werd historisch bestudeerd met behulp van zowel gewassen (zoals tomaat) en het model plant, A. thaliana. In beide gevallen kan de gevoeligheid van de installaties aan herbivoor ofwel rechtstreeks worden gemeten door middel van beoordeling van plantenfenotype na herbivoor aanval of indirect via de beoordeling van de plaag prestaties.
Directe metingen van plantaardige gevoeligheid werden eerder gebruikt voor een aantal schadelijke insect species met behulp van diverse methoden. Zo wordt herbivorie lepidopterale larven gemeten als een schatting van het gedeelte van plantenweefsel verbruikt door hetzij Plutella xylostella (diamondback moth) of Trichoplusia ni (koolspanrups) met het blote oog met behulp van een rooster 12. Ook zijn er methoden die digitale beeldvorming van bladschade met daaropvolgend kwantitatieve beeldanalyse te gebruiken. Dergelijke werkwijzen zijn gebruiktstudies van A. thaliana interactie met Frankliniella occidentalis (Californische trips) 13, Scaptomyza flava (blad-mining fruitvliegje) 14, en T. ni 15.
Indirecte metingen van planten gevoeligheid worden veel gebruikt in studies van planten-plaaginteractie. Bijvoorbeeld, de gevoeligheid van A. thaliana te perzikluis Myzus persicae herbivory wordt meestal bepaald door analyse van ongedierte vruchtbaarheid en beschrijving van het bruto morfologie van een plant na interactie 16,17. Een ander typisch indirecte indicator van A. thaliana gevoeligheid voor een plaag is een droog of nat gewicht beoordeling van de herbivoor. Deze parameter wordt vaak gebruikt om herbivorie van lepidoterans, zoals Pieris rapae (kleine witte), P. karakteriseren xylostella of T. ni op hun larvale stadia of popstadium 15,17.
Spintmijten zijn cel-inhoud feEders. -Mijt veroorzaakte schade wordt erkend als een verzameling van chlorotische plekken die variëren in kleur van wit tot lichtgroen. De gevoeligheid van een waardplant voor spint herbivorie was eerder hetzij indirect via de analyse van de spintmijt prestaties dagen geëvalueerd na besmetting 18,19, of rechtstreeks met grove morfologie van planten weken na de besmetting 18 of met een digitale beeldvorming van bladeren blootgesteld mijten dagenlang met daaropvolgend automatische beeldanalyse 19. Deze methoden werden ontwikkeld en gebruikt voor onderzoek naar interacties tussen tomatenplanten en T. urticae, en meestal gebruikt kleine aantallen spintmijten (5-15 per behandeling) die werden verzameld uit de gemengde populatie roofmijten en werden op het bladoppervlak geplaatst met behulp van een zachte borstel. Echter, deze methoden zijn niet geschikt voor studies waarbij grotere aantallen mijten moeten worden toegepast. Bovendien, terwijl de directe verwerking van bladbeelden beeldanalyse softwarezoals Adobe Photoshop (San Jose, CA) of ImageJ 20 kan worden gebruikt voor de analyse van tomaat schade deze protocollen nodig gewijzigd om te worden toegepast op bladeren die grotere reflectiviteit oppervlakte hebben of licht gekleurd en hebben goed zichtbaar trichomen ( bv, A. thaliana) die interfereren met geautomatiseerde selectie van chlorotische plekken die plant schade te markeren. Bovendien wordt het ontwikkelingsstadium van spintmijten die gemakkelijk kan worden gebruikt met de voorgaande methoden beperkt tot de meest voorkomende en herkenbaar volwassen vrouwen en sluit het gebruik van andere ontwikkelingsstadia.
De eerste belangrijke stap in de richting van high-throughput analyse van planten-spint interactie is reproduceerbare, eenvoudige en robuuste protocollen vast te planten uitdaging met spint en betrouwbaar interactie resultaten te beoordelen.
In deze video, een efficiënte methode voor snelle en eenvoudige collectie van een grote number van volwassen vrouwelijke mijten, de toepassing ervan op een experimentele waardplant, en de beoordeling van de plant schade door spint voeding worden beschreven. De gepresenteerde protocol zorgt voor een snelle en efficiënte inning van honderden mensen op elk ontwikkelingsstadium (eitjes, larven, nimfen, volwassen mannetjes en vrouwtjes) die kunnen worden gebruikt voor de volgende experimentele toepassing. Bovendien kunnen deze protocollen worden toegepast op elke mijt gastheerplant, maar worden in het geval van A. aangetoond thaliana.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Onderhoud van de populatie spintmijten
OPMERKING: Spint worden gefokt op California rode kidneybonen (Phaseolus vulgaris).
- Groeien boon planten uit zaden voor 2-3 weken voor besmetting.
- Intermix deze planten met besmette planten; volwassen mijten zal snel koloniseren vers plantmateriaal.
- Verwijder oude besmette bonen planten om de 7-10 dagen, te vervangen door verse planten.
2. Verzamelen Volwassen Vrouwelijke Mijten
- Mite Collection met de wasmethode
- Om mijten verzamelen, plaats een verse bonen plant in contact met besmette planten 1-2 dagen voorafgaand aan het experiment.
- Gebruik 20-30 verse bonen planten om 1.000 tot 2.000 volwassen vrouwelijke mijten te verzamelen.
- Bereid een oplossing van Tween 20 bij 0,001% met leidingwater bij kamertemperatuur.
- Was besmette bonenplanten in de Tween 20 oplossing, in 2 tot 3 planten per keer.
- Elke plant wordt gewassen 2-3x om alle mijten van bladeren te verzamelen.
- Compleet stap 2.1.4 binnen 10 min naar mijt sterfte te voorkomen.
- Isolatie van Volwassen Vrouwelijke Mijten door filtratie van de Mite Schorsing door zeven met een bepaalde maaswijdte
- Bereid zeven van de volgende maaswijdte: 500 micrometer (om vuil te verwijderen) en 300 micrometer (om vrouwelijke volwassen mijten verzamelen) (Figuur 1A).
- Filter de suspensie door de 500 pm zeef.
- Filtreer de suspensie door de 300 um zeef. Volwassen vrouwelijke mijten blijven behouden.
- Dompel een 300 um zeef met volwassen vrouwelijke mijten in schoon leidingwater om de Tween 20 verwijderen.
- Spreid mijten in een laag op de bodem van de zeef.
- Gebruik papieren handdoek om het overtollige water uit de maas en de zijkanten van de zeef te verwijderen. OPMERKING: Dit wordt gedaan omdat mijten nodig om snel te drogen om te herstellen.
- Bereid een samenstel zoals getoond in figuur 1B; Dit zal toelaten mijten zich vrij te bewegen, maar zal zij niet kunnen ontsnappen.
- Plaats de zeef met mijten bovenop de zeef die wordt gebruikt als een drager.
- Omring bodemzeef met water om mijten te voorkomen verspreiden. OPMERKING: Mijten zal starten met het herstel na ongeveer 5 minuten. Na ongeveer 30 minuten, het aantal bewegende mijten volstaat verzameling (figuur 1D) starten. Mijten worden verzameld binnen 1 uur, omdat ze produceren zijde, dat zal interfereren met de collectie.
3. Plant Infestation met Mijten
OPMERKING: Eenmaal volwassen vrouwelijke mijten zijn hersteld, kunnen ze worden gebruikt voor plantaardige besmetting. Er zijn 2 methoden die worden gebruikt om experimentele planten besmetten met volwassen vrouwelijke mijten: a) met een fijn kwastje (protocol paragraaf 3.1) en b) met behulp van een pomp of stofzuiger lijn (protocol paragraaf 3.2).
- Mijt besmetting met behulp van een borstel
OPMERKING: spintmijtinfectiemet een borstel wordt gebruikt voor de toepassing tot 30 mijten per plant.- Gebruik een zachte haren ronde art penseel van grootte 00 of fijner.
- Bevochtig de borstel met RT kraanwater.
- Voorzichtig halen mijten van de zeef met behulp van de penseelpunt en overbrengen naar de plant.
- Mijt besmetting met behulp van een pomp
OPMERKING: Plant besmetting met mijten door een pomp / vacuum lijn verzameld wordt gebruikt wanneer meer dan 30 mijten worden toegepast. Voor deze werkwijze kan een vacuümpomp voor micro-elektronische componenten pickup of een vacuümleiding worden. Het is belangrijk dat de luchtstroom constant en sterkte (2-4 psi) te houden.- Bevestig een 1 ml pipet tip om de buis die wordt aangesloten op de pomp of stofzuiger lijn met behulp van een 1,5 ml centrifugebuis snede aan de onderkant als adapter tussen de pomp / vacuümbuis en de tip.
- Leg een stuk keukenpapier tussen de pipet en de adapter (1,5 ml centrifugebuis). OPMERKING: het doel hiervan is te vangen mijten binnen thij pipet tip tijdens het afzuigen en ook om de luchtstroom (figuur 1C) te verminderen.
- Verzamel mijten direct van de zeef met behulp van de pipet tip.
- Als alternatief, verzamel mijten een voor een uit aangetaste bladeren met behulp van een stereoscoop.
- Wanneer het vereiste aantal mijten is verzameld, verwijder de pipet tip van de buis, om ervoor te zorgen dat het stuk papier handdoek aan de achterkant van de pipet tip ongestoord.
- Verzamel mijten door de pipet tip tikken en klonteren de mijten samen. Dan, plaats ze op het blad; binnen seconden zal de mijten gaan verspreiden op het blad.
4. Opnemen en beoordelen van Plant Schade
- Opname Plant Schade
OPMERKING: Voor A. thaliana, wordt plantaardige schade geëvalueerd na 4 dagen van mijt voeden. Schade wordt geregistreerd als de totale oppervlakte van chlorotische plekken. Voor schade meting wordt het gehele rozet gesneden en gescand.Scanparameters beschreven zijn voor een Epson V30 scanner, maar zal fungeren als een goed startpunt voor een soortgelijke flatbedscanner. Houd scan parameters constant voor alle experimenten vergelijking tussen individuele experiment runs.- Bedek scanner bed met transparantie laken om te voorkomen dat vervuilende scanner oppervlak met plantmateriaal.
- Snij een hele rozet en plaats op de scanner bed zo adaxiale (boven) kant van de bladeren worden geconfronteerd met de scanner lichtbron en capture element. Als alternatief, als rozetten zijn te dicht om losse bladeren vast te leggen zonder overlap, ontleden de rozet in losse bladeren of groepen van niet-overlappende bladeren met fijne schaar voor het op de scanner bed. Meerdere rozetten kunnen gelijktijdig worden gescand.
- Bedek rozetten of bladeren met een stuk wit papier op de naleving van en besmetting van de klep van de scanner te voorkomen.
- Sluit klep van de scanner en het uitvoeren van een scan met de volgende parameters: Resolutie: 1,200 dpi; Kleurmodus: Adobe RGB; Helderheid: 25; Bestandstype: maximale kwaliteit JPEG.
- Opslaan beeldbestanden voor gevolgschade analyse.
- Plant Schade Kwantificering
OPMERKING: Het gebied van de schade wordt handmatig berekend met behulp van Photoshop. Vanwege de grote verschillen in bladvorm en kleurintensiteit van de symptomen als gevolg van de mijt voeden, automatische methoden onbetrouwbaar waren. Aldus wordt een rooster methode om planten schade te beoordelen:- Open de afbeelding van de plant met Photoshop.
- Maak een nieuwe laag, dan overlay gescande afbeelding met een raster van 0,25 mm x 0,25 mm divisies (View of Display - Show - Raster, sneltoets Ctrl + ').
- Op een overlay-laag, markeren beschadigde blad gebieden met behulp van een punt (de "Pencil Tool", sneltoets B). Gebruik een enkel punt voor elk enkele veld waaronder zich schade die meer dan de helft van de roostereenheid. De grootte van de stip wordt in pixels (dwz 52 pixels per punt).
- Als alle vakjes van het rooster die plant schade die ten minste de helft van de grid eenheid tonen zijn gemarkeerd met een stip, gebruik het histogram gereedschap (Venster - Histogram) aan het totale aantal pixels op de laag te bepalen. Het histogram gereedschap mag een om het aantal pixels te meten. Aangezien elke beeldpunt vertegenwoordigd wordt door een constante en bekende aantal pixels, wordt het histogram gereedschap het totale aantal pixels te meten, die het totale aantal punten, en daarmee het totale aantal gemarkeerde velden.
- Bereken het aantal "dots" gekenmerkt door de formule:
Aantal punten = totaal aantal pixels / aantal pixel per pixel. - Bereken de totale oppervlakte van de schade door het aantal gemerkte punten vermenigvuldigen op het beeld door het gebied van 1 van het raster, zoals een punt overeenkomt met een enkele veld.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van 20 tot 30 besmette bonen planten, kan men rond 2000 volwassen vrouwelijke mijten te verzamelen met behulp van zeven. De tijd die nodig is om 10 planten besmetten met 20 mijten per plant is ongeveer 15 minuten bij gebruik van een borstel om mijten te dragen. Combinaties van inzameling en toepassingsmethoden worden getoond in Figuur 2.
Dit protocol genereert reproduceerbare resultaten van de fabriek schade, waaruit blijkt dat verzamelde mijten zijn met gelijksoo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze video toont protocollen gebruikt voor het isoleren en planten besmetten met grote aantallen volwassen vrouwelijke mijten. Hoewel we presenteerde dit protocol met behulp van A. thaliana, kan het worden gebruikt voor alle planten-spint interactie systeem en wordt momenteel met succes ook toegepast op tomaten en wijnstok (Vitis vinifera) planten. Het protocol levert reproduceerbare resultaten te geven dat verzamelde mijten van vergelijkbare fysiologische toestand (figuur 3).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit project werd gefinancierd door de regering van Canada via Genome Canada en het Ontario Genomics Institute (OGI-046), en Ontario Research Fund–Global Leadership in Genomics and Life Sciences GL2-01-035 (voor M.G. en V.G.). T.V.L. is een postdoctoraal onderzoeker van het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Plant materiaal: | |||
| California rode kidneyboon | Stokes, Thorold, ON, Canada | 2 weken oud, goed besmet met spintmijten 2 of 3 dagen voor gebruik. Andere cultivars van Phaseolus vulgaris kunnen worden gebruikt. | |
| Chemicaliën: | |||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 1% stockoplossing wordt bereid om het doseren te vereenvoudigen |
| Kraanwater | Bij kamertemperatuur beïnvloeden hitte- en koudeschok de overlevingssnelheid en prestaties van de mijten | ||
| Ander materiaal en apparatuur: | |||
| Kunststof bak | |||
| Set schaar | |||
| 2 L bekers | |||
| Papierhanddoeken | |||
| Sets van zeefjes | In huis vervaardigd | Gedetailleerde instructies zijn beschikbaar | |
| Dunne borstel | |||
| Pipetten | |||
| Pipetpunten | 0,2 en 1 ml | ||
| 1,5 ml centrifugebuisjes | |||
| Luchtpomp | Aquarium type pomp met omgekeerde luchtstroom. Vacuümlijn kan worden gebruikt. Vereiste drukverschil is ongeveer 2-4 psi | ||
| Stereoscoop | |||
| Scanner | Epson | V30 | Elke flatbed scanner die de nodige mate van controle over de scankwaliteit toelaat. We gebruiken Epson V30 voor onze experimenten. |
| Computer | Windows of OS X pc die compatibel is met de scannerhardware en Adobe Photoshop software. | ||
| Adobe Photoshop software | Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA | diversen | Elke versie met Histogram tool inbegrepen. |
Referenties
- Jeppson, L. R., Keifer, H. H., Baker, E. W. Mites injurious to economic plants. , University of California Press. (1975).
- Migeon, A., Dorkeld, F. Spider Mites Web: a comprehensive database for the Tetranychidae. http://www.montpellier.inra.fr/CBGP/spmweb. , (2013).
- Croft, B. A., Vandebaan, H. E. Ecological and Genetic-Factors Influencing Evolution of Pesticide Resistance in Tetranychid and Phytoseiid Mites. Exp Appl Acarol. 4, 277-300 (1988).
- Van Leeuwen, T., et al. Mitochondrial heteroplasmy and the evolution of insecticide resistance: Non-Mendelian inheritance in action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 5980-5985 (2008).
- Van Leeuwen, T., Vontas, J., Tsagkarakou, A., Dermauw, W., Tirry, L. Acaricide resistance mechanisms in the two-spotted spider mite Tetranychus urticae and other important Acari: A review. Insect Biochem Molec. 40, 563-572 (2010).
- Dermauw, W., et al. The cys-loop ligand-gated ion channel gene family of Tetranychus urticae: Implications for acaricide toxicology and a novel mutation associated with abamectin resistance. Insect Biochem Molec. 42, 455-465 (2012).
- Van Leeuwen, T., et al. Population bulk segregant mapping uncovers resistance mutations and the mode of action of a chitin synthesis inhibitor in arthropods. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4407-4412 (2012).
- Dearden, P. K., Donly, C., Grbic, M. Expression of pair-rule gene homologues in a chelicerate: early patterning of the two-spotted spider mite Tetranychus urticae. Development. 129, 5461-5472 (2002).
- Khila, A., Grbic, M. Gene silencing in the spider mite Tetranychus urticae: dsRNA and siRNA parental silencing of the Distal-less gene. Development genes and evolution. 217, 241-251 (2007).
- Grbic, M., et al. Mity model: Tetranychus urticae, a candidate for chelicerate model organism. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 29, 489-496 (2007).
- Grbic, M., et al. The genome of Tetranychus urticae reveals herbivorous pest adaptations. Nature. 479, 487-492 (2011).
- Kliebenstein, D., Pedersen, D., Barker, B., Mitchell-Olds, T. Comparative analysis of quantitative trait loci controlling glucosinolates, myrosinase and insect resistance in Arabidopsis thaliana. Genetics. 161, 325-332 (2002).
- Abe, H., et al. Function of jasmonate in response and tolerance of Arabidopsis to thrip feeding. Plant & cell physiology. 49, 68-80 (2008).
- Whiteman, N. K., et al. Mining the plant-herbivore interface with a leafmining Drosophila of Arabidopsis. Molecular ecology. 20, 995-1014 (2011).
- Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4674-4677 (2012).
- Kim, J. H., Lee, B. W., Schroeder, F. C., Jander, G. Identification of indole glucosinolate breakdown products with antifeedant effects on Myzus persicae (green peach aphid). The Plant journal : for cell and molecular biology. 54, 1015-1026 (2008).
- Adio, A. M., et al. Biosynthesis and defensive function of Ndelta-acetylornithine, a jasmonate-induced Arabidopsis metabolite. Plant Cell. 23, 3303-3318 (2011).
- Li, L., et al. The tomato homolog of CORONATINE-INSENSITIVE1 is required for the maternal control of seed maturation, jasmonate-signaled defense responses, and glandular trichome development. Plant Cell. 16, 126-143 (2004).
- Kant, M. R., Ament, K., Sabelis, M. W., Haring, M. A., Schuurink, R. C. Differential timing of spider mite-induced direct and indirect defenses in tomato plants. Plant Physiol. 135, 483-495 (2004).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
