Er is duidelijk een behoefte aan betere informatie over de moleculaire bestuurders van Barrett-slokdarm. Immunofluorescentie kleuring is een nuttige techniek voor het begrijpen van de effecten van celsignalen op celmorfologie. Wij presenteren een eenvoudig, efficiënt protocol voor het gebruik van immunofluorescentie kleuring therapeutische behandeling van Barrett-slokdarm cellen bepalen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een Immunofluorescent methode voor de karakterisering van Barrett's slokdarm Cellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Adenocarcinoom van de slokdarm (EAC) heeft een totale overleving van minder dan 17% en de incidentie van EAC is dramatisch gestegen in de afgelopen twee decennia. Een van de belangrijkste risicofactoren EAC Barrett-slokdarm (BE), een metaplastische wijziging van de normale squameuze slokdarm in reactie op chronische maagzuur. Ondanks de gevestigde verbinding tussen EAC en BE, ondervraging van de moleculaire gebeurtenissen, met name veranderde signaalwegen betroffen progressie van BE aan EAC, worden slecht begrepen. Veel van dit is te wijten aan het gebrek aan geschikte in vitro modellen voor deze ziekten te bestuderen. Recent zijn geïmmortaliseerde cellijnen BE commercieel beschikbaar waardoor in vitro studies BE. Hier presenteren we een methode voor immunofluorescente kleuring van geïmmortaliseerde cellijnen BE, waardoor in vitro karakterisering van celsignalen en structuur na blootstelling aan therapeutische verbindingen. Toepassing van deze technieken zal help ontwikkelen inzicht in de bij BE EAC progressie mechanismen en voorzien mogelijke wegen voor behandeling en preventie van EAC.
Inleiding
Barrett-slokdarm (BE) is een metaplastische wijziging van het normale squameuze epitheel van de slokdarm als een gevolg van chronische blootstelling aan de maaginhoud gevolg van gastro-oesofageale refluxziekte (GERD) 1. BE wordt verondersteld om een beschermingsmechanisme in reactie op GERD, echter de aanwezigheid van BE brengt een verhoogd risico van esophageal adenocarcinoom (EAC), een ziekte die een significant slechte overleving 1 draagt. Huidige schattingen suggereren dat tot 5,6% van de Amerikaanse bevolking hebben, echter als BE vaak asymptomatisch, men denkt dat de meerderheid van BE blijft gediagnosticeerd 2. Zoals incidentie....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Cell Line Maintenance
- Vereeuwigd Human BE hoogwaardige dysplastische (CP-B, CP-C, CP-D) en metaplastische (CP-A) cellijnen door stabiele transfectie van de menselijke telomerase reverse transcriptase (tert) eiwit 11.
- Handhaaf BE cellijnen keratinocyt medium aangevuld met runderhypofyse-extract (BPE), epidermale groeifactor (EGF), 5% foetaal runderserum (FBS), niet-essentiële aminozuren (NEAA), penicilline-streptomycine-neomycine (PSN) en standaard weefselkweek omstandigheden (37 ° C, 5% CO2, 98% vochtigheid).
2. BE Cell Plating
- Voorbereiding van de 12-well plaat / dekglaasjes.....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een voorbeeld van de resultaten van toepassing van de procedures beschreven resultaten is weergegeven in figuren 1A-D. Dekglaasjes met CP-D en CP-C BE cellen werden behandeld gedurende 24 uur met 1 uM van de SRC-familie remmer, SKI-606, of voertuig (DMSO) en gekleurd met behulp van de bovenstaande procedures voor de Adherens Junction en Wnt signalering eiwit, β -catenine. Visualisatie van β-catenine werd bereikt door labeling met een anti-konijn IgG gekoppeld aan een groene fluorofoor, terwijl kenmerken.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Wij hebben een werkwijze voor het aanbrengen van IF BE cellen naar het ophelderen van de fysiologische effecten van gerichte therapie op deze cellen beschreven. Hoewel wij het gebruik van deze procedures naar BE cellen beschreven, hebben wij gevonden dat deze methoden ook toegepast op een verscheidenheid van verschillende celtypes 13,17,18. Verder kunnen deze procedures op verschillende manieren kleuring optimaliseren voor specifieke doelen worden gewijzigd.
We vinden een parame.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de St, Stichting Joseph's (AJF, LJI) en American Lung Association, RG-224607-N (LJI).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| CP-A (Metaplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4027 | |
| CP-B (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4028 | |
| CP-C (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4029 | |
| CP-D (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4030 | |
| Keratinocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red | Life Technologies | 25200056 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, HI | Life Technologies | 10438026 | |
| PSN antibiotic mixture | Life Technologies | 15640 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| Circular Glass Coverslip 18 mm | Fisher Scientific | 15-183-86 | |
| β-catenin Primary Antibody (Rabbit) | Cell Signaling | 9562S | |
| Alexa Fluor 488 (Goat Anti-Rabbit) | Life Technologies | A11008 | |
| 10 cm TC treated PS dish, sterile | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| 12-well TC treated PS plate, sterile | USA Scientific | 5666-5180 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| SKI-606 (Bosutinib) | Selleck Chemicals | S1014 | |
| Square Bioassay Dish | Thermo Scientific | 240835 | |
| Parafilm | VWR | 82024-546 | |
| Disposable Pasteur Pipettes, Flint Glass | VWR | 14672-380 | |
| Nexcelom Mini Cell Counter | Nexcelom | ||
| Cellometer Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100-014 | |
| Zeiss Apotome microscope | Zeiss |
Referenties
- Reid, B. J., Li, X., Galipeau, P. C., Vaughan, T. L. Barrett's oesophagus and oesophageal adenocarcinoma: time for a new synthesis. Nat. Rev. Cancer. 10, 87-101 (2010).
- Hayeck, T. J., Kong, C. Y., Spechler, S. J., Gazelle, G. S., Hur, C.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
