Gelijktijdige Langdurige Recordings op Twee Neuronale Processing Fasen in Behaving Honingbijen

Summary

Gelijktijdige extracellulaire langdurige opnames van twee verschillende hersengebieden neuropiles of twee verschillende anatomische traktaten werden opgericht in honingbijen. Deze opnamen kan de onderzoek temporele aspecten van neuronale verwerking in verschillende hersengebieden in het neuron en op het ensemble niveau in een dier gedragen.

Abstract

In beide zoogdieren en insecten neuronale informatie wordt verwerkt in verschillende hogere en lagere orde hersencentra. Deze centra worden gekoppeld via convergente en divergente anatomische verbindingen waaronder feedforward en feedback bedrading. Verder wordt informatie van dezelfde oorsprong gedeeltelijk via parallelle wegen naar verschillende en soms in dezelfde hersengebieden. De evolutionaire voordelen als de rekenkundige voordelen van deze bedrading strategieën en vooral hun temporele afhankelijkheden elkaar begrijpen, is het noodzakelijk om gelijktijdige toegang tot enige neuronen van verschillende stukken of neuropiles in hetzelfde preparaat bij hoge temporele resolutie hebben. Hier concentreren we ons op honingbijen door aan te tonen een unieke extracellulaire toegang op lange termijn om multi eenheid activiteit opnemen op twee opeenvolgende neuropiles ^1, de antennal kwab (AL), de eerste geur verwerkingsfase en de paddestoel lichaam (MB), een hogere orde integratie centrum involved in leren en geheugen vorming, of twee parallelle neuronale traktaten ² aansluiten van de AL met de MB. De laatste werd als voorbeeld gekozen en zal volledig worden beschreven. In de ondersteuning van video van de bouw en permanente inbrengen van flexibele multi channel draadelektroden wordt aangetoond. Paarsgewijze differentiële amplificatie van het micro draadelektrode kanalen drastisch vermindert de ruis en controleert of de bron van het signaal nauw gerelateerd aan de positie van de elektrode. De mechanische flexibiliteit van de gebruikte draadelektroden laat stabiel invasieve langdurige opnames gedurende vele uren tot dagen, dat is een duidelijk voordeel ten opzichte van conventionele extra en intracellulaire in vivo opnametechnieken.

Introduction

Honingbijen evenals de meeste andere insecten sterk afhankelijk zijn reukzin. Onder meer ze gebruiken olfactorische signalen voor oriëntatie, de paring, de communicatie met soortgenoten, en foerageren. Hun goed uitgewerkt olfactorische systeem draagt ​​bij aan een rijke repertoire van leergedrag gerelateerd aan bloemen geur stimuli. Deze gedragingen kunnen gemakkelijk worden bestudeerd onder gecontroleerde laboratoriumomstandigheden (voor een overzicht zie ^3-5). Hun "mini hersenen" (vgl. ⁶⁾ met hun relatief kleine aantallen neuronen maakt de honingbij een geschikt modelorganisme voor het bestuderen van olfactorische codering en het leren tijdens de bewaking van neurale activiteit.

Het olfactorische systeem insecten en zoogdieren toont analoog organisatie grotendeels (voor overzicht zie ^7,8). In honingbijen ongeveer 80.000 receptor neuronen ⁹ gelegen in sensillae langs de antennes ^10,11 vertalen het milieu geur stimulus tot een neuronale signaal. Axonen olfactorische receptor neuronen innerveren de antennaal kwab (AL) die een glomerulaire organisatie vergelijkbaar met de vertebraat bulbus olfactorius heeft. De AL bestaat uit ongeveer 164 glomeruli met elkaar verbonden door ongeveer 4000 lokale interneuronen (LN) (voor een overzicht zie ^12). Vooral in de honingbij is onlangs aangetoond dat LNS bieden fragmentarisch laterale connectiviteit en dat verschillende subpopulaties bezitten elementaire en configurele olfactorische codering eigenschappen ^13,14. De AL werd aangetoond worden onderverdeeld in een ventrale en een dorsale hemi kwab die aanleiding geven tot de mediale en de laterale antennaal kwab-darmkanaal (m-en l-ALT; voorheen genoemd m-en l-APT voor mediale-en laterale antennal kwab protocerebral darmkanaal ^15-17). Hier een nieuw traktaat terminologie geïntroduceerd door een recente poging voor een uniforme nomenclatuur van het insect hersenen zal worden gebruikt ^18. Beide ALTs (l-en m-ALT) combineren ofwel 410 (l-ALT) of 510 (m-ALT) uniglomerular projectie neuronen (PN), respectievelijk ^15,16,19. PN van beide stukken zijn onlangs aangetoond code geuren in parallel ² (voor een overzicht zie ^17,20), en beide traktaten synaptically vormen uiteenlopende verbindingen met Kenyon cellen (KC), de paddestoel lichaam (MB) hoofdsom neuronen. Elke MB bevat ongeveer 172.000 KCs ^21-23. De MB's zijn bekend betrokken te zijn bij stimulus integratie, leren en geheugen vorming. De axo dendrieten van KCs vormen de steel (steel van de paddestoel), die twee hoofduitgang regio heeft: de Vertica of alfa-kwab en de horizontale of beta-kwab ^22,24. De uitgang van de MB convergeert slechts ongeveer 400 extrinsieke neuronen (NL) ^24. Ens verantwoordelijk voor olfactorische informatieverwerking vooral innerveren het ventrale aspect van de verticale kwab ^22. Onlangs is aangetoond dat ENS opgenomen in dit gebied coderen de geur beloning vereniging ^25.

Temporele als^{29 -} aspecten binnen het olfactorische systeem van insecten en gewervelde dieren hebben een belangrijke en significante aspect als een mogelijke codering principe ²⁶ geworden. In staat zijn om tegelijkertijd op te nemen meerdere neuronen van verschillende sites op hoge temporele resolutie, hebben we dubbele multi-unit opnametechnieken met behulp van aangepaste multi channel draadelektroden ingevoerd om verschillende doelgebieden in olfactorische systeem van de bij. Deze aanpak stelt ons in de honingbij reuksysteem te analyseren en vergelijken temporele verwerking in het niveau van afzonderlijke neuronen en populaties van neuronen hetzij tussen parallelle olfactorische paden, de dubbele olfactorische pad ² of tussen verschillende latere neuropils ^1. Onlangs met een vergelijkbare experimentele benadering voor de sprinkhaan olfactorische systeem ³⁰ met een andere configuratie van elektroden konden spatiotemporal codering mechanisme voor achtergrond-invariant geur herkenning ³¹ analyseren. Thons, de gevestigde dubbele opnames maken het mogelijk het verzamelen van ruimtelijke informatie over gelijktijdige neuronale activiteit profielen.

In vergelijking met de bredere ruimtelijke bemonstering verkregen uit calcium imaging deze methode kunt opnemen met slechts twee plekken. Echter, het voordeel ten opzichte van calcium beeldvorming is de hoge temporele precisie van actiepotentiaal opnamen die niet kan worden geleverd door een conventionele CCD of 2-foton beeldopname. Het extracellulaire elektroden beschreven permanent geïmplanteerd in verhouding tot de hersenen en het hoofd capsule vermijden elektrode drift vastgesteld. Dit is een duidelijk voordeel ten opzichte van het gebruik van scherpe intracellulaire elektroden. Een ander voordeel ten opzichte van intracellulaire opnames en calcium beeldvorming is de verlengde neurale observatietijd variërend van vele uren tot dagen. Dit is een belangrijke voorwaarde om neurale correlaten van leren en geheugen vorming te onderzoeken. Extra voordelen van multiunit registraties worden verder beschreven in het hoofdstuk discussie.

In deze methodologische overzicht het fabricageproces van aangepaste ontwerp draadelektroden zal worden getoond, aangepast van ^32,33 en geschikt voor lange termijn multi-unit registraties in de honingbij hersenen. Bovendien wordt een voorbeeld hoe dit soort elektroden permanent geïmplanteerd op twee verschillende plaatsen in het opname honingbij reuksysteem simultaan de l-en m-ALT gedurende lange tijd veel stimulatieprotocollen toestaan ​​weergegeven ^2. Ter verificatie van de opname posities een voorbeeld en protocol voor kleuring en na opname visualisatie van de opname locaties wordt verstrekt.

Protocol

1. Elektrode Gebouw (figuur 1)

1. Productie van een elektrode adapter dat de elektrode-interface raad van commerciële multi-kanaals versterker systemen ^1,2,25 past.
   1. Gebruik een kleine plexiglas plaat gelijmd aan een 18 pins connector basis.
   2. Sluit de basis met 3 korte stukken van geïsoleerde draad op 3 aparte soldeerlippen geschroefd op de plexiglas plaat (figuur 1 A1-A3).
   3. Plaats een groef in de plexiglas plaat waarin een glazen capillair kan gemakkelijk bewegen en op hun plaats worden gehouden door een schroef (figuur 1 B1).
   4. Verleng de glazen capillair ongeveer 5 mm met een minutien pin.
   5. Bevestig de micro elektrode draden langs de minutien pen en de glazen capillair naar stabilisatie en ondersteuning garanderen.
2. Multi-channel micro draad productie (van Ryuichy Okada ^32,33 aangenomen)
   1. Span 3 micro draden (polyurethaan gecoat koperdraad, 15urn diameter) op een manier dat ze naast elkaar zijn geplaatst (figuur 1 B2).
   2. Gebruik een 12 V solderen naald om een dunne film van laag smeltende tandartsen (50 ° C) verspreid gedeeltelijk langs de draden om ze aan elkaar te lijmen (elektrode tip) (Figuur 1 B3). Laat enkele centimeters belijmde (elektrodekant) als deze verderop zal worden gebruikt om de micro draden met elektrodeadapter.
3. Sluit de multi-channel micro draad aan de elektrode-adapter
   1. Verwijder de glazen capillair uit de houder en bevestig deze met de minutien pin om de elektrode tip. Breng het in een positie parallel aan de micro-elektrode (figuur 1 B3).
   2. Lijm de elektrode tip om de minutien pin behulp laag smeltpunt tandartsen en snijd de micro-elektrode op het puntje, uitstekende 2-3 cm van de minutien pin en aan het eind elektrode (kleine pijltjes Figuur 1 B3).
   3. Zet de capillaire slightly terug in de elektrodeadapter. Gebruik de schroef om het te repareren (figuur 1 B4).
   4. Soldeer de losse uiteinden van de drie draden aan de soldeerlippen met een soldeerbout met een temperatuur van ongeveer 360 ° C smelten van de isolatie (figuur 1 B4) waarborgen. Na het solderen, ervoor zorgen dat er voldoende elektrisch contact (~ 300 kOhm).
   5. Monteer een van de elektroden (master) aan de elektrode-interface bestuur van de headstage en bevestig de andere multi channel elektrode (slave) op een aparte adapter. Sluit de kanalen van de slave naar de master elektrode (figuur 1 C1). Bovendien, soldeer de referentie evenals spier elektroden naar de master elektrodebasis (figuur 1 C2).

2. Bee Voorbereiding (figuur 2)

In deze experimenten beschreven, de honingbij (Apis mellifera), die een ongewerveld dieren dus geen specifieke ethische vergunningen voor gebruik, wordt gebruikt vereisen.

1. Catch honingbij verzamelaars (A. mellifera) bij de korf ingang in de ochtend als getoond door anderen ^34,35.
2. Koel de bijen op gemalen ijs tot immobilisatie (5 tot 10 min.) en een vast in een standaard plexiglas houder of metalen buis zodanig dat de kop is blootgesteld (Figuur 2A). Voor het minimaliseren van hoofdbewegingen gebruiken laag-smeltende tandartsen (~ 50 ° C) en fixeer het hoofd voorzichtig naar de houder rond de basis van de samengestelde ogen en de nek.
3. Gebruik laag smeltende was de scapi van de antennes fixeren op het hoofd capsule (figuur 2 B) zonder het aanraken van het flagellum. De gesel van de antenne moet naar voren worden gewezen. Zorg ervoor dat de bijen vrij zijn slurf kan bewegen.
4. Scheer de kop capsule om een ​​ongestoord uitzicht en toegang tot de bovenkant van het hoofd te garanderen.
5. Voeden de bijen met een 30% sucrose-oplossing totdat saturatiop voldoende bevochtiging van hersenweefsel en goede levensvatbaarheid van het dier (figuur 2C) te waarborgen.
6. Maak voorzichtig incisies verticaal langs de grenzen van de samengestelde ogen en horizontaal boven de antennaal bases evenals onder de oogvlekken en verwijder de losgekomen stukje cuticula (figuur 2 D).
7. Zorgvuldig gereserveerd hypopharyngeal klieren en verwijder de luchtpijp om een duidelijk zicht en toegang tot de hersenen voorafgaand aan het inbrengen (figuren 2E, 2F) elektrode te garanderen.

3. Elektrodeplaatsingsinstrument

In het voorbeeld geval is in figuur 2, wordt een elektrode gepositioneerd gericht op de l-ALT, de andere gericht op de m-ALT ^2. Met behulp van bijzondere monumenten, andere doelgebieden zijn ook mogelijk, bijvoorbeeld de AL en MB uitgang regio ^1.

1. Plaats de elektroden met behulp micromanipulators op het gebied van belang ( Figuur 2G en 3A). Om de m-ALT plaats richten op de elektrode tussen de AL en mediaal van de verticale kwab van de MB. Zorgen voor het inbrengen site wordt boven het vertakkingspunt van de mediolaterale ALT PNs. Steken de elektrode in de hersenen met een diepte van ongeveer 180 urn (figuur 2E). Voor l-ALT PN opname plaats de elektrode onder de laterale protocerebrum (LH) in het midden van een denkbeeldige lijn tussen de zijkant van verticale kwab en het midden van de AL. Plaats de elektrode met een diepte van ongeveer 300 urn (figuur 2E)
2. Voeg hier de referentie (zilveren draad, ongeveer 25 micrometer diameter) in de ipsilaterale samengestelde oog via een kleine snede in de cuticula. Plaats een andere zilveren draad in de spier projectie gebied onder de laterale ocelli. OPMERKING: Indien nodig de leergedrag van de bijen kunnen worden gecontroleerd met een hoge temporele precisie door het opnemen van de spier M17, dat betrokken is in de proboscis extensie respons (PER) van de bij ^36, zoals beschreven in ^25.
3. Om stevig verankeren van de elektroden in de hersenen en het hoofd capsule, de gehele ruimte boven de hersenen met twee componenten siliconen (figuur 2H), die voorkomt dat de hersenen uitdrogen. OPMERKING: de opnames kan duren voor uren tot dagen, en de bijen kan bijvoorbeeld worden opgenomen tijdens een klassieke conditionering procedure (figuur 2H) of gestimuleerd met een groot paneel van verschillende geuren.

4. Data Acquisition en Preprocessing

1. Gebruik de juiste acquisitie software die voldoet aan de volgende eisen: sampling rate van min 25 kHz; analoge ^1,25 of digitale ² kruis differentiatie tussen de elektrode kanalen; band pass filter van 300 Hz tot 8000 Hz tot spike gebeurtenissen halen.
2. Gebruik beschikbare spike sorteren software om enkele eenheid activiteit halen, bijvoorbeeld templaten bijpassende technieken zoals opgenomen in de Spike2 software (Figuur 3).
3. Voor verdere analyse gebruikt de tijdstempels van de geëxtraheerde eenheden eenheid berekenen gemiddelde geur responsen (figuur 4) of populatie vectoren berekenen Principal Component Analysis (PCA) (Figuur 5) met in de handel verkrijgbare software. Om eenheid en bevolking reactie latency verder te analyseren kunt u vergelijken met recente publicaties ^1,2,25.

5. Visualisatie van relatieve elektrode positie (figuur 4)

1. Dompel de elektroden uiteinden in een oplossing van een 5% Alexa hydrazide 568 of 5% Alexa hydrazide 488 die is opgelost in 0,5 M kaliumchloride vóór de opname experimenten.
2. Verwijder de elektroden en de dekking silicium zorgvuldig na de experimenten, spoel de hersenen met bijen Ringer-oplossing, verwijder klieren en de luchtpijp en plaats kleine kristallen van tetramethylrhodamin dextran of plaats een oplossing 5% opgelost in 1,0 M kalium acetaat in de AL de ALTs anterogradely labelen. Voer de volgende stappen in de duisternis.
3. Laat de kleurstof op te nemen en getransporteerd door de projectie neuronen langs hun axonen (30-45 min) (figuur 4A), voor het wassen van de hersenen met bij Ringer oplossing driemaal nog eens 30-45 minuten.
4. Chill de bijen op ijs tot immobilisatie en verwijder voorzichtig de hersenen uit het hoofd capsule. Fixeer de hersenen door te spoelen in 0,1 M PBS bevattende 4% formaldehyde en houdt deze gedurende de nacht bij 4 ° C.
5. Wacht ten minste 12 uur vóór het wassen van de hersenen tweemaal in 0,1 M PBS (10 minuten elk).
6. Was de hersenen 3x gedurende 20 min in 0,2% Triton X-100 verdund in 0,1 M PBS voordat dehydrateren in een oplopende reeks alcohol (30%, 50%, 70%, 90%, 95%, 3x 100% ethanol, 20 min elke stap).
7. Het gedehydrateerde hersenen in Methylsalicylate insluiten op een microscoop glijbaan en seal het met een cover slide.
8. Gebruik een confocale laser scanning microscoop en scan de hersenen als optische secties om de 2-5 urn met een harmonische verbinding Plan Apochromat doelstelling (10X 0,4 NA onderdompeling). Excite het weefsel met behulp van 568 nm golflengte voor tetramethylrhodamin dextran en een golflengte van 488 nm voor de elektrode positie.
9. Reconstrueren de gebrandschilderde hersenstructuren en elektrode paden uit de afbeelding stapels in 3D met reconstructie software (bijv.. AMIRA of Fiji) (figuur 4).

Results

"De huidige protocol maakt gelijktijdige opnamen op twee verschillende stadia van de verwerking binnen de afzonderlijke honingbijen en bovendien maakt het mogelijk om de onderliggende mechanismen van leren en geheugen te testen via bijvoorbeeld., PER conditioning binnen ingetogen honingbijen." Dit is een voorwaarde voor het analyseren temporele aspecten van neuronale verwerking. De methode is eenvoudig aan te passen voor verschillende wetenschappelijke benaderingen van het neuronale netwerk van olfactorische systeem van de bij te ontrafelen. Bijvoorbeeld deze methode wordt toegepast (i) temporele verwerking van PN's in de duale olfactorische route van de honingbij, de l-en m-ALT PN (Figuur 5) analyse. In figuur 5A een voorbeeld van een l-ALT PN gelijktijdig opgenomen met een PN van de m-ALT gegeven als tien proef gemiddeld en illustreert de reactie kracht en latentie voor vijf verschillende geur concentraties gekleurde warmte plot. In een gemiddelde van zeven bijen met 11 l-en 13 mALT PN (figuren 5B, 5C) illustreert dat zowel de reactie kracht en de respons latentie, tot op zekere hoogte, weerspiegelt geurstof concentratie. Daarbij PNs in dit voorbeeld verhogen hun reactie kracht, terwijl bij toenemende concentratie geurstof hun reactie latency afgenomen (figuren 5B, 5C). Dit resultaat is vrij beperkt en alleen geldig voor de geanalyseerde geurstof, maar is nog steeds in overeenstemming met recente computermodellen van de AL ^37. Of geurconcentratie codering in AL de bijen ten grondslag ligt niet-lineaire berekeningen of ten grondslag ligt aan andere codering eigenschappen moet nog in de toekomst worden geanalyseerd. Verder kan de werkwijze worden toegepast (ii) temporele aspecten vergelijken de populatie activiteit bij twee daaropvolgende productiestadium, de AL-en MB-uitgang (figuur 6). Principale component analyse (PCA) illustreert dat geur berekening wordt verlengd en langer meegaat dan de hele geur presentatie op de PN niveau, terwijl in NLs alleen de geur-en uitschakelen set waren vertegenwoordigd in de populatie activiteit (Figuur 6). Waardoor de NL bevolking bereikten hun maximale activiteit al op een tijdstip waarop de PN activiteit is nog in ontwikkeling (vgl. Film 1).

.. Figuur 1 Productie driekanaals micro-draadelektroden A1) De uitgangen van drie draden gesoldeerd naar een IC-pins connector posities 11, 13 en 16 A2) vier soldeerlippen geschroefd op een plexiglas plastic basisplaat.; een minutien pin in het uiteinde van een glazen capillair die vervolgens wordt bevestigd aan de kunststof plaat. A3) De kunststof plaat gelijmd bovenop een IC penverbindingsstuk en het vrije uiteinde van elke draad ingebracht wordt gesoldeerd aan een van de top solderen lugs. B1) De elektrodehouder voorzien van de fijne koperdraad, de capillaire er nogmaals. B2 worden genomen) De bodem van de houder wordt dan bevestigd in een maat uitlijninrichting. Drie koperen micro draden zijn uitgelijnd langs de groef en met plakband vast aan elk uiteinde B3) De parallelle micro draden worden aan elkaar gelijmd met tandartsen en het capillair plaats teruggelegd (lange pijlen).; gelijmde micro draden worden vervolgens gekoppeld aan de capillair met tandartsen en de uiteinden worden afgesneden (korte pijl). B4) De drie losse uiteinden van de koperen draden vastgesoldeerd aan de drie boven soldeerlippen aldus uit te brengen in elektrisch contact met de IC pin connector. C1) Twee volledig geassembleerd elektroden worden verbonden met elkaar voor gebruik met een headstage. C2) Daartoe de pennen van een elektrode (links, slave) zijn via geïsoleerde draden aan de andere elektrode (rechts, master), die is verbonden met de kop stadium; de headstage aangesloten elektrode kan ook ingang te verzamelen van een spier (M17) en referentie-elektrode (Ref).

Figuur 2. Voorbereiding en permanente elektrode inbrengen in de honingbij hersenen. A) Een bij is in een plexiglas houder ingevoegd na immobilisatie op ijs. Antennes met Flagellum (FL) en Scapus (SC) zijn aangegeven. B) Het hoofd en de antennes zijn bevestigd met tandartsen. C) Het hoofd capsule wordt geschoren en de bijen wordt gevoed met suikerwater. D) Het hoofd capsule wordt geopend. e) Na het verwijderen klieren en luchtpijp uit de top van de hersenen, kunnen de verschillende neuropiles en de belangrijkste monumenten gemakkelijk worden onderscheiden. De trajecten van de ALTs samen met aangegeveneen merk waar de elektroden worden ingebracht. (MB: Mushroom lichaam, AL: Antennaal kwab, OL: Optical kwab, α: Alpha kwab of verticale kwab, ALT: antennal kwab darmkanaal, E1: elektrode inbrengen kant voor m-ALT-opnamen, E2: elektrode inbrengen kant voor l-ALT opnamen). F) Referentie (Ref) en spieren elektroden (M17) worden in de kop capsule ingebracht via kleine gaatjes in de cuticula of het samengestelde oog. G) De draad elektroden worden ingebracht in de hersenen op de juiste plaatsen. H) na vaststelling van de elektroden in plaats met behulp van twee componenten van silicium, de bijen geeft nog steeds PER en kan worden geconditioneerd (bv.., het gebruik van suiker water).

Figuur 3. Extracellulaire op twee zenuwbanen en eenheid extractie (spike sortering). A ) Schematische tekening van de experimentele opstelling. De honingbij is gefixeerd in een plexiglas houder. Geur stimulatie wordt geleverd via een glazen buis. Twee elektrode schachten opneemt uit de blootgestelde bijen hersenen. B) Gelijktijdige opnames van de l-en m-ALT PNs (groen en paars sporen) waaruit prikkelende reacties op beide stukken een 500 msec geur stimulatie van honing in water oplossing in een concentratie 1:100 bij 33 ° C. Elke uitgezet lijn vertegenwoordigt de gedifferentieerde kanalen als gekleurde label van de elektrode soldeerlippen in A. Bar:. 50 mV C) Na spike sorteren procedures enkele actiepotentialen worden gesorteerd en kleurcode. Overlay van de gesorteerde eenheden illustreert de scheiding van de golfvormen. D) Spike interval histogram geeft de scheiding kwaliteit van de gesorteerde eenheden bewijs van voldoende spike sorteren. Let op: er is geen piek binnen refractaire periode van het apparaat. E) Twee meningen (E1, E2) uiteen 3D clustering van de gesorteerde unit met principale componenten analyse, waarbij de afstand van de gesorteerde eenheden aan elkaar aangeeft. Cirkels geven de 2,5-voudige Mahalanobis afstand die de SD lijkt in de ruimte en geeft een aanzienlijke differentiatie van de clusters in de hoofdcomponent ruimte F) Kleur gecodeerde eenheden verbeelden de actiepotentialen zichtbaar in een vergroting van drie kanalen van het ene kanaal opnemen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4. Post-opname visualisatie en 3D-reconstructie van de stand voor opnemen. A) Projectie aanzicht ortho-segmenten langs de z-as met maximale intensiteit aanpassing van een anteroen retrograde opvullen van de uniglomerular projectie neuronen projecteren van de AL van de MB en LH. De intracellulaire tracer Microruby (tetramethylrhodamin dextran) werd in de AL ingevoegd na de opname experimenten. Gekleurd glomeruli in de AL bewijs juiste PN kleuring. B) Projectie aanzicht ortho segmenten langs de z-as met maximale intensiteit aanpassing van een kleuring van de twee elektroden Alexa hydrazide 488 waarin de elektrode plaatsing voor de m-ALT (E1, pijl ) en l-ALT (E2, pijl). De tracer Alexa Hydrazide 488 migreert naar de elektrode omringende weefsel en kleurt de elektrode plaats van inbrengen. Merk de prominente kleuring in AL is een oppervlakkig artefact. C) 3D Reconstructie van de gekleurde doelcellen (PN) en de elektrode insertieplaats van A, B (rechts) met een schematisch overzicht van de honingbij olfactorische systeem (links zijde) met de vermelding van l-en m-ALT trajecten. Let op, alleen uniglomerular PN traktaten worden getoond. AN: antennal zenuw, AL: antennal kwab, LH: zijhoorn, MB: paddestoel lichaam, E1, E2: elektrode insertieplaatsen, m-ALT: mediale antennal kwab-darmkanaal, l-ALT: laterale antennal kwab-darmkanaal, c: staart, r: rostrale, m: mediale, l:. laterale Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5. Voorbeeld geurconcentratie codering binnen het duale olfactorische route. A) Hitte percelen illustreren de reactie van een l-ALT (groen) en single m-ALT PN (paarse) gelijktijdig verkregen van een individu honingbij in reactie op de geurstof hexanal op het verhogen van geur concentraties (vanaf 1: 10 ^-6 tot 1:100). Elke lijn is een gemiddelde van tien proef stimulatie. Het vuren weergegeven als relatieve intensiteit veranderingen die het afvuren naar gelang van de subtractieve spontane activiteit. B) Populatie respons latentie van 11 l en 13 m-ALT PN van 7 opgenomen bijen. In elke bij de PN's uit beide stukken werden gelijktijdig opgenomen. De reactie populatie latentie toont een dalende latentie met toenemende geur concentratie PN beide stukken. De geur reactie ontstaan ​​op de antennes op 99 msec werd opgenomen via electroantennograms en wordt afgetrokken van de PN reactietijden. Merk op dat bij de laagste concentraties reacties te zwak voor latentie metingen en derhalve uitgesloten. C) responspopulatie vuren van dezelfde PN als in B. Bij toenemende geurconcentratie de respons sterk toeneemt. Het l-ALT toont een sterkere reactie sterkte. In B, C het gemiddelde en SD worden gegeven.

Figuur 6. Vergeleken bevolking activiteit op twee daaropvolgende productiestadium langs olfactorische route de honingbij's. Gegevens werden geregistreerd in 20 dieren die werden gestimuleerd met 1-hexanol en 2-octanon. A) Elke lijn vertegenwoordigt de valse kleurgecodeerde gemiddelde vuren van een projectie neuron (PN) berekend over 10 geur herhalingen van 1-hexanol. Geur presentatie start op tijdstip 0 en duurde drie seconden. B) toont hetzelfde als in A), maar voor paddestoel lichaam extrinsieke neuronen (NL). De in matrix A) kan gezien worden als een PN populatie vector geur tijdens stimulatie met 1-hexanol. We berekenden de zelfde soort bevolking vector tijdens geur stimulatie met 2-octanon en gebruikt zowel vectoren in een principale componenten analyse (PCA) het bijhouden van de tijdsdimensie. C) De eerste drie hoofdcomponenten (PC1, 2 en 3) warenuitgezet tegen elkaar om de geur scheiding in de PN ensemble activiteit op de antennaal kwab uitgang illustreren. De tijd voordat geur onset wordt gemarkeerd in het zwart. Activiteit gedurende drie seconden van stimulatie met 1-hexanol wordt weergegeven in blauw. De activiteit tijdens stimulatie met 2-octanol wordt in rood weergegeven. Verder tonen we 1,5 seconde (post) van de activiteit na de geur van een set 1-hexanol (licht-blauw) en 2-octanonen (roze). Merk op dat bij de PN ensemble niveau, zowel geuren roepen zeer verschillende trajecten vestigen in een "vast punt", die overleeft de hele geur stimulatie periode. Pas na geur compenseren de trajecten terug te gaan naar de basislijn activiteit zonder geur stimulatie. D) Dezelfde analyse werd gedaan op de NL ensemble niveau dat de activiteit op de paddestoel lichaam uitgang. Vergeleken met de PN activiteit geuren roepen een minder duidelijk traject. Verder zou een "vast punt" is niet waarneembaar. De aanvankelijk geur geïnduceerde trajecten intermingle met een uitgangswaarde van de activiteit, hoewel de geur nog steeds aanwezig is. Alleen de geur offset opgeroepen een extra traject.

. Film 1 Tijdopgeloste evaluatie van een geur geïnduceerde traject na belangrijkste analyse van een PN-populatie vector (links) en een NL bevolking vectorcomponent. (rechts;. cp figuur 6) De bovenste delen zijn de eerste drie hoofdcomponenten (PC1, 2 en 3) uitgezet tegen elkaar. De onderste panelen tonen de evaluatie van PC1, 2 en 3 in de tijd. Geur stimulatie wordt gekenmerkt door de grijze balk. Alle panelen gesynchroniseerd. Merk op dat de EN bevolking activiteit begint iets eerder PN populatie activiteit, een verschijnsel dat lijkt contraintuitive beschouwd maar worden verklaard door de connectiviteit en eigenschappen van de betrokken lagen, die eerder ¹ besproken.

Discussion

Dit artikel legt de productie en het gebruik van op maat ontworpen multi channel micro draad-elektroden. De beschreven elektroden zijn geschikt voor het opnemen van zowel de eenheid en de bevolking activiteit die is vooral handig voor latency metingen en andere tijdelijke respons eigenschappen van verschillende neuronen en verschillende neuropils binnen een enkel exemplaar (voor details zie ^1,2,25). Daarnaast hebben we laten zien hoe de micro draadelektroden permanent implementeren om stabiele lange-termijn-opnames in gedragen honingbijen die laatste uren tot dagen mogelijk te maken.

Extracellulaire multi-unit opnames werd een gunstig hulpmiddel om hoge temporele resolutie gecombineerd met ruimtelijke informatie te bereiken. In ons geval zijn dit hetzij parallel neuronale stukken of ² twee verschillende neuropils ^1. Meerdere neuronen kunnen worden opgenomen en geanalyseerd op het enkel neuron niveau parallel aan en op hoge temporele resolutie. Multi-unit opnemengen werden voor het eerst toegepast bij zoogdieren ³⁸ en later ook bij insecten ^39-41. Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt met de ontwikkeling en verbetering van extracellulaire multi-channel opnametechnieken ^42,43. Dit, bijvoorbeeld, omvat de ontwikkeling van nieuwe elektroden ⁴⁴ of nieuwe spike sorteren en clustering algoritmes ^45. Algemene methoden van extracellulaire multi-unit opnametechnieken zijn goed beschreven ^46-48. De zelfgebouwde elektroden getoond in deze video kan bovendien worden aangepast door het toevoegen van meer microwires per elektrode of de micro draden kunnen worden gedraaid om meetbare constante afstanden tussen de tips te krijgen. Beide procedures zou echter leiden tot afnemende flexibiliteit en toenemende dikte van de elektrode.

In vergelijking met silicium sondes gebruikt voor extracellulaire registraties in veel grotere insecten zoals de havik mot, sprinkhanen en kakkerlakken ^{40,49 - 51} beschreven micro draad-elektroden kleiner, flexibel en kan gemakkelijk omgaan met eventuele veranderingen hersenen en dus betrouwbaar kan worden gebruikt in kleine sociale insecten zoals bijen en mieren die een veel bredere gedragsrepertoire vertonen. De meeste siliconen sondes hebben scherpe schacht achtige structuren snijden axonen en zenuwweefsel langs hun inbrengen kanaal, terwijl de beschreven micro draden zijn rond, flexibel en kleiner en zijn dus minder schadelijk voor het omringende weefsel dat is een duidelijk voordeel als het doel is lang om te studeren termijn plasticiteit in een intact en gedraagt ​​dier. Een ander voordeel van micro draadelektroden is hun lage kosten productie en de eenvoudige bediening. In plaats van zorgvuldige reiniging een dure siliconen sonde elektrode draden vers gesneden vóór hersenen inbrengen en dus gebrek congestieproblemen. Verder is het mogelijk om meer dan een micro draadelektrode gebruiken dezelfde preparaat ofwel ingevoegd in verschillende neuropiles ¹ or traktaten ² als we hier laten zien. Deze aanpak is vooral gunstig voor temporele aspecten zoals reactietijden en interacties op verschillende neurale verwerking niveaus te analyseren en te vergelijken.

Wij weten dat een extracellulair opgenomen signaal geeft niet cel-activiteit zodanig. Het is altijd een verbinding met de spanning activiteit rond de elektrode tip. Om de bron van het signaal het verschil van twee naburige micro draad kanalen binnen een elektrode wordt altijd berekend lokaliseren. Dus de bron van de steker signalen gebruikt om enkele eenheid activiteit extract waren altijd dichtbij een of de andere elektrode kanaal waardoor gemakkelijk te onderscheiden spike golfvormen. Signalen van verder weg, zoals spieractiviteit of activiteit van naburige neuropils bereiken beide elektroden tegelijk oproepen vergelijkbare vormen en amplitudes en volgens deze werkwijze worden verwijderd. Met behulp van de template matching techniek van Spike2,zijn wij zeer zeker om enkele eenheid activiteit, die niet hetzelfde is te verkrijgen, maar zeer dicht bij enkele neuron activiteit. Echter, de afgifte spike sortering worden voorkomen door intracellulaire meettechnieken.

Enkele cel opnames met ofwel scherpe elektroden of patch pipetten toestaan ​​diepgaande kennis over de fysiologische eigenschappen van een enkel neuron. Echter, vanwege de geringe omvang van insecten neuronen en hun neurites (bv., Minder dan 1 micrometer voor honingbij PN ⁵²⁾ alleen op korte termijn opnames zijn beheersbaar. Bovendien zou intra cellulaire opnames invasief zijn en zou de cel die mogelijk een andere reden voor de tijdelijke beperkingen schaden. In vivo intracellulaire opnames bij insecten zelden overleven een uur. Een tijdvenster die voldoende is voor het baanbrekende werk van Martin Hammer ⁵³ die intracellulair opgenomen van een enkel geïdentificeerd neuron, het ventrale ongepaarde maxilar neuron # 1 (VUMmx1) was. Hij kon linkt zijn activiteit rechtstreeks aan de beloning weg. Juliane Mauelshagen ⁵⁴ intracellulair registreerde de activiteit van een geïdentificeerde paddestoel lichaam extrinsieke neuron, de Pedunculus extrinsieke neuron # 1 (PE1) tijdens klassieke conditionering. Dezelfde neuron was de focus van Menzel en Manz ⁵⁵ toen ze LTP na elektrische stimulatie van Kenyon cellen. Echter, Okada en collega's ⁵⁶ kon de intracellulair goed gekarakteriseerde stekelige patroon (twee-en driepersoonskamers spikes) gebruiken voor de identificatie van de PE1 tijdens extracellulaire opnames. Immers een combinatie van beide methoden kan intracellulaire opnames van geïdentificeerde neuronen en extracellulaire langdurige opnames een krachtig hulpmiddel voor toekomstige onderzoeken zijn.

Echter, het gebruik van scherpe elektroden op meerdere cellen (eenheden) tegelijkertijd op te nemen op verschillende niveaus verwerking gedurende vele uren tot dagen aan hun tijdelijke respons relaties en / of zelfs plastic veranderingen analyseren ibijna onmogelijk.

Met de eerste calcium beeldvorming benaderingen in de honingbij ^57,58 behulp van calcium-gevoelige kleurstoffen de analyse van ruimtelijke patronen van geur reacties waren toegankelijk ^59-62. In veel gevallen calcium gevoelige kleurstoffen moeten worden ingevoerd om het hersenweefsel via invasieve manipulaties die de bij de levensduur en de intrinsieke eigenschappen van de geanalyseerde cellen weer beperken. Dit probleem wordt ondervangen in andere model organismen zoals de fruitvlieg met behulp van genetisch geïntroduceerd calcium sensoren ^63,64. In het algemeen, calcium sensoren kunnen andere beperkingen invoeren als ze kunnen optreden als calcium buffers die waarschijnlijk invloed hebben op de temporele eigenschappen van geur reacties. Gelijktijdige intracellulaire opnames in combinatie met calcium imaging of computationele benaderingen kunnen bewijzen dat de juiste temporele resolutie van beeldvormende processen ^65,66. Echter, de temporele resolutie van de beeldvorming proces zelf is rather beperkt. Optische acquisitie systemen gebruiken meestal CCD-beeldvorming met een temporele resolutie van 5-20 Hz ^67, hoewel 2-Photon-Imaging zou kunnen sneller sequenties ⁶⁸ te verwerven. Echter, het verhogen van sampling rate gaat altijd samen met een verlies aan ruimtelijke resolutie. Verder is de calcium-gevoelige kleurstoffen dat bij de honingbij ondergaan bleken, waardoor ook acquisitietijd ^69.

Vergeleken met andere fysiologische opnametechnieken bij insecten onze flexibele multi-channel micro-draadelektroden garanderen een lange-time toegang tot eenheid en de bevolking neuronale activiteit in gedragen bijen.

We zien hoe twee van deze elektroden gebruikt in verschillende bewerkingsstappen in hetzelfde dier, waarbij de analyse van temporele codering aspecten van de verschillende opname-gebieden vergemakkelijkt. Afhankelijk van de probleemstelling en het model insect de basismethode van de elektrode gebouw hier aangetoond is gemakkelijk uit te breidenstaat en / of kan worden aangepast. Zo is het denkbaar dat meer dan drie afzonderlijke aders om meerkanaals elektroden produceren. Bovendien kan het aantal opnamen locaties worden uitgebreid en observeren temporele aspecten van meer dan twee stukken of neuropils haalbaar. Onze hoop is dat deze methode veel wetenschappers zal inspireren en zal een positieve bijdrage leveren aan het begrip van geavanceerde neuronale verwerking in kleine hersenen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraffin oil	Fluka	76235
Geuren	Sigma Aldrich
PBS			pH 7.2
4% Formaldehyde	ThermoScientific	28908	Methanol vrij
Triton X	BioChemica	A1388
Methylsalicylaat	Roth	4529.1
Tetramethylrhodamin dextran, 10.000 MW (Microruby)	Invitrogen	D7162	donker bewaren
Alexa 488 hydrazide	Invitrogen	A-10436	donker bewaren
Alexa 568 hydrazide	Invitrogen	A-10437	donker bewaren
Bee Ringer Oplossing	zie Brill et al.2
Polyurethaan gecoate koperdraad	Elektrisola	15 µm diameter & P155 isolatie
Tandartswas	Densply Detrey	64103015S1	matig smeltpunt
Tandartswas	Flexaponal	124-202-00	laag smeltpunt was
KWIK SIl	WPI	03L
18 Pin Socket	Conrad Electronic	189634-62
Heet smeltende lijm	Conrad Electronic	827673
Soldernaald	Conrad Electronics	830283	12 V
Soldeerklem	Conrad Electronic	531901
Glaselektroden	WPI	1B100F-3
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-20	V2A 0.2 x 12 mm
Wisselbare hoofdstuk	Tucer Davis Technologies	SH16
Hoofdverbindingsmodule	NPI	INT-03M
Versterkermodule	NPI	PDA-2F
Dataverwervingskaarten	National Instruments	NI-6123, Ni-6143
Verwervingssoftware	National Instruments	Lab View 8.2	aangepast ontwerp
Spike-Sortering	CED	Spike 2 v7.11
Matlab	Mathworks	R2008B
Micromanipulator	Leitz		handmatig
AG-draden	WPI	AGT05100
Confocal laser scanning microscoop	Leica	TCS SP2 AOBS
AMIRA	Mercury Computer Systems	2/5/2000