Meten Functie Respiratory in Muizen met behulp van Ongebreideld Whole-body plethysmografie

Samenvatting

De beoordeling van respiratoire fysiologie is traditioneel ingeroepen technieken, die beperkingen of sedatie van het dier nodig. Ongebreideld hele lichaam plethysmografie, echter zorgt voor een nauwkeurige, niet-invasieve, kwantitatieve analyse van respiratoire fysiologie in diermodellen. Bovendien kan de techniek herhaalde respiratoire evaluatie van muizen waardoor longitudinale studies.

Samenvatting

Disfunctie van de luchtwegen is een van de belangrijkste oorzaken van morbiditeit en mortaliteit in de wereld en de sterfte blijven stijgen. Kwantitatieve beoordeling van de longfunctie in knaagdier modellen is een belangrijk instrument in de ontwikkeling van toekomstige therapieën. Veelgebruikte technieken voor het beoordelen van de respiratoire functie, waaronder invasieve plethysmografie en gedwongen oscillatie. Hoewel deze technieken waardevolle informatie kan gegevensverzameling beladen met voorwerpen en experimentele variabiliteit vanwege de noodzaak voor anesthesie en / of invasieve instrumenten van het dier. Daarentegen ongeremd gehele lichaam plethysmografie (UWBP) biedt een nauwkeurige, niet-invasieve, kwantitatieve wijze waarop parameters respiratoire analyseren. Deze techniek vermijdt het gebruik van anesthesie en beperkingen, die gemeenschappelijk traditionele plethysmografie technieken. Deze video zal de UWBP procedure inclusief de apparatuur instellen, kalibratie en longfunctie opname te tonen. Hetzal uitleggen hoe te analyseren van de verzamelde gegevens, alsmede identificeren experimentele van outliers en artefacten als gevolg van verplaatsingen van dieren. De respiratoire parameters verkregen met deze techniek zijn ademvolume minuut volume, inspiratoire duty cycle, inademingsdebiet en de verhouding van inspiratie tijd tot vervaltijd. UWBP is niet afhankelijk van gespecialiseerde vaardigheden en is goedkoop kunnen worden uitgevoerd. Een belangrijk kenmerk van UWBP en meest tot potentiële gebruikers, is de mogelijkheid om herhaalde metingen van longfunctie voeren op hetzelfde dier.

Inleiding

Long disfunctie is een van de belangrijkste oorzaken van morbiditeit en mortaliteit in de wereld. De aandoening wordt gekenmerkt door onvoldoende zuurstof uitwisseling, synoniem met hoesten, pijn op de borst en kortademigheid. Respiratoire aandoeningen goed voor ~ 10% van de sterfte wereldwijd ^1. Volgens de World Health Organization, zijn de sterftecijfers gaan stijgen als gevolg van aanhoudende roken, vervuiling en beroepsmatige irriterende stoffen. UWBP is een nuttige aanvulling voor het bestuderen longfysiologie, die sterk complimenten traditionele biochemische en histologische analyse ^2. Andere procedures gebruikt voor long evaluatie niet dezelfde voordelen bieden als UWBP. Invasieve plethysmografie is een veelgebruikte techniek die moet het dier wordt verdoofd ^3,4 en wat leidde respiratoire metingen niet altijd weergeven natuurlijke staat. Verder is de eis voor de mechanische ventilatie en chemische uitdagingen beletsel voor toekomstige metingen ^3,4.Een andere werkwijze voor het verzamelen van respiratoire gegevens geforceerde oscillatie, die gevoeliger is voor veranderingen in parameters respiratoire fijnere opzichte UWBP ^5. Gedwongen trilling is echter een invasieve techniek en vereist dierlijke beëindiging voor gegevensverzameling ^5-7.

UWBP betreft het plaatsen van een dier in een gespecialiseerde kamer. Tijdens inspiratie, wordt de getijden lucht opgewarmd en bevochtigd in de longen toenemende waterdamp druk en veroorzaakt thermische uitzetting van gas ^8. Dit effect veroorzaakt een netto verandering in de lucht volume creëren van een verhoging van de druk in de plethysmograph kamer ^8. Het omgekeerde gebeurt tijdens de uitademing tot een ademhalingsgolfvorm van het dier. Golfvorm analyse wordt vervolgens gebruikt voor het meten van de luchtwegen trace: ademhalingsfrequentie (ademhalingen / min), de totale ademhalingscyclus (sec), inspiratie / expiratie tijd (Ti / Te, s) en veranderingen in druk aan elk slagvolume (P _T). Figuur 1 illustreert elk metingen oorsprong van een respiratoire trace. Deze metingen zijn eenvoudig te berekenen en meerdere parameters ademhalingswegen kan uit deze metingen. Deze parameters zijn onder meer: ​​Tidal volume (de hoeveelheid lucht verplaatst tussen normale inademing en uitademing), minuut volume (volume gas ingeademd uit de longen per minuut), inspiratoire duty cycle (het percentage van de inspiratie tijd om de totale ademhaling cyclusduur) en inademingsdebiet (de hoeveelheid lucht geïnspireerd in een bepaalde tijd).

UWBP levert nauwkeurige, niet-invasieve, kwantitatieve analyse van ademhalingsfysiologie in diermodellen kunnen worden gebruikt voor het meten van de progressie van ademhalingsziekte en longfunctie ^6,9. In tegenstelling tot andere technieken plethysmografie, UWBP vermijdt het gebruik van anesthesie, beperkingen en invasieve manipulaties die artefacten en experimentele variabiliteit ^6,9 produceren. Anesthesie kan onderdrukken ademhaling,verandert de hartslag en kan een uitdaging zijn om te reguleren ¹⁰ zijn. Beperkingen veroorzaken een toename van de ademhaling als gevolg van extra belasting via corticosteron en adrenaline los ^11,13. Het belangrijkste kenmerk van UWBP wordt herhaald fysiologische beoordeling waardoor het vatbaar is voor longitudinale studies. UWBP wordt ten zeerste aanbevolen voor de longitudinale beoordeling van longfysiologie en biedt een waardevolle vaardigheid voor de toekomst van de luchtwegen drug evaluatie.

Bleomycine, ovalbumine en hypoxie zijn gebruikt respiratoire problemen veroorzaken in verscheidene studies en UWBP succesvol gemeten accurate long fysiologische beoordeling ^7,9,13-16. De beschreven protocol is ontworpen voor standaard volwassen laboratoriummuizen. Echter UWBP aangepast aan andere dieren, zoals ratten, cavia's en primaten ^17-20. UWBP beperkt zich niet alleen tot het beoordelen longdisfunctie maar is ook gebruikt voor de beoordeling van longrijping ^3.De veelzijdigheid, eenvoud en reproduceerbaarheid van UWBP hebben een uitstekende techniek voor het beoordelen van de longfunctie bij dieren vastgesteld. Diverse software (zie materialen en apparatuur tabel) zal nodig zijn om deze procedure te volgen. Een ervaren wetenschapper zou kunnen dit protocol uitvoeren met een muis binnen 1 uur.

Protocol

OPMERKING: De volgende experimentele procedure is goedgekeurd door de Animal Ethics Committee aan de Monash University en uitgevoerd in overeenstemming met de Australische Code of Practice voor de zorg en het gebruik van dieren voor wetenschappelijke doeleinden (2006). Volwassen vrouwelijke C57BL / 6 muizen gebruikt om de representatieve resultaten genereren werden verkregen uit de Monash Animal Services. De muizen werden gehuisvest in een specifieke pathogeenvrije, temperatuur en vochtigheid kamer met een 12 uur licht-donker cyclus. Deze muizen hadden vrije toegang tot voedsel en water.

1 Eerste installatie

1. Sluit de laptop / desktop met de data-acquisitie apparaat voor het opnemen via een USB-kabel.
2. Sluit de Bridge-versterker van 'output 1' naar 'ingang 1' van de data-acquisitie apparaat via een BNC-kabel.
3. Plaats de druksensor in het 'kanaal 1' van de Octaal Bridge Amp. Zet de data-acquisitie apparaat aan en open de analyse software. De software moet automatischautomatisch detecteren het installeren van apparatuur (zie materialen en apparatuur tabel).
4. Open Kanaal instellingen vinden in de setup tool bar van de software. Verander het aantal kanalen dat wordt opgenomen tot 1.
5. Het opzetten van de barometer op ruimtedruk en de waterkolom apparaat te kalibreren de brug versterker te meten. De waterkolom apparaat omvat twee 5 ml spuit serologische pipetten verbonden door kunststof buizen.
6. Vul de kolommen met water en zorgen voor de waterstanden in balans zijn met een liniaal. Verbind een stuk plastic slang aan de bovenzijde van elke pipet. Figuur 2 toont de waterkolom opstelling.

2 Bridge Versterker Calibration

Opmerking: Om de brug versterker kalibreren een injectie van lucht in de waterkolom is vereist om een 1 cm H ₂ O doorbuiging te creëren. Dit zal gebeuren onder een aantal voorwaarden en is afhankelijk van apparatuur van de gebruiker. Ter verduidelijking van deze stappen demonstrate hoe dit laboratorium de kalibratie zou presteren.

1. Trekken van een 1 ml spuit om 300 ul; Bevestig de spuit aan de plugkraan aan het uiteinde van de slang aan de rechterkant van de waterkolom. OPMERKING: Zorg ervoor dat de kraan open staat voor de spuit en de waterkolom, en sloot aan de lucht in de ruimte. Als de waterstanden niet in evenwicht zijn op dit punt, draai de kraan zodat het open lucht in de ruimte en de waterkolom, zal deze het water in evenwicht te brengen. De buis aan de linkerkant van de kolom water moet worden aangesloten op de drukomvormer aan de drukverandering veroorzaakt door dompelen de spuit gemeten.
2. Sluit de slang van de waterkolom aan de linkerkant op de connector op de druksensor (bovenste ring van de transducer).
3. Selecteer het scroll down menu gevonden naast kanaal 1 op het hoofdscherm op de rechterkant van de software en selecteer "Bridge amp" (zie materialen en apparatuur tabel).
4. Voerde instellingen tot 5 mV, 20 Hz low pass, vinkt u het 'omkeren' en klik op 'nul'. Klik op 'nul' aan het spoor vastgesteld op ~ 0 mV. Verminder grootte van het venster tot 4: 1 voor een betere weergave.
5. Met alles zetten, drukt u de 1 ml spuit, laat het gedurende 3 sec. Dit zal een plotselinge piek op de software tonen omdat de druk veranderd. Wanneer 300 pl wordt ingedrukt zal de druk het water bewegen in de waterkolom van 1 cm. Deze bekende waarde zal helpen kalibreren de brug versterker.
   OPMERKING: De drukverhoging in de kamer door de 300 ul depressie overeenkomt met de P _K-waarde voor latere berekeningen.
6. Selecteer 'ingang eenheden' te vinden op de linker benedenhoek van het venster Bridge Amp.
7. Markeer de "achtergrond trace" voorafgaand aan de piek wel bekend als de 'Zero Gewest'.
   1. Klik op de pijl naast 'punt 1' en dit zal de bac producerenkground signaal binnen het traject van -0,002 mV-0.002 mV (de waarde nooit precies bij 0 mV).
   2. Type "0" in het venster grenzend aan het achtergrondsignaal venster.
8. Markeer de "verhoogde druk gebied van de grafiek" van wanneer de spuit wordt ingedrukt. Klik op de pijl naast het punt 2 en de waarde zou moeten zijn in het bereik van 0,9-1,2 mV.
   1. Type "1" in het venster naast het venster "verhoogde druk". Voor een visuele toelichting op de stappen 2.7 en 2.8 hebben betrekking op 3. Waarden gevonden buiten het genoemde bereik kan schade aan de Octaal Bridge Amp Figuurnummers.
9. Ga naar 'definiëren eenheden' te vinden op de rechter bovenhoek van het venster en selecteer "cmH ₂ O". Als deze optie niet beschikbaar is, kan deze handmatig worden ingevoerd. Klik op ok.
10. Terug naar de 'Bridge Amp' menu (zie 2.1). Selecteer 1 mV en zet de versterker op 'nul';. Dit zal kalibratie te voltooien en de waterkolom kan veilig worden verwijderd.

3 Opname Longfunctie

1. Weeg de muis (g). OPMERKING: Een week voorafgaand aan fysiologische evaluatie te introduceren op de muis om de plethysmografie kamer milieu. Dit zal helpen bij de acclimatisatie en het verminderen van stress bij het uitvoeren van deze procedure op een later tijdstip. Voor een algemeen schema waaruit de UWBP setup, zie figuur 4.
2. Meet de lichaamstemperatuur met een rectale thermometer. Smeer de thermometer met vaseline vóór het inbrengen. Noteer de temperatuur lezen en reinig het smeermiddel af met 80% (v / v) ethanol. Bij gebruik van zeer kleine dieren zoals muizen neonatale pups, kan de gemiddelde lichaamstemperatuur waarde bepaald met een infrarood thermometer plaats.
3. Plaats de temperatuur / relatieve vochtigheid sonde op de een-gat einde van de plethysmografie kamer. Noteer de temperatuur, vochtigheid en barometric druk binnen de plethysmografie kamer voor het plaatsen van de muis in.
4. Plaats de muis in de plethysmography kamer, bedek het open uiteinde lichtjes. Hierdoor kan de muis om te acclimatiseren. Sluit de tank af.
5. Met de temperatuur / luchtvochtigheid sonde ingebracht in de zijkant van de plethysmografie kamer met een gat, nu plaats de transducer en de spuit in de andere kant met de twee gaten.
6. Druk op 'Start' op het programma en het record voor ongeveer 15-45 sec. Record 5-10 sec van gegevens waar het dier niet beweegt. Beweging zal basale ademhalingsfysiologie van het dier veranderen en bieden slechte resultaten. Ademhaling moet oscilleren in een lineaire baan over het programma. Dit zijn bruikbare gegevens. Opmerking: Urination of ontlasting kan leiden tot een verhoging van de temperatuur en vochtigheid in de kamer plethysmografie. Dit zal de resultaten verduisteren tijdens de analyse. In het geval van de plassen of ontlasting, stop dan onmiddellijk met het opnemen en het reinigen van de plethysmography kamer met 80% (v / v) ethanol. Zie Figuur 6 voor een visuele weergave van suboptimale resultaten, waar de gegevens moeten worden afgewezen.
7. Na het opnemen van 45 seconden, druk op 'Stop' op de software (zie materialen en apparatuur tabel) programma. Verwijder de muis uit de plethysmography gehaald, terstond de kamer temperatuur en vochtigheid op te nemen. Niet voortdurend op te nemen voor meer dan 45 seconden, omdat dit het dier kan benadrukken.
8. Zet de muis aan zijn kooi, spray en veeg de kamer met 80% (v / v) ethanol.
9. Laat de kamer drogen en weer normale temperatuur en vochtigheid alvorens naar de volgende muis. Herhaal stap 3,1-3,9 voor daaropvolgende dieren. Opmerking: Als er meerdere dieren worden bestudeerd, ervoor te zorgen dat de kamer temperatuur en vochtigheid terugkeer naar bijna de uitgangswaarden voor elk nieuw dier wordt in de kamer.

4 plethysmografie Analyse

Geente: Om respiratoire parameters zoals tidal volume (V _T) en de minuten volume de volgende variabelen moeten worden gemeten te berekenen: de ademhalingsfrequentie (ademhalingen / min), de totale ademhaling cyclus (sec), inspiratie / expiratie tijd (Ti / Te, seconden) en verandering in druk door elke slagvolume (P _T). Figuur 1 illustreert de variabelen die kunnen worden gemeten vanaf een spoor. De volgende stappen met behulp van software (zie materialen en apparatuur tabel) om deze variabelen te meten. Bij het analyseren, voorkomen gebieden van het trace met snuiven of beweging. Om reproduceerbare resultaten, ten minste 5 seconden goede ademhaling spoor vereist. Voor een voorbeeld van verschillende ademhaling sporen zie Figuur 5 en 6.

1. Open het volledige scherm, ingesteld om 1: 1 en selecteer 5 sec van bruikbare gegevens. Een representatief overzicht van deze wordt getoond in Figuur 5.
2. Open de mini datapad venster bij de bovenkant van de program in het tabblad Datapad. Kies kanaal 1 en selecteer 'cyclus metingen' in de linkerkolom en de 'gemiddelde cyclische hoogte' in de rechterkolom.
   1. Selecteer 'Option' en zet de schaal voor minimale piekdetectie tot 1 (msec). Dit detectie van elke piekwaarde toe en wordt zeer belangrijk bij gebruik van kleine dieren met kleine oscillaties.
   2. Klik op 'OK'. Dit zal 'Pressure doorbuiging te wijten aan elk tidal volume' te presenteren (P _T) meting.
3. In de mini data pad, selecteert u 'cyclus metingen', gevolgd door 'event count' en klik op 'OK'. Dit wordt de 'frequentie' (f) meting te presenteren.
   1. Frequentie moet worden omgezet naar ademhalingen / min. Dit gebeurt door de waarde te vermenigvuldigen met 60 sec en het antwoord te delen door de totale tijd van de opname (min).
4. In de mini data pad, selecteert u 'cycle metingen ', gevolgd door' tijd 'en klik op' Ok '. Dit wordt de "totale ademhaling cyclustijd '(T _tot, sec) meting te presenteren.
5. De volgende stappen worden gebruikt om een ​​macroinstruction maken piek inspiratie en expiratie tijdwaarden genereren. Zorg ervoor dat de cursor zich direct boven het maximum van de piek / dal en voeg een commentaar op 9 opeenvolgende pieken en dalen. Begin met de top van de oscillatie zoals weergegeven in figuur 5.
6. Vervolgens selecteer venster: datapad en kolom 1 Klik in het venster dat verschijnt klikt u op 'keuze-informatie' in de linker kolom, 'duur' in rechterkolom en klik op 'OK'.
7. Kies macro gevonden op de top van het programma en vervolgens de opname. Selecteer nu commando's: 'Zoeken', 'Go', 'Start van de File' en klik op 'Zoeken'.
8. Selecteer commando: 'Zoeken' en 'Find reacties'. Typ dezelfde zin getypt voor de reactie box aan de 'met' vakje. Kies de 'Selecteer om Vorige Point' tab en 'Zoeken'.
9. Selecteer commando: 'Toevoegen aan data pad'. Vervolgens selecteert u de macro: macro-opdrachten en beginnen herhalen. Het aantal herhalingen venster dat verschijnt moet worden vastgesteld op 9.
10. Selecteer de opdracht: 'Zoek volgende'. Selecteer commando: 'In datapad'. Kies tenslotte macro-opdrachten en het einde herhalen.
    1. Selecteer nu de macro-en de opname te stoppen. Besparen en de naam van de macro nadat het dier nummer. OPMERKING: instellen macro voor elk dier kan de macro worden gebruikt voor longitudinale studies en bespaart tijd.
11. De macro kan nu worden uitgevoerd om de Inspiration (T _i) en de vervaldatum (T _e) de tijd tussen elke opmerking te verkrijgen. De gegevens zullen verschijnen onder kanaal 1 van de Datapad. Expiratie en inspiratie achtereenvolgens voorkomt en de gegevens zullen verschijnen in deze volgorde.
    1. De gegevens handmatig moeten worden gesplitst in inspiratie en expiratie waarden. Middel de vier gegevenswaarden van elke parameter de gemiddelde _Ti en T _e verkrijgen.
12. Zodra de primaire waarden afgeleid de tidal volume _(VT, ml) worden berekend. Om het ademvolume de vergelijking van Drorbaugh en Fenn ⁸ wordt gebruikt te verkrijgen:
    V _T (ml) ₌ (P _T / P _K) x (V _K) x ((T _CORE (P _B - P _C)) / (T _CORE (P _B - P _C) - T _C (P _{B -} P _CORE)))
    
    Waar
    V _T: Tidal Volume
    P _k: Pressure doorbuiging te wijten aan elke injectie van 1 ml (zie stap 2.5)
    T _kern: Kern temperatuur van elk dier
    P _C: Waterdampdruk bij kamertemperatuur X Relatieve luchtvochtigheid in chamber
    T _C: temperatuur in dierlijke kamer
    P _kern: Druk bij lichaamstemperatuur (waterdampdruk bij lichaamstemperatuur x 1.0)
    P _t: Pressure doorbuiging te wijten aan elk ademteugvolume
    V _k: Volume injectie voor kalibratie
    P _B: luchtdruk
    
13. Zodra het tidal volume is berekend kunnen de volgende parameters worden bepaald:
    • Minute Volume (ml / min) = V _T xf
    • Minute Volume (ml / min / kg) = (V _T xf) / lichaamsgewicht (kg)
    • V _T (ml / kg) = V _T (ml) / lichaamsgewicht (kg)
    • Inspiratoire Duty Cycle (%) = T _i / T _tot
    • Inspiratoire Flow Rate (ml / sec) = V _T / T _i
    • Verhouding van inspiratie tijd tot expiratie tijd = T _i / T _e
    • Totale cyclustijd (sec) = Inspiration (sec) + Vervaldatum (sec)

Resultaten

Wanneer deze procedure correct is gevolgd, wordt een consistente oscillerende spoor geregistreerd op de data-analyse software. De procedure voorziet in een respiratoire trace binnen een paar minuten na de installatie met een eenvoudige computer berekeningen op beursgenoteerde respiratoire parameters bepalen. Figuur 5 een geschikte adembescherming trace van een controle (gezonde) muis. Geschikte oscillerende data wordt geproduceerd wanneer het dier niet actief beweegt.

UWBP i...

Discussie

De beschreven techniek is een niet-invasieve methode voor het beoordelen van respiratoire parameters ongeremde en niet-verdoofde muizen. De sterke punten van dit protocol zijn onder meer de eenvoud en precisie om de longfunctie te meten in de lengte met minimale artefacten. Er zijn echter een aantal beperkingen en kritische stappen worden opgemerkt over de procedure. Eerst en vooral, dient de muis rust binnen de kamer ten minste vijf seconden verblijven. Extra stress zal het ademhalingspatroon van de muis te verstoren e...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
LabChart 7 software (voor Macintosh)	ADINSTRUMENTS	MLU60/7	gebruikt in protocol stap 4
PowerLab 8/30 (model ML870)	ADINSTRUMENTS	PL3508
Octal Bridge Amp (model ML228)	ADINSTRUMENTS	FE228
Zwarte BNC naar BNC kabel (1 m)	ADINSTRUMENTS	MLAC01
Macintosh OS	Apple Inc.		Mac OS X 10.4 of hoger
Surgipack Digitale Rectale Thermometer	Vega Technologies	MT-918
Grass volumetrische drukkoppeling PT5A	Grass Instruments Co.	Modelnummer PT5A; serienummer L302P4.
1 ml Spuit	Becton Dickinson (BD)	309628
5 ml Serologische spuit pipetten	Greiner Bio One	606160	Aangesloten via plastic buis
Balans/Weegschaal	VWR International, Pty Ltd	SHIMAUW220D	Elke weegschaal met een resolutie van 0,1 gram
HM40 Vocht & temperatuurmeter	Vaisala	HM40A1AB
Barometer	Barometer World	1586
Laboratoriumslangen	Dow Corning	508-101	Gebruikt om de waterkolom aan te sluiten op de spuit en de drukkoppeling
Cilindrische Perspex Kamer	Dynalab Corp.		Op maat gemaakte cilindrische kamer met interne afmetingen als volgt: 50 mm(b) x 1.500 mm(l). Er zijn twee deksels voor elke zijde, met afmetingen 80 mm(l) x 80 mm(b). Elk deksel heeft een 60 mm brede cirkelvormige gat gesneden op de voorkant van het deksel 50 mm diep. Dit zorgt ervoor dat de kamer in het deksel past. Een rubberen ring is geplaatst rond elk gat van het deksel waar de kamer past. Voor de bevestiging van de spuit en de drukkoppeling zijn de openingen 5 mm in diameter. Voor de bevestiging van de vochtigheidssonde zijn de openingen 25 mm in diameter.
80% Ethanol (4 L)	VWR International, Pty Ltd	BDH1162-4LP