Dit protocol Gegevens een gestroomlijnde methode voor live cell imaging uitvoeren in het kader van een intact larvale hersenen. Live cell imaging benaderingen zijn van onschatbare waarde voor de studie van asymmetrische neurale stamcellen divisies evenals andere neurogene en ontwikkelingsprocessen, consequent blootleggen van mechanismen die eerder over het hoofd gezien.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Stamcellen verdelen asymmetrisch twee nakomelingen cellen met ongelijke lot potentieel te genereren: een zelfvernieuwende stamcel en een differentiërende cel. Gezien hun relevantie voor ontwikkeling en ziekte, het begrijpen van de mechanismen die bepalen asymmetrische stamcellen divisie heeft een robuust gebied van studie geweest. Omdat ze genetisch handelbaar ondergaan opeenvolgende ronden van celdeling ongeveer eenmaal per uur, de stamcellen van de Drosophila centrale zenuwstelsel of neuroblasts, onmisbaar modellen voor de studie van stamcellen celdeling. Ongeveer 100 neurale stamcellen zijn gelegen nabij het oppervlak van elk van de twee lobben larvale hersenen, waardoor dit modelsysteem bijzonder bruikbaar voor levende beeldvorming microscopie studies. In dit werk, bespreken we verschillende benaderingen op grote schaal gebruikt om stamcellen divisies visualiseren, en we pakken de relatieve voor-en nadelen van de technieken die in dienst gedistantieerd versus intacte hersenen weefsels. We hebben ook detail onze simplifIED protocol dat wordt gebruikt om hele hersenen explanteren uit derde instar larven voor live cell imaging en vaste analyse toepassingen.
Inleiding
Stamcellen handhaven van een balans tussen differentiatie en zelfvernieuwing om cellulaire diversiteit te genereren tijdens de vroege ontwikkeling en beschadigde cellen in volwassen weefsels. Regulering van deze homeostase voorkomt zowel verlies en over-expansie van de stamcelpopulatie, wat kan leiden tot schadelijke weefsel degeneratie of tumorvorming.
Neuroblasts (NBs) zijn uitgebreid bestudeerd neurale stamcellen van de Drosophila centrale zenuwstelsel (figuur 1A) die eerste vorm tijdens embryonale stadia 1, 2. NBs ondergaan herhaalde rondes van asymmetrische celdeling (ACD) tot twee ongelijk gedoem....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van de Benodigde aan derde Instar Larvale Brains Explanteer
- Bereid je gereedschap nodig voor microdissection.
- Smeden twee ontleden gereedschap (een scalpel en een haak) door eerst een dissectie pin in elke pin houder. Beveilig de pennen stevig met de hand of met een tang (figuur 1C).
- Gebruik een paar oude tang om een ontleden pin buigen tot een ongeveer 120 ° hoek. Doe dit onder een dissectie microscoop om ervoor te zorgen dat de bovenste helft van de pen plat wanneer de pen houder wordt gehouden in de hand. Deze tool zal gebruikt worden als een scalpel ingedrukt te houden of snijden door weefsel.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Live-beeldvorming heeft een aantal mechanismen die NB ACD opgehelderd. Vóór beeldacquisitie, moet de optimale imaging omgevingsomstandigheden. Het is noodzakelijk om het frame opnamesnelheid afwegen tegen de duur van live cell imaging. Voor fijne cellulaire analyse, bijvoorbeeld, verhoogde tijdelijke en optische resolutie kan worden verlangd. Bij het visualiseren van een enkele NB celcyclus (Figuur 4A), kan de snelheid waarmee beelden worden vastgelegd worden verhoogd zonder de invoering van photodama.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Live cell imaging is een waardevolle benadering gebruikt om de mechanismen die ACD van stamcellen, de differentiatie van cellijnen reguleren te bestuderen, en de morfogenese van complexe weefsels. Hoewel onderzoeksgroepen verleden zijn gebruikt verschillende technieken om te visualiseren NB ACD, kunnen deze benaderingen algemeen worden ingedeeld in twee categorieën die vooral verschillen met betrekking tot de vraag of het hersenweefsel intact wordt gelaten of gescheiden.
Imaging los NBs heef.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de verdeling van de intramurale onderzoek aan de National Institutes of Health / NHLBI (1ZIAHL006126) en een Lenfant Biomedische Postdoctoraal Fellowship toegekend aan DAL.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Lumox weefselkweekschaal 50 x 12 mm | Sarstedt | 94.6077.410 | Een herbruikbare kweekschaal met een gasdoorlatende en optisch heldere filmbasis. |
| Schneider's S2 Medium | Invitrogen | 21720-024 | |
| Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x) | Invitrogen | 15240-062 | Een supplement dat penicilline (10.000 U/ml), streptomycine (10.000 μg/ml) en amfotericine B (25 μg/ml) bevat dat wordt toegevoegd aan Schneider's S2 media om bacteriële en schimmelbesmetting te voorkomen. |
| Glazen dekglasjes, #1.5 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Halocarbon olie 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | Een traag vloeibare, inerte olie die helder en kleurloos is. |
| Paar nikkel-geplateerde speldhouders, 17 cm lang | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Paar Dumont #5 Pincetten | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dissectie naald/sonde met plastic handgreep | Fisher Scientific | 08-965-A | |
| Spuitfilter, 0,22 μm poriegrootte | Fisher Scientific | 09-719A | |
| Spuit, 5 ml | BD Biosciences | 309646 | |
| Kunststof overdrachtpipet | Fisher Scientific | S30467-1 | |
| Paraformaldehyde, 32% EM-kwaliteit | Electron Microscopy Sciences | 15714 | VOORZORG: Formaldehyde is giftig; het moet in een afzuigkap worden behandeld. Volg MSDS-richtlijnen voor veilig gebruik. |
| DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindole, dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Een kleurstof die DNA labelt en wordt aangeslagen door UV-licht. |
Referenties
- Truman, J. W., Bate, M. Spatial and temporal patterns of neurogenesis in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Developmental Biology. 125, 145-157 (1988).
- Doe, C. Q. Molecular mar....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
