Methodenartikel

Modeling Astrocytoom Pathogenese In Vitro En In Vivo Met behulp van corticale Astrocyten of neurale stamcellen uit Conditional, genetisch gemanipuleerde muizen

DOI:

10.3791/51763

⸱

12 augustus 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine, 3Division of Neuropathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina School of Medicine, 5Biological and Biomedical Sciences Program, University of North Carolina School of Medicine, 6Department of Radiation Oncology, Emory University School of Medicine, 7Department of Neurology, Neurosciences Center, University of North Carolina School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fenotypisch wild-type astrocyten en neurale stamcellen die zijn geoogst uit muizen die zijn gemodificeerd met gefloxte, conditionele oncogeen allelen en getransformeerd via virale Cre-gemedieerde recombinatie, kunnen worden gebruikt om de pathogenese van astrocytomen in vitro en in vivo te modelleren door orthotopische injectie van getransformeerde cellen in hersenen van syngene, immuuncompetente nestgenoten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Huidige astrocytoommodellen zijn beperkt in hun vermogen om de rollen van oncogene mutaties in specifieke hersencellen te definiëren tijdens de pathogenese van de ziekte en hun nut voor preklinische geneesmiddelontwikkeling. Om een beter modelsysteem voor deze toepassingen te ontwerpen, werden fenotypisch wild-type corticale astrocyten en neurale stamcellen (NSC) van conditioneel, genetisch gemodificeerde muizen (GEM) die verschillende combinaties van gefloxte oncogene allelen bevatten, geoogst en gekweekt in cultuur. Genetische recombinatie werd geïnduceerd in vitro met behulp van adenoviraal Cre-gemedieerde recombinatie, resulterend in expressie van gemuteerde oncogenen en deletie van tumorsuppressorgenen. De fenotypische gevolgen van deze mutaties werden gedefinieerd door het meten van proliferatie, transformatie en medicijnrespons in vitro. Orthotope allograftmodellen, waarbij getransformeerde cellen stereotactisch in de hersenen van immuuncompetente, syngeneïsche nestgenoten worden geïnjecteerd, werden ontwikkeld om de rol van oncogene mutaties en celtype op tumorigenese in vivo te definiëren. In tegenstelling tot de meeste gevestigde humane glioblastoma-cellijn xenografts, produceerde de injectie van getransformeerde GEM-afgeleide corticale astrocyten in de hersenen van immuuncompetente nestgenoten astrocytomen, inclusief het meest agressieve subtype, glioblastoom, dat de histopathologische kenmerken van humane astrocytomen nadoet, inclusief diffuse invasie van normaal hersenparenchym. Bioluminescentiebeeldvorming van orthotope allograften van getransformeerde astrocyten die zijn gemodificeerd om luciferase te produceren, werd gebruikt om in vivo tumorgroei in de loop van de tijd te monitoren. Astrocytoommodellen die gebruikmaken van astrocyten en NSC die zijn geoogst uit GEM met conditionele oncogene allelen, bieden dus een geïntegreerd systeem om de genetica en celbiologie van astrocytoompathogenese in vitro en in vivo te bestuderen en kunnen nuttig zijn in preklinische geneesmiddelontwikkeling voor deze verwoestende ziekten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Astrocytomen zijn de meest voorkomende primaire hersentumor en glioblastoma (GBM), een graad IV astrocytoom, is de meest voorkomende en agressieve subtype met een mediane overleving van 12-15 maanden 1,2. Invasie van diffuse astrocytomen, vooral GBM, verzet zich tegen volledige chirurgische resectie, beperkt de effectiviteit van adjuvante therapie, en leidt onvermijdelijk tot na de behandeling herhaling 3. Patiënten die aanvankelijk aanwezig, hetzij met de novo (primaire) GBM of met lagere rang astrocytomas die onvermijdelijk vordert naar (secundaire) GBM 4. GBM is genomisch heterogeen en gekenmerkt door elkaar uit en co-voorkomende mutaties in genen die drie belangrijke signaalwegen geregeld: de G1 / S (Rb) celcyclus, receptor tyrosine kinase (RTK) en TP53 pathways 5-7. GBM bestaat uit vier genomische subtypen met verschillende expressie profielen die verschillende hersengebieden celtypes lijken, wat suggereert dat de GBM subtype is Inflube- stuurders door de cel van oorsprong 6,8,9. Betere astrocytoma modellen moeten de rol van specifieke combinaties van mutaties in bepaalde celtypen tijdens astrocytoom pathogenese definiëren. Gebruikmakend van deze modellen voor efficiëntere preklinische ontwikkeling van geneesmiddelen zal uiteindelijk helpen bij het verbeteren van patient outcomes. Huidige astrocytoom modellen zijn zowel gevestigde menselijke cellijnen, patiënt afgeleid xenograften (PDX), genetisch gemodificeerd normale menselijke astrocyten en neurale stamcellen (NSC), en genetisch gemanipuleerde muizen (GEM) 10-14. Ontwikkelden we een alternatieve, niet-kiembaan GEM (nGEM) model 15 met behulp van primaire hersencellen - corticale astrocyten en NSC - geoogst van GEM herbergen verschillende combinaties van floxed oncogene allelen. Het doel was om astrocytoma modellen met genetische gedefinieerde cellen die fenotypisch kan worden gekarakteriseerd in vitro en in vivo en mogelijk gebruikt voor preklinische ontwikkeling van geneesmiddelen in i genererenmmune-competente muizen.

Gevestigde humane cellijnen zijn de meest gebruikte model van astrocytoma pathogenese en drugs respons in vitro en in vivo. Zijn technisch eenvoudig, algemeen beschikbaar en zijn kinetiek en tumorigeniciteit bij orthotope xenografting gedefinieerd in immunodeficiënte muizen 10,11,16-18 . Hun nadelen zijn het onvermogen om gevestigde cellijnen van low-grade astrocytomen genereren, studie alleen om high-grade astrocytomen beperken; ontbreken van een bepaald cel van oorsprong; de aanwezigheid van complexe genomische afwijkingen, vaak genomic profielen die sterk afwijken van het oorspronkelijke bloedmonster; en gevoeligheid voor fenotypische en genotypische drift tijdens seriële cultuur in serum 11,17,19-22. De fenotypische gevolgen van individuele oncogene mutaties in bestaande humane GBM cellijnen kunnen worden gemaskeerd door de veelheid van afwijkingen die daadwerkelijk aanwezig zijn, die vaak uitsluit elucidation rechtstreeks genotype-fenotype gevolgen.

PDX worden opgewekt door subcutane passage van patiënt geïsoleerd astrocytoom cellen in immunodeficiënte muizen of door hun cultuur als niet-hechtende sferoïden in gedefinieerd serumvrij medium voordat orthotope injectie in de hersenen van immunodeficiënte muizen 12,23. PDX nauwkeuriger handhaven de genomische landschap van menselijke astrocytoma, maar vergelijkbaar met gevestigde humane cellijnen, kan het fenotypisch effect van afzonderlijke oncogene mutaties worden gemaskeerd door hun genomische complexiteit 19,24. De fenotypische gevolgen van specifieke oncogene mutaties definiëren, met name in reactie op nieuwe therapieën, zijn platen van gevestigde humane cellijnen of PDX vaak gebruikt om genotype-fenotype correlaties tonen generaliseerbaarheid en de kans cellijn-specifieke effecten te minimaliseren. Terwijl PDX nauwkeurig recapituleren de histopathologische kenmerken van de menselijke astrocytomas, incLuding invasie, orthotopische xenograften van gevestigde menselijke cellijnen algemeen niet 21,23,25. Bovendien normale humane astrocyten en NSC zijn genetisch gemanipuleerd met gedefinieerde oncogene mutaties model astrocytoma tumorigenese in vitro en in vivo 13,14,26. Deze cellen missen het genomische complexiteit van gevestigde humane cellijnen en PDX en nauwkeurig herhalen menselijke astrocytoma histopathologie, maar vereisen xenografting in immunodeficiënte knaagdieren in vivo. Omdat alle menselijke celmodellen nodig immunodeficiënte knaagdiergastheren immuungemedieerde xenograft afstoting te voorkomen, deze modellen niet de natieve tumor-stroma interacties van een syngene systeem recapituleren en missen een intact immuunsysteem, beperken preklinische onderzoek-stroma gerichte en immuun-modulerende therapieën 10,11.

GEM vergunning onderzoek van de fenotypische gevolgen van voorafbepaalde combinaties van oncogene mutaties in vivo tijdens in situ het ontstaan ​​van tumoren. Terwijl niet-conditionele GEM hebben mutaties in alle weefsels tijdens de ontwikkeling, kennen voorwaardelijke GEM oncogene allelen waarmee targeting van mutaties door het beperken Cre gemedieerde recombinatie specifieke celtypen door gebruik van celtype-specifieke promoters 10,11,15,18 floxed. Voorwaardelijke astrocytoma GEM zijn gebruikt om de functionele rol van oncogene mutaties in verschillende celtypes ophelderen binnen een intacte hersenen 11. De preklinische nut van in situ gliomagenesis die voorwaardelijke GEM wordt beperkt door een aantal factoren, waaronder 1) het ontbreken van een in vitro correlaat, 2) moeilijkheden bij het ​​genereren van grote cohorten van muizen met complexe genotypes, 3) lange latentie van in situ tumorontwikkeling , 4) en stochastische tumorprogressie. Omdat in situ tumorigenese mist een overeenkomstige in vitro model, drug testen in vitro kan worden uitgevoerd with conventionele voorwaardelijke GEM modellen. In tegenstelling tot andere kankers zijn voorwaardelijke GEM modellen van astrocytomen zelden geïnduceerd door enkele oncogene mutaties 11. Zo worden complexe fokprogramma's nodig om voorwaardelijke GEM met meerdere oncogene mutaties te genereren. Bovendien astrocytoma initiatie optreedt met variabele penetrantie na een lange latentieperiode in deze modellen, terwijl progressie naar hooggradige astrocytomen treedt meestal in een niet-uniforme, stochastische wijze en uiteindelijk leidt tot tumoren met complexe genomische landschappen en snelle groei kinetiek 27, 28. De variabele penetrantie en stochastische aard van kwaadaardige progressie in voorwaardelijke GEM modellen vereist dat individuele muizen worden gescreend door radiografische beeldvorming om de aanwezigheid en locatie van high-grade astrocytomen detecteren vóór hun inschrijving in preklinisch geneesmiddelenonderzoek. Tezamen bieden deze beperkingen belemmeren het genereren en testen van de grote cohorten van voorwaardelijke GEM nodig voor preClinical drugstests.

De RCAS-tva GEM-systeem, waarbij aviaire retrovirale (RCAS) vectoren gebruikt om GEM ontwikkeld om de virale receptor (tva) over specifieke neurale celtypes uiten infecteren, is uitgebreid gebruikt om het model astrocytoom tumorvorming 11. In tegenstelling tot voorwaardelijke GEM, dit modelsysteem maakt introductie van meerdere oncogene mutaties in specifieke celtypen zonder de noodzaak voor complexe fokprogramma's. Wordt echter beperkt door variabele penetrantie het vereiste van actief delende cellen virale integratie en de willekeurige insertie van transgenen in het gastheergenoom 29.

Non-kiemlijn GEM (nGEM) modellen die cellen geoogst GEM gebruiken, wordt steeds belangrijker omdat overwinnen veel van de beperkingen van andere modelsystemen 15. De rol initiëren celtype en co-voorkomende mutaties in astrocytoma pathogenese moeilijk te ontmoedigenmijne met behulp van bestaande humane GBM cellijnen of PDX omdat ze zijn afgeleid van het eindstadium van tumoren die uitgebreide genetische mutaties in undefined celtypen hebben opgebouwd in de loop van kwaadaardige progressie. Daarentegen kunnen alle soorten astrocytomen worden gemodelleerd met nGEM door het induceren gedefinieerde genetische mutaties binnen bepaalde gezuiverde hersenen celtypen 11,30. Aldus kan de invloed van specifieke genetische mutaties en celtype over cellulaire en moleculaire fenotypes worden bepaald in vitro en in vivo. Vergelijkbaar met bestaande humane GBM cellijnen, kan in eerste instantie in vitro drug testen met behulp nGEM worden gebruikt om drugs voor in vivo onderzoek met behulp van dezelfde cellen te prioriteren. Tumorigenese in vivo kan dan worden bepaald door allografting nGEM orthotopically cellen in de hersenen van immuuncompetente syngene nestgenoten 30. Deze orthotopische allogreffe modellen toestaan ​​daarom in vivo testen, niet alleen van conventionele cytotoxische eennd gerichte therapieën, maar immuun-modulerende en stroma-gerichte therapieën ook. Tenslotte kan de rol van het micromilieu op tumor initiatie en progressie worden bepaald door vergelijking van resultaten tussen nGEM en conventionele GEM modellen met dezelfde mutaties in dezelfde cel types.

Wij en anderen hebben astrocytoom nGEM ontwikkeld met behulp van primaire cellen - astrocyten, NSC, of oligodendrocyte voorloper cellen (OPC) - geoogst van GEM 30-34. De reden voor de ontwikkeling van een astrocytoom nGEM was een model om de fenotypische gevolgen van oncogene mutaties in specifieke celtypen die zouden kunnen worden gebruikt voor preklinisch onderzoek drug in vitro en in vivo in immuuncompetente dieren vast te maken. We geoogst fenotypisch WT corticale astrocyten en NSC uit niet-Cre uiten voorwaardelijke GEM gehandhaafd op een> 94% C57 / Bl6 achtergrond met floxed RB pad - Rb1 loxP / loxP of TgGZT121 - en floxed RTK / RAS / PI3K - Nf1 loxP / loxP, Kras G12D, Pten loxP / loxP - genen in verschillende combinaties 35-39. We geïnduceerde genetische recombinatie in vitro met adenovirale vectoren die coderen voor Cre recombinase. Omdat corticale astrocyten oogsten bevatten een mengsel van celtypen, gebruikten we Ad5GFAPCre vectoren of dominante oncogene transgenen, zoals TgGZT 121 gedreven uit de menselijke GFAP promotor, te verrijken voor GFAP + corticale astrocyten in deze culturen. Wij hebben de fenotypische gevolgen van G1 / S (Rb), MAPK en PI3K mutaties in corticale astrocyten en NSC in vitro en in vivo. MAPK en PI3K-route geactiveerd G1 / S-defecte astrocyten moleculair nagebootste menselijke proneural GBM en na orthotope injectie gevormde tumoren in een vooraf gedefinieerde locatie uniforme groeikinetiek korte latencies en de histopathologischeal kenmerken van de menselijke GBM 30. Longitudinale monitoring van tumorgroei in vivo bevordert preklinische testen geneesmiddel door normalisering behandeling cohorten en kwantitatieve analyse van tumorgroei in respons op de behandeling 40. We bepaald tumorgroei kinetiek door longitudinale bioluminescentie beeldvorming van muizen geïnjecteerd met luciferase uiten corticale astrocyten. Daarom corticale astrocyten en NSC afgeleid van voorwaardelijke GEM zorgen voor een soepel model systeem voor de bepaling van de functionele gevolgen van-astrocytoom-geassocieerde mutaties en een potentiële modelsysteem voor preklinische ontwikkeling van geneesmiddelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Universiteit van North Carolina Institutional Animal Care en gebruik Comite.

1 Kweken Corticale Astrocyten van Neonatale Muizen

  1. Voorbereiding
    1. Verkreukelen 2-3 moeilijke taak weefsels en plaats in de bodem van een kolf met 70% ethanol. Plaats ontleden schaar, gebogen tang en 2 paar straight micro tang in deze kolf. De weefsels worden gebruikt vermijden buigen van de micro tang.
    2. Voeg 1 ml HBSS een 60 mm weefselkweekplaat. Bereid een apart schaaltje voor elk dier en gerechten op het ijs te houden.
    3. Verdoven van dieren per institutionele regelgeving.
    4. Warm 7 ml DMEM met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine (compleet DMEM) voor elk dier in een 37 ° C waterbad. OPMERKING: Voor 5 muizen, stappen 1.1.1-1.1.4 duurt ~ 15 minuten.
  2. Tissue Oogst
    1. Sacrifice neonatale muis (dag 1-3) per Institutionale regelgeving.
    2. Verwijder ontleden schaar uit ethanol, laat ze afdruipen, en maak een sagittale snede in de huid over de schedel van het ruggenmerg naar de neus.
    3. Maak een snede in de schedel langs de pijlnaad, uitgaande van het ruggenmerg en tot voorbij de olfactorische bollen. Zorg ervoor dat de schaar tips zo dicht mogelijk het binnenoppervlak van de schedel om hersenweefsel te minimaliseren.
    4. Met gebogen pincet voorzichtig schil elk halfrond van het cranium zijwaarts weg van de hersenen.
    5. Het gebruik van rechte micro tang, zachtjes knijpen weg het dorsale gedeelte van elke corticale halfrond en plaats deze in de weefselkweek schotel met HBSS. Zorg ervoor dat de kleine hersenen en het reukorgaan te voorkomen. Gebruik geen tissue onder het corpus callosum niet nemen.
    6. Met behulp van een dissectie microscoop en 2 paar micro tang, verwijder voorzichtig de hersenvliezen van elke corticale halfrond. Terug de weefselkweek schotel naar ijs tot begin weefsel homogenization.
    7. Herhaal de stappen 1.2.1 tot 1.2.6 voor elk extra dier. OPMERKING: Voor 5 muizen, stappen 1.2.1-1.2.7 duurt ~ 30 minuten.
  3. Tissue Homogenisering
    1. Met behulp van een schoon scheermesje, fijn snijd de corticale hemisferen en beweeg de plaat naar een weefselkweek kap.
    2. Breng de blokjes weefsel in een steriele 15 ml conische buis. Was de plaat met 1 ml ijskoude HBSS en overbrengen naar de buis met weefsel.
    3. Wacht tot weefsel bezinkt op de bodem van de buis, verwijder dan zorgvuldig overmaat HBSS met een pipet.
    4. Voeg 2 ml kamertemperatuur trypsine / EDTA. Pipetteer ~ 10x met een pipet 1 ml verder dissociëren cellen.
    5. Incubeer de celsuspensie bij 37 ° C gedurende 15 - 20 minuten. Meng zorgvuldig door omkeren om de 5 minuten.
    6. Voeg 3 ml compleet DMEM trypsine te remmen. Pipetteer ~ 10x met een pipet 1 ml om de oplossing te mengen.
    7. Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
    8. Verwijderde supernatant met een pipet 1 ml. Niet zuig het medium omdat de pellet los kan zijn.
    9. Resuspendeer de pellet in 4 ml van 37 ° C voltooien DMEM. Breng de celsuspensie op een 75 cm schroefdop weefselkweek kolf. OPMERKING: Voor 5 muizen, stappen 1.3.1-1.3.9 duurt ~ 50 minuten.
    10. Ongeveer 16 uur na de oogst astrocyte, was de kolf met 4 ml van 37 ° C HBSS, voeg 4 ml van 37 ° C voltooien DMEM. Handhaving van de corticale astrocyten bij 37 ° C in 5% CO 2. OPMERKING: De wasstap is belangrijk voor het verwijderen van niet-hechtende cellen en afval uit de kweekschaal.
    11. Wanneer de cultuur is ~ 95% samenvloeiing, schudden overnacht bij 37 ° C in 5% CO 2, verwijder de media waarop de vrijstaande cellen, spoel daarna de fles met 4 ml van 37 ° C HBSS. Voeg 4 ml van 37 ° C voltooien DMEM en onderhouden cellen bij 37 ° C in 5% CO2. OPMERKING: Deze stap is belangrijk om culturen te corticale astrocyten te verrijken, zoals besmetting van microglia enoligodendrocyt progenitor cellen los met deze procedure en worden verwijderd uit de kweek 41.
    12. Herhaal stappen 1.3.1-1.3.11 voor elk dier.
  4. Inductie van genetische recombinatie
    1. 24 uur na het voltooien van stap 1.3.11 Vervang het medium met 2 ml van 37 ° C voltooien DMEM. Voeg 1 ml van 37 ° C SCM met 1 gl> 10 10 pfu / ml Ad5CMVCre of Ad5GFAPCre. Incubeer gedurende 6 uur bij 32 ° C in 5% CO 2 Voorzichtigheid: Gebruik BSL2 voorzorgsmaatregelen bij de omgang met recombinant adenovirus.
    2. Verwijder het virus bevattende media en voeg 37 ° C compleet DMEM zonder virus aan de corticale astrocyten. LET OP: Gebruik BSL2 veiligheidsmaatregelen bij het hanteren van recombinante adenovirussen en de virus-bevattende media per institutionele voorschriften weggooien. OPMERKING: Voor 5 astrocyten, de stappen 1.4.1 - 1.4.3 duurt ~ 15 minuten exclusief de 6 uur incubatie.
    3. Uitbreiden corticale astrocyten invitro en in vivo karakterisering. OPMERKING: Bepaal de aanwezigheid van mutaties na Cre recombinatie door PCR met primers specifiek voor het gerecombineerde gen of door immunoblots van ofwel de specifieke gemuteerde eiwit of signaaltransductiewegen gevolgen. De tijd die voor fenotypische stabiliteit van corticale astrocyten na Cre recombinatie is afhankelijk van de gebruikte mutaties en moet empirisch worden bepaald (figuur 2).

2 kweken Neurale stamcellen uit Neonatale Muizen

  1. Voorbereiding
    1. Voordat u begint met de dissectie, bereiden 4 ml spijsvertering oplossing per hersenen door het toevoegen van 3,1 mg papaïne en 1,3 mg cysteïne tot 4 ml dissociatie medium - 98 mM Na 2 SO 4, 30 mM K 2 SO 4, 5,8 mM MgCl2, 0,25 mM CaCl2 , 1 mM HEPES (uit 1 M HEPES pH 7,4 voorraad) 20 mM glucose, 0,001% fenol rood en 0,125 mM NaOH. Toevoeging van papaïneen cysteïne aan het medium dissociatie de oplossing geel worden.
    2. Incubeer bij 37 ° C waterbad gedurende 15 minuten. Meng periodiek door inversie.
    3. Voeg 0,1 M NaOH druppelsgewijs tot spijsvertering oplossing terug naar de rode kleur oplichten.
    4. In een weefselkweek kap, steriel filter de spijsvertering oplossing met behulp van een injectiespuit filter (0,22 pm poriegrootte). Houd de spijsvertering oplossing op ijs.
    5. Bereid 50 ml van Stem Cell Medium (SCM) door mengen van 44,5 ml NSC basismedium, 5 ml NSC supplement, 0,5 ml penicilline-streptomycine, 50 gl 0,2% heparine, 10 pi 100 pg / ml EGF en 10 pi 100 pg / ml bFGF. SCM is stabiel gedurende 1 week indien bewaard bij 4 ° C.
    6. Bereid volledige HBSS (cHBSS) door mengen van 50 ml van 10x HBSS, 1,25 ml 1 M HEPES (pH 7.4), 15 ml 1 M D-glucose, 5 ml 100 mM CaCl2, 5 ml 100 mM MgSO4 en 2 ml 1 M NaHCO3. Breng het totale volume tot 500 ml met DDH 2 O.
    7. Filter steriliseren cHBSS witha 0,2 um poriegrootte filter en bewaar bij 4 ° C.
    8. Verkreukelen 2-3 moeilijke taak weefsels en plaats in de bodem van een kolf met 70% ethanol. Plaats ontleden schaar, gebogen tang, en 2 paar straight micro tang in deze kolf. De weefsels worden gebruikt vermijden buigen van de micro tang. OPMERKING: Voor 5 muizen, stappen 2.1.1-2.1.8 duurt ~ 45 minuten.
  2. Tissue Oogst
    1. Sacrifice neonatale (dag 1-3) muizen per institutionele regelgeving.
    2. Verwijder ontleden schaar uit de 70% ethanol, laat ze afdruipen, en maak een sagittale snede in de huid over de schedel van het ruggenmerg naar de neus.
    3. Maak een snede in de schedel langs de pijlnaad, uitgaande van het ruggenmerg en tot voorbij de olfactorische bollen. Zorg ervoor dat de schaar tips zo dicht mogelijk het binnenoppervlak van de schedel om hersenweefsel te minimaliseren.
    4. Met behulp van gebogen pincet voorzichtig pellen elk halfrond van de schedel zijdelings weg van dehersenen.
    5. Verwijder voorzichtig het hele brein en plaats in ijskoud cHBSS.
    6. Met behulp van een dissectie microscoop, zorgvuldig hersenvliezen verwijderen uit de hersenen met fijne dissectie-instrumenten.
    7. Plaats de hersenen op zijn onderkant en verwijder cerebellum / achterhersenen en het reukorgaan / frontale cortex met verticale (coronale) snijdt met een maat 11 scalpel.
    8. Draai de resterende hersenen 90 ° voor het in het caudale gedeelte, waardoor het genereren van een coronale weergave van de hersenen. Zoek de laterale ventrikels.
    9. Knip een kubusvormig gedeelte met daarin de subventriculaire zone (SVZ).
    10. Transfer SVZ-bevattende weefsel een 60 mm weefselkweekplaat met verse ijskoude cHBSS en gehakt weefsel met maat 11 scalpel.
    11. Breng het gehakt weefsel in een steriele 15 ml buis. Plaats de buis op ijs.
    12. Was de petrischaal met 1-2 ml ijskoud cHBSS. Breng de wasoplossing aan de buis bevattende weefsel.
    13. Herhaal de stappen 2.2.1-2.2.12 met extra neonatal muizen indien nodig. Breng de 15 ml buizen tot een weefselkweek kap voor de rest van het protocol. OPMERKING: Voor 5 muizen, de stappen 2.2.1 - 2.2.13 duurt ~ 45 minuten.
  3. Tissue Homogenisering
    1. Plaats de digestie-oplossing (bereid in stap 2.1.1) in een 37 ° C waterbad gedurende 5 minuten. Ook warm 2 ml SCM per hersenen in een 37 ° C waterbad.
    2. Verwijder voorzichtig de bovenstaande vloeistof van het gehakt weefsel met een pipet 1 ml. Niet aspireren.
    3. Voeg 2 ml 37 ° C vertering oplossing per tube van 15 ml en meng voorzichtig door inversie.
    4. Incubeer bij 37 ° C waterbad gedurende 15 minuten. Meng door omkeren om de 5 minuten.
    5. Voeg nog eens 2 ml van 37 ° C verteringsoplossing aan elke buis en herhaal stap 2.3.4.
    6. Laat de cellen naar de bodem van de buis door de zwaartekracht, de bovenstaande vloeistof van gedigesteerde weefsel met behulp van een pipet 1 ml.
    7. Voeg 2 ml van 10 uM E-64 verdund in cHBSS en meng voorzichtig door inversie.
    8. Incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
    9. Laat de cellen om zich te vestigen op de bodem van de buis door de zwaartekracht, schenk de bovenstaande vloeistof uit verteerd weefsel.
    10. Voeg 1 ml van 37 ° C cHBSS en homogeniseren met een 1 ml pipet tip (~ 20 slagen). Vermijd het injecteren van luchtbellen tijdens weefsel homogenisering.
    11. Passeer de weefselhomogenaat door een 40 micrometer poriegrootte cel zeef en spoel de zeef met 5 ml van 37 ° C cHBSS.
    12. Centrifugeer het weefsel homogenaat bij 125 xg gedurende 5 minuten.
    13. Verwijder 95% supernatant met een pipet 1 ml zonder de celpellet. Voorzichtig hersuspenderen celpellet in 200 ui 37 ° C SCM met 200 ul pipetpunt.
    14. Voeg 1,8 ml 37 ° C SCM en breng de celsuspensie op een putje van een steriele 6 wells plaat. OPMERKING: Voor 5 muizen, stappen 2.3.1-2.3.14 duurt ~ 75 minuten.
  4. Neurale Stem Cell Culture
    1. Vullen het medium na 3 dagen door het toevoegen van nog eens 2 ml 37 °C SCM.
    2. Na 7 dagen, de overdracht van de neurosferen om een ​​15 ml buis en laat de neurosferen regelen door de zwaartekracht voor> 5 min.
    3. Verwijder het supernatant en voeg 2 ml 37 ° C SCM.
    4. Breng de neurospheres in nieuw putje van een 6-wells plaat.
    5. Voeg 2 ml van 37 ° C SCM om de 3-4 dagen, en verander medium volledig om de 7 dagen.
    6. Als neurospheres> 100 micrometer in doorsnede, zorgvuldig distantiëren met stamcellen dissociatie oplossing en replate de NSC op de gewenste cel dichtheid.
  5. Inductie van genetische recombinatie
    1. Voeg 1 ml van 37 ° C SCM met 1 gl> 10 10 pfu / ml Ad5CMVCre of Ad5GFAPCre de 2 ml van SCM momenteel op de cellen. LET OP: Gebruik BSL2 voorzorgsmaatregelen bij de omgang met recombinant adenovirus.
    2. Incubeer gedurende 6 uur bij 32 ° C in 5% CO2.
    3. Transfer SCM met neurosferen in een 15 ml buis en laat bollen te regelen door de zwaartekracht voor 5 min.
    4. Verwijder het supernatant eerst met een pipet 1 ml, vervolgens met 200 ul pipet. LET OP: Gebruik BSL2 veiligheidsmaatregelen bij het hanteren van recombinante adenovirussen en de virus-bevattende media per institutionele voorschriften weggooien.
    5. Voeg 2 ml van 37 ° C SCM zonder virus aan de NSC, vervolgens over te dragen aan een 6 wells plaat. OPMERKING: Voor 5 NSC culturen, stappen 2.5.1-2.5.5 duurt ~ 15 minuten exclusief de 6 uur incubatie.
    6. De volgende dag, herhaalt u de stappen 2.5.1-2.5.5, gevolgd door neurosphere passage wanneer dat nodig is. De bollen kunnen nu worden uitgebreid naar 2-3 passages voor in vitro karakterisering en orthotopische injectie in hersenen van muizen in vivo. OPMERKING: Bepaal de aanwezigheid van mutaties na Cre recombinatie door PCR met primers specifiek voor het gerecombineerde gen of door immunoblots van ofwel de specifieke gemuteerde eiwit of signaaltransductiewegen gevolgen. De tijd die voor fenotypische stabiliteit van NSC kweken na Cre recombinatie zal afhankelijk zijnde mutaties benut en moet empirisch worden bepaald (figuren 2 en 3).

3 Orthotope Injectie van Gerecombineerde Cellen in de hersenen van de ontvanger Iimmunocompetent Muizen

  1. Bereiding van 5% Methyl Cellulose
    1. Los 5 g 15 cPs methylcellulose in gedeïoniseerd water tot een eindvolume van 50 ml in 100 ml schroefdop fles. Voeg het poeder langzaam onder roeren bij 4 ° C om klonteren te voorkomen. Het kan tot 24 uur roeren bij 4 ° C voor alle methyl cellulose oplossing voeren.
    2. Weeg het flesje en registreer het gewicht.
    3. Autoclaaf de 5% methylcellulose-oplossing. Eenmaal geautoclaveerd, wordt de methylcellulose een halfvaste gel geworden.
    4. Weeg de fles en het berekenen van het gewicht verloren tijdens autoclaveren.
    5. Voeg aseptisch 1 ml steriel water voor elke gram afgevallen.
    6. Plaats op ijs en voeg 50 ml ijskoud 2x DMEM.
    7. Meng gedurende de nacht met een magnetische roerder bij 4 ° C. Met steriele techniek om de 5% methylcellulose-oplossing verdelen in 20 ml porties. WINKEL aliquots bij 4 ° C gedurende maximaal zes maanden of tot de 2x DMEM verloopt. OPMERKING: Bereiding van 5% methylcellulose-oplossing in stappen 3.1.1-3.1.7 duurt ~ 2,5 dagen.
  2. Voorbereiding van corticale Astrocyten voor Injectie
    1. Harvest corticale astrocyten bij ~ 90% confluent.
    2. Om oogsten, aspireren compleet DMEM en wassen platen met een gelijk volume van 37 ° C HBSS.
    3. Voeg genoeg trypsine om de plaat te bedekken. Kantel en tik op de plaat tot cellen beginnen te los te maken.
    4. Inactiveren trypsine met een gelijk volume van 37 ° C voltooien DMEM.
    5. Breng cellen in een 50 ml conische buis en was de plaat met hetzelfde volume van 37 ° C volledig DMEM in 3.2.4.
    6. Transfer spoelmedia de buis met cellen. Centrifugeer bij 200 xg gedurende 3 minuten.
    7. Aspireren supernatant en resuspendeer cellen in 1 ml van 37 ° C voltooien DMEM.
    8. Tel de celsuspensie met behulp van een hemocytometer of een andere geschikte cel teller die het aantal cellen / ul bepalen.
    9. Breng het gewenste aantal cellen in nieuw 15 ml conische buis. Centrifugeer bij 200 xg gedurende 3 minuten.
    10. Resuspendeer cellen in 800 gl van 37 ° C voltooien DMEM. Bepaal het volume van de celpellet (totaal volume celsuspensie - 800 pi). OPMERKING: Het is essentieel om een ​​nauwkeurige cel concentratie voor injectie te bereiken. Derhalve dient het volume van de celpellet in deze stap worden bepaald om de omvang van 5% methylcellulose berekenen voegen in stap 3.2.12.
    11. Overdracht cellen om een ​​steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeer bij 200 xg gedurende 3 minuten.
    12. Zuig supernatant van de cel pellet en resuspendeer de corticale astrocyten in het geschikte volume ijskoude 5% methylcellulose (gewenste totale volume - volume vande celpellet) om het gewenste aantal cellen / pl te verkrijgen.
    13. Plaats cellen op ijs tot injectie.
    14. Plaats een 250 ul glazen spuit in een Herhaling Antigeen Dispenser plaats dan een stompe 18 G-naald op de injectiespuit.
    15. Trek de zuiger langzaam met de naald in de corticale astrocyten schorsing; er een luchtbel boven de cellen die moeten worden verwijderd, omdat luchtbellen comprimeren en verminderen de werkelijk geïnjecteerd in de hersenen volume.
    16. Houd de punt van de naald net boven de corticale astrocyten schorsing en duw de zuiger in snel. De luchtbel zal sneller zijn dan de celsuspensie bewegen en zal meestal worden uitgezet.
    17. Herhaal stap 3.2.16 totdat alle luchtbellen worden verwijderd uit de naald.
    18. Vul de spuit tot ongeveer ~ 200 ul, houd dan de naald omhoog en trek de zuiger terug totdat deze stopt. Kleine luchtbellen worden verwijderd door met de naald omhoog en snel de zuiger in ongeveer 50 ul dan langzaam terug te trekken op volle capaciteit.
    19. Houd de punt rechtop en herhaal stap 3.2.18 4-5x.
    20. Gooi de 18 gauge naald en plaats een 27 G naald op de injectiespuit.
    21. Druk op de knop op het antigeen dispenser tot vloeistof wordt verdreven van de naald. OPMERKING: Voor 1 astrocyten cellijn, stappen 3.2.1-3.2.21 duurt ~ 60 minuten.
  3. Voorbereiding van de NSC voor Injectie
    1. Wanneer neurospheres> 100 micrometer in diameter, over te brengen naar 15 ml buizen en laat de neurosferen regelen door de zwaartekracht voor> 5 min.
    2. Verwijder het supernatant en dissociëren de neurosferen met een zachte dissociatie reagens, zoals stamcellen dissociatie oplossing of Accutase volgens de instructies van de fabrikant of met 0,05% trypsine-EDTA zoals beschreven 42.
    3. Remmen de dissociatie reagentia volgens de instructies van de fabrikant zonder dat de NSC te serum. Centrifugeer bij 100 xg gedurende 5 minuten.
    4. Zuig supernatant, dan resuspendeer de cellen in 1 ml van 37 ° C cHBSS een enkele celsuspensie te genereren.
    5. Tel de cellen met een hemocytometer of een andere geschikte cel tegen het aantal cellen / pl bepalen.
    6. Breng het gewenste aantal NSC om een ​​nieuwe 15 ml conische buis. Centrifugeer bij 100 xg gedurende 5 minuten.
    7. Resuspendeer cellen in 800 gl van 37 ° C HBSS. Bepaal het volume van de celpellet (totaal volume celsuspensie - 800 pi). OPMERKING: Het is essentieel om een ​​nauwkeurige cel concentratie voor injectie te bereiken. Derhalve dient het volume van de celpellet in deze stap worden bepaald om de omvang van 5% methylcellulose berekenen voegen in stap 3.3.9.
    8. Breng de cellen naar een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeer bij 100 xg gedurende 5 minuten.
    9. Zuig het supernatant en de afwerking van de voorbereiding van de cellen voor orthotopische injectie als in 3.2.12-3.2.21. OPMERKING: Voor 1 NSC cellijn, stappen 3.3.1-3.3.9 zal nemen ~ 60 minuten.
  4. Voorbereiding van de muis voor Injectie
    1. Verdoven het ontvangende dier via een IP injectie van 250 mg / kg Avertin (2,2,2 tribroomethanol) of 100 mg / kg ketamine plus 10 mg / kg xylazine, per IACUC institutionele richtlijnen. OPMERKING: Gebruik gemaakt van dit document zijn muizen op 3-6 maanden oud als transplantaat gastheren. Muizen op verschillende leeftijden kan worden gebruikt om de micro-omgeving effect van ontwikkelings hersenen leeftijd op tumorvorming onderzocht.
    2. Scheer de hoofdhuid over de incisie site met tondeuse of schaar.
    3. Steriliseren van de chirurgische site met 3 afwisselende swabs van 70% ethanol en betadine.
    4. Toepassing oogzalf om de ogen om schade als gevolg van verlies van knipperreflex voorkomen.
    5. Beoordelen diepte van de anesthesie door pedaal intrekking (teen knijpen) reflex. OPMERKING: Voor 5 muizen, stappen 3.4.1-3.4.5 duurt ~ 15 minuten.
  5. Orthotopische Implantatie
    1. Zet het dier in de stereotaxisch frame.
    2. Make een incisie over de pijlnaad ongeveer 0,5 cm lang tussen de oren en ogen.
    3. Zoek de kruising van de coronale en sagittale hechtingen (Bregma), en het snijpunt van de lambdoïde en sagittale hechtingen (Lambda). Zorg ervoor dat Bregma en Lambda zijn in hetzelfde horizontale vlak.
    4. Bevestig de spuit met de celsuspensie en het herhalen van antigeen dispenser aan de stereotaxisch frame over het hoofd. Breng het uiteinde van de 27 G naald in contact Bregma. Dit is de oorsprong die wordt gebruikt voor het manipuleren van driedimensionale coördinaten.
    5. Zet de naald iets van de schedel oppervlak en bewegen 2 mm lateraal en 1 mm rostral van Bregma.
    6. Laat de naald voorzichtig door de schedel naar zijn bestemming 4 mm ventraal van Bregma. LET OP: We gebruik deze stereotactische coördinaten aan de basale ganglia richten. Verschillende stereotactische coördinaten worden gebruikt om de micro-omgeving effect van verschillende onderzoekenhersengebieden op het ontstaan ​​van tumoren.
    7. Injecteer 5 pi van de celsuspensie door het herhalende antigeen dispenser activeren tegelijk. Laat de naald op zijn plaats gedurende 2 minuten om de intracraniële druk in evenwicht.
    8. Trek de naald langzaam over een periode van 30 sec. Gebruik een wattenstaafje om druk uit te oefenen om het bloeden die zich kunnen voordoen.
    9. Benaderen de wondranden en sluit de incisie met behulp van weefsel lijm. Dien 20 gl Lidocaine subcutaan op de incisieplaats. OPMERKING: Voor 5 muizen, stappen 3.5.1-3.5.9 duurt ~ 50 minuten. De UNC IACUC keurde het postoperatief gebruik van slechts plaatselijke verdoving. Overleg met de lokale institutionele IACUC wordt aanbevolen met betrekking tot de eisen voor postoperatieve pijnstillende gebruik na deze procedure.
  6. Post-chirurgische zorg
    1. Plaats de dieren in een schone, warme kooi herstellen. De dieren mogen niet rechtstreeks in beddengoed worden geplaatst, als toevallige aspiratie kan optreden.
    2. Let op dedieren voor hervatting van normaal gedrag, zoals verzorging, eten en ontlasting. OPMERKING: Hervatting van normaal gedrag kan ~ 60 minuten duren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We ontwikkelden een nGEM modelsysteem met corticale astrocyten en NSC geoogst uit neonatale GEM herbergen floxed voorwaardelijke oncogene allelen die fenotypisch kan worden gekarakteriseerd in vitro en in vivo (figuur 1). Om de gevolgen van oncogene mutaties specifiek corticale astrocyten in vitro onderzoeken, is het essentieel om eerst te verrijken voor astrocyten. Corticale astrocyte oogsten een mengsel bevatten van microglia, astrocyten, oligodendrocyten, OPC en neuronen, m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De meest kritische stappen voor een goede oogst en cultuur van corticale astrocyten 1) waarborgen de cortex te snijden zonder het weefsel onder het corpus callosum, 2) de hersenvliezen verwijderd, 3) grondig dissociëren van de cellen en 4) te verrijken voor GFAP + astrocyten. Hoewel we gebruikt mechanische (schudden) en genetische (beperking van genetische recombinatie met een Ad5GFAPCre vector of het gebruik van een dominante transformerende transgen (TgGZT 121) onder GFAP promot...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRM is een Damon Runyon-Genentech Klinisch Onderzoeker. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies aan CRM van de Damon Runyon Cancer Research Foundation (CI-45-09), Department of Defense (W81XWH-09-2-0042), en University of North Carolina University Cancer Research Fund (UCRF). De auteurs willen Daniel Roth bedanken voor de hulp met muizenhouderij. De auteurs willen ook Hannah Chae, Carter McCormick, Demi Canoutas, Stephanie Gillette en Susannah Krom bedanken voor de hulp met weefselkweek en immunofluorescentie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)Invitrogen11995065DMEM kan ook worden gekocht bij andere leveranciers, waaronder GIBCOSigma en Cellgro
Fetal Bovine Serum, RegularCellgro35-010-CV
Penicillin-StreptomycinInvitrogen15140122
Sharp-Pointed Dissecting ScissorsFisher Scientific08-395
Cartilage Thumb Forceps, CurvedFisher Scientific1631
Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4Miltex17-301
Ethanol (200 proof)Decon Labs2710
Razor BladesVWR55411-050
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquidInvitrogen14175-095
TrypLE Express (1x), Phenol RedInvitrogen12605-010Ook andere trypsine-oplossingen zijn geschikt voor corticale astrocytenverzameling en -cultuur
Culture Dish, 60 x 15 mmThomas Scientific9380H77
15 ml TubesBD Biosciences352096
50 ml TubesBD Biosciences352070
Adenovirus stockGene Transfer Vector Core, U. IowaAd5CMVCreBewaar in 5 µl aliquots bij -80 °C. Gevaarlijk. Gebruik Bsl2 veiligheidsmaatregelen
Sodium sulfate (Na2SO4) Sigma-Aldrich238597
Potassium sulfate (K2SO4)Sigma-Aldrich221325
Magnesium chloride (MgCl2)Sigma-AldrichM8266
Calcium chloride (CaCl2)Sigma-Aldrich746495
HEPES potassium saltSigma-AldrichH0527
D-(+)- GlucoseSigma-AldrichG8270 
Phenol RedSigma-AldrichP3532
Sodium hydroxide (NaOH)Sigma-AldrichS5881
PapainWorthingtonLS003127
L-Cysteine-HClSigma-AldrichC1276
Syringe filter (0.22 µm pore size)MilliporeSLGP033NS
Neurocult proliferatiekit, muisStemcell Technologies5702Deze kit bevat het NeuroCult NSC-basismedium en NeuroCult NSC-supplement die nodig zijn voor NSC-cultuur
0.2% Heparine-oplossingStemcell Technologies7980
EGF InvitrogenPMG8041
bFGF InvitrogenPHG0261
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10x)Invitrogen14185-052
Magnesium sulfate (MgSO4)Sigma-AldrichM7506
Sodium bicarbonate (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761
E-64Sigma-AldrichE3132Maak 10 mM stock op in DMSO, bewaar bij -20 °C
6-well PlatesFisher Scientific07-200-83
Cell strainer (40 µm pore size)Corning352340
Stem cell dissociation solutionStemcell Technologies5707Gebruik alternatief zachte enzymoplossingen zoals Accutase
Methyl cellulose 15 cPSigma-AldrichM7027
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2xMilliporeSLM-202-BVoor het maken van 5% methylcellulose-oplossing
1.7 ml Snap Cap Microcentrifuge TubeCorning3620
Hamilton-spuit, 250 µl LT geen naaldFisher Scientific14-815-92
PB600-1 Antigen DispenserHamilton 83700
Disposable 18 G naaldenFisher ScientificNC9015638
27 ga 1/2" luer tip naaldFisher Scientific14-826-48
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)Sigma-AldrichT48402
BetadineFisher ScientificNC9386574
Puralube Opthalmic OintmentFisher ScientificNC9689910
Model 900 Stereotaxic frameKopf Instruments
VETBONDFisher ScientificNC9259532 Weefselkleefstof 
Lidocaine ShopMedVetRXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)PromegaG3580
Anti-Sox2MilliporeAB5603
Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)DakoZ0334 
IVIS KineticPerkinElmerVoor in vivo beeldvorming
D-Luciferine - K+ Salt Bioluminescent SubstraatPerkinElmer122796Voor in vivo bioluminescentiebeeldvorming
EdU Imaging KitInvitrogenC10340
MSCV Luciferase PGK-hygroAddgene18782

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dolecek, T. A., Propp, J. M., Stroup, N. E., Kruchko, C. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009. Neuro Oncol. 14, suppl 5 1-49 (2012).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal Of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  3. Giese, A., Bjerkvig, R., Berens, M. E., Westphal, M. Cost of migration: invasion of malignant gliomas and implications for treatment. J. Clin. Oncol. 21 (8), 1624-1636 (2003).
  4. Miller, C. R., Perry, A. Glioblastoma. Arch. Pathol. Lab. Med. 131 (3), 397-406 (2007).
  5. Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), Cancer Genome Atlas Research Network. 1061-1068 (2008).
  6. Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
  7. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  8. Phillips, H. S., et al. Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis. Cancer Cell. 9 (3), 157-173 (2006).
  9. Vitucci, M., Hayes, D. N., Miller, C. R. Gene expression profiling of gliomas: merging genomic and histopathological classification for personalised therapy. Br. J. Cancer. 104 (4), 545-553 (2011).
  10. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
  11. Schmid, R. S., Vitucci, M., Miller, C. R. Genetically engineered mouse models of diffuse gliomas. Brain Res. Bull. 88 (1), 72-79 (2012).
  12. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  13. Sonoda, Y., et al. Formation of intracranial tumors by genetically modified human astrocytes defines four pathways critical in the development of human anaplastic astrocytoma. Cancer Res. 61 (13), 4956-4960 (2001).
  14. Mao, X. G., et al. LIN28A facilitates the transformation of human neural stem cells and promotes glioblastoma tumorigenesis through a pro-invasive genetic program. Oncotarget. 4 (7), 1050-1064 (2013).
  15. Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat. Rev. Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
  16. Miller, C. R., Williams, C. R., Buchsbaum, D. J., Gillespie, G. Y. Intratumoral 5-fluorouracil produced by cytosine deaminase/5-fluorocytosine gene therapy is effective for experimental human glioblastomas. Cancer Res. 62 (3), 773-780 (2002).
  17. Becher, O. J., Holland, E. C. Genetically engineered models have advantages over xenografts for preclinical studies. Cancer Res. 66 (7), 3355-3358 (2006).
  18. Huse, J. T., Holland, E. C. Genetically engineered mouse models of brain cancer and the promise of preclinical testing. Brain Pathol. 19 (1), 132-143 (2009).
  19. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  20. Li, A., et al. Genomic changes and gene expression profiles reveal that established glioma cell lines are poorly representative of primary human gliomas. Mol. Cancer Res. 6 (1), 21-30 (2008).
  21. Vries, N. A., Beijnen, J. H., van Tellingen, O. High-grade glioma mouse models and their applicability for preclinical testing. Cancer Treat. Rev. 35 (8), 714-723 (2009).
  22. Clark, M. J., et al. U87MG decoded: the genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line. PLoS Genet. 6 (1), (2010).
  23. Carvalho, A. C., et al. Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo. Stem Cells. 28 (2), 181-190 (2010).
  24. Yost, S. E., et al. High-resolution mutational profiling suggests the genetic validity of glioblastoma patient-derived pre-clinical models. PLoS One. 8 (2), (2013).
  25. Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 7 (2), 164-176 (2005).
  26. Rich, J. N., Guo, C., McLendon, R. E., Bigner, D. D., Wang, X. F., Counter, C. M. A genetically tractable model of human glioma formation. Cancer Res. 61 (9), 3556-3560 (2001).
  27. Chow, L. M., et al. Cooperativity within and among Pten, p53, and Rb pathways induces high-grade astrocytoma in adult brain. Cancer Cell. 19 (3), 305-316 (2011).
  28. Song, Y., et al. Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).
  29. Werder, A., Seidler, B., Schmid, R. M., Schneider, G., Saur, D. Production of avian retroviruses and tissue-specific somatic retroviral gene transfer in vivo using the RCAS/TVA system. Nat. Protoc. 7 (6), 1167-1183 (2012).
  30. Vitucci, M., et al. Cooperativity between MAPK and PI3K signaling activation is required for glioblastoma pathogenesis. Neuro Oncol. 15 (10), 1317-1329 (2013).
  31. Yahanda, A. M., Bruner, J. M., Donehower, L. A., Morrison, R. S. Astrocytes derived from p53-deficient mice provide a multistep in vitro model for development of malignant gliomas. Mol. Cell. Biol. 15 (8), 4249-4259 (1995).
  32. McEllin, B., et al. PTEN loss compromises homologous recombination repair in astrocytes: implications for glioblastoma therapy with temozolomide or poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors. Cancer Res. 70 (13), 5457-5464 (2010).
  33. Kim, H. S., et al. Gliomagenesis arising from Pten- and Ink4a/Arf-deficient neural progenitor cells is mediated by the p53-Fbxw7/Cdc4 pathway, which controls c-Myc. Cancer Res. 72 (22), 6065-6075 (2012).
  34. Radke, J., Bortolussi, G., Pagenstecher, A. Akt and c-Myc induce stem-cell markers in mature primary p53(-)/(-) astrocytes and render these cells gliomagenic in the brain of immunocompetent mice. PLoS One. 8 (2), (2013).
  35. Marino, S., Vooijs, M., Der Gulden, H. van, Jonkers, J., Berns, A. Induction of medulloblastomas in p53-null mutant mice by somatic inactivation of Rb in the external granular layer cells of the cerebellum. Genes Dev. 14 (8), 994-1004 (2000).
  36. Zhu, Y., et al. Ablation of NF1 function in neurons induces abnormal development of cerebral cortex and reactive gliosis in the brain. Genes Dev. 15 (7), 859-876 (2001).
  37. Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
  38. Xiao, A., Wu, H., Pandolfi, P. P., Louis, D. N., Van Dyke, T. Astrocyte inactivation of the pRb pathway predisposes mice to malignant astrocytoma development that is accelerated by PTEN mutation. Cancer Cell. 1 (2), 157-168 (2002).
  39. Xiao, A., Yin, C., Yang, C., Di Cristofano, A., Pandolfi, P. P., Van Dyke, T. Somatic induction of Pten loss in a preclinical astrocytoma model reveals major roles in disease progression and avenues for target discovery and validation. Cancer Res. 65 (12), 5172-5180 (2005).
  40. Neill, K., Lyons, S. K., Gallagher, W. M., Curran, K. M., Byrne, A. T. Bioluminescent imaging: a critical tool in pre-clinical oncology research. J. Pathol. 220 (3), 317-327 (2010).
  41. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  42. Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. (47), (2011).
  43. Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J. Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
  44. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  45. Miller, C. R., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K. A genetically-defined, orthotopic allograft model system of glioblastoma: Pathological features and experimental therapeutics. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69 (5), 522(2011).
  46. Bash, R., et al. Concurrent temozolomide-external beam radiation therapy is effective for experimental glioblastomas in an orthotopic, genetically engineered syngeneic mouse allograft model system. Neuro Oncol. 11 (5), 638(2009).
  47. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J. Neurosci. Meth. 150 (1), 128-137 (2006).
  48. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
  49. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  50. Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).
  51. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu. Rev. Physiol. 75, 685-705 (2013).
  52. Sirko, S., et al. Reactive glia in the injured brain acquire stem cell properties in response to sonic hedgehog. Cell stem cell. 12 (4), 426-439 (2013).
  53. Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis. Nat. Rev. Neurosci. 12 (2), 88-104 (2011).
  54. Burrell, K., Agnihotri, S., Leung, M., Dacosta, R., Hill, R., Zadeh, G. A novel high-resolution in vivo imaging technique to study the dynamic response of intracranial structures to tumor growth and therapeutics. J. Vis Exp. e50363 (76), (2013).
  55. Sottoriva, A., et al. Intratumor heterogeneity in human glioblastoma reflects cancer evolutionary dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4009-4014 (2013).
  56. Snuderl, M., et al. Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma. Cancer Cell. 20 (6), 810-817 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Astrocytoommodelleringconditionele muizenadenovirale Creorthotoop allograftbioluminescentie imaginggenetische recombinatietumorigeniteitsassaytesten van medicijnrespons

Gerelateerde artikelen