Methodenartikel

Fluorescentie Imaging met One-nanometer nauwkeurigheid (FIONA)

17.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51774

⸱

26 september 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Center for the Physics of Living Cells, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Center for Biophysics and Computational Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Single fluoroforen kunnen worden gelokaliseerd met nanometer precisie met behulp van FIONA. Hier een overzicht van de FIONA techniek is gemeld, en hoe FIONA experimenten uit te voeren wordt beschreven.

Samenvatting

Fluorescentie beeldvorming met een-nanometer nauwkeurigheid (FIONA) is een eenvoudige, maar nuttige techniek voor het lokaliseren van enkele fluoroforen met nanometer precisie in het xy-vlak. Hier een overzicht van de FIONA techniek gemeld en voorbeelden van onderzoek dat is uitgevoerd met FIONA worden kort beschreven. Ten eerste, hoe het opzetten van de benodigde apparatuur voor FIONA experimenten, dat wil zeggen, een totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM), met informatie over het uitlijnen van de optica, wordt beschreven. Dan hoe een simpele FIONA experiment uitvoeren aan lokaliseren geïmmobiliseerd Cy3-coderende enkelvoudige moleculen met geschikte protocols, gevolgd door de toepassing van FIONA de 36 nm stapgrootte van een afgeknotte myosine Va motor voorzien van een quantum dot meten geïllustreerd. Tenslotte wordt recente poging om de toepassing van FIONA breiden dikke monsters gerapporteerd. Het blijkt dat met behulp van een water immersie objectief en quantum dots gedrenkt diep in sol-gels en konijnenogen cornea (>200 urn), lokalisatie nauwkeurigheid van 2-3 nm worden bereikt.

Inleiding

Rond 1882, Ernst Abbe vond dat de resolutie van een lichtmicroscoop zichtbaar is ~ λ / 2NA, of ~ 200 nm (waarbij λ is de golflengte en NA de numerieke lensopening) 1,2. Daarom geven object kleiner dan de afmeting lijkt als een buigingsbegrensde vlek in een optische microscoop. Het is echter mogelijk om te bepalen het midden van de spot, dat wil zeggen de locatie van het object, met een veel hogere precisie 3. Fluorescentie beeldvorming met een-nanometer nauwkeurigheid (FIONA) is een eenvoudige, maar nuttige techniek voor het lokaliseren van enkele fluoroforen met nanometer precisie in het xy-vlak 4. De nauwkeurigheid van de lokalisatie, σ μ (dwz, de standaardfout van het gemiddelde), afhankelijk van het totale aantal verzamelde fotonen, figure-introduction-1 , Waarbij N het aantal fotonen, s is de standaardafwijking van de fluorescerende spot, ade pixelgrootte van de beeldvormende detector, en b de standaarddeviatie van de achtergrond 3,4. Voor een fluorofoor uitzendt ~ 10.000 fotonen, kan FIONA ~ 1 nm precisie 4 bereiken.

FIONA kunnen worden gebruikt om de positie van een stationaire zender of een bewegend on (uitgaande beelden kunnen snel genoeg worden genomen) nauwkeurig te bepalen. FIONA kunnen achtereenvolgens worden toegepast op de frames van de film en dus volgen de beweging van de enkel molecuul 4-8. Foto-beschermende reagentia moeten worden gezorgd dat het monster geen photodegrade. Bovendien kan het fluorescerende voorwerp zelf van elke grootte, kleiner of groter dan de diffractie limietsystemen bijvoorbeeld kan bestaan ​​uit een organel (~ 1 pm) met veel fluorescerende eiwitten verspreid over de membraan. Met behulp van FIONA kan nog steeds leveren een zeer nauwkeurig (nanometer) gemiddelde van de gemiddelde midden-van-massa. De grote verbetering in lokalisatie precisie door Fiona laat oplossen nanometer-schaal bewegingen in de tijd. Dit heeft microscopie geduwd in de moleculaire lengte schaal 4-8.

Sinds de uitvinding, zijn varianten van FIONA ontwikkeld. Bijvoorbeeld, bright-field imaging met een-nanometer nauwkeurigheid (bFIONA) 9, een lichte variant van FIONA, afbeeldingen en lokaliseert dichte objecten zoals melanosomen in vivo (donkere voorwerpen die het pigment melanine) met doorvallend licht. Daarnaast is FIONA toegepast om meerdere kleurstoffen lossen. Bijvoorbeeld, single-molecule hoge resolutie beeldvorming met fotobleken (garnalen) 10,11 of single-molecule hoge resolutie colocalization (SHREC) 12 ontwikkeld twee kleurstoffen opgelost binnen ongeveer 10 nm. (Merk op dat dit besluit, dat wil zeggen hoe nauwkeurig een identieke kleurstoffen uit elkaar kunnen houden.) Meer recent heeft FIONA analyse bijgedragen aan de lokalisatie proces van bepaalde super-resolutie microscopie zoals stochastische optische reconstruction microscopie (STORM) 13-15 en foto-geactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) 16, waarin tijdelijke donkere fluoroforen zijn enthousiast, en vervolgens de fluorescentie is gelokaliseerd. Door herhaaldelijk opwindende relatief lage dichtheid van kleurstoffen (minder dan een per diffractie beperkte spot), en vervolgens het verzamelen van de fluorescentie, onderzoekt al hun door FIONA, kan men opbouwen van een hoge resolutie map. De resolutie wordt dan alleen beperkt door het aantal fotonen per kleurstof steekt, evenals zaken als het bijhouden van de steekproef stationaire (waaronder bijvoorbeeld de microscoop podium) tijdens de overname.

In dit artikel een samenvatting van de FIONA techniek en een korte beschrijving van voorbeelden van onderzoek dat is uitgevoerd met behulp van FIONA wordt gemeld. Ten eerste, hoe het opzetten van de benodigde apparatuur voor FIONA experimenten, dat wil zeggen, een totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM), met informatie over het uitlijnen van de optica, wordt beschreven. Maar ook hoe uhet uitvoeren van een eenvoudige FIONA experiment op het lokaliseren van geïmmobiliseerd Cy3- DNA enkele moleculen met behulp van de juiste protocollen, wordt geïllustreerd. Daarna gebruik van FIONA de 36 nm stapgrootte van een afgeknotte myosine Va motor voorzien van een quantum dot meten gepresenteerd. Myosine Va is een essentieel processief motor eiwit dat cellulaire lading vervoert terwijl translocerende langs actine filamenten. Hier een myosine Va construct afgeknot wordt gebruikt domeinen irrelevant voor de stapgrootte te verwijderen, en met een FLAG tag toegevoegd aan het C-uiteinde tot eenvoudige labeling met quantum dots gefunctionaliseerd met anti-FLAG-antilichamen mogelijk. Dit experiment gebeurt onder lage ATP te vertragen myosine en maken het gebruik van lange belichtingstijden genoeg om een ​​goede foton telling te krijgen in elk frame. Elke voldoende fel fluorescerend label kan worden vervangen in het volgende protocol. Ten slotte is de laatste poging van de uitbreiding van de toepassing van FIONA dikke monsters gemeld. Als principe proof-of-werden quantum dots geweektin sol-gel en konijn ogen hoornvliezen en vervolgens gescand en gelokaliseerd met behulp van FIONA. Voor beeldvorming, een 60X water immersie objectief met NA = 1.2 werd gebruikt, omdat deze doelstelling heeft een langere afstand dan voorheen 100x olie-immersie objectief. Om het verlies in de vergroting te compenseren in de doelstelling, een extra vergroting lens (3,3 maal of 4.0X) werd ingebracht in de emissie-pad. Bovendien epi-fluorescentie (niet TIR) microscopie moet worden gebruikt om diepe gebieden in de dikke monsters. Er wordt aangetoond dat quantum dots gedrenkt diep in sol-gels en in konijnenogen cornea (Z> 200 um) kan worden gelokaliseerd met 2-3 nm nauwkeurig.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Ethiek Verklaring: Het hoornvlies weefsel van konijnen werd verzameld in overeenstemming met de Universiteit van Illinois Institutional Animal Care en gebruik richtlijnen.

1 TIRFM Setup

OPMERKING: Draag laser-veiligheidsbril hele tijd.

  1. Zorg ervoor dat alle noodzakelijke in de lijst van materialen vermeld optische componenten zijn beschikbaar en klaar voor uitlijning. Indien nodig, gebruik maken van vervangers met vergelijkbare functies bij andere bedrijven. Zorg ervoor dat Spiegels en lenzen anti-reflecterende (AR) coating die overeenkomen met de laser in gebruik moeten hebben.
  2. Stel de hoogte van alle optische componenten op de hoogte van de as van de microscoop achterhaven.
  3. Monteer de laser, laser-shutter en ND-filter (s). Gebruik ND filters om het laservermogen dempen vaststelling zo laag mogelijk terwijl de bundel zichtbaar. Haal de bouten met de juiste inbussleutels.
  4. Plan een balk weg en markeer deze met tape of markering op de optische tafel (dotted blauwe lijnen in figuur 1). Eenvoudigheidshalve rechtdoor paden langs lijnen van gaten op de optische tafel.
  5. Plaats spiegel M1 (figuur 1) en het eerste rechte hoek bocht. Plaats de twee irissen langs de tweede rechte gedeelte van de geplande stralengang. Stel zowel de positie en de kanteling van M1 zodanig dat de laser gaat door de irissen.
  6. Plaats mirror M2 (figuur 1) en het tweede rechte hoek bocht. Plaats de 10X bundelexpander (L1 en L2, figuur 1) langs de derde rechte deel van het pad. Stel het kantelen zodat de bundelexpander parallel aan zowel de optische tafel en geplande stralengang.
    1. Pas M1 en M2 iteratief zodat de laser gaat regelrecht door de middelpunten van beide lenzen van de bundelverbreder. Herhaal deze stap tot de straal profiel van de uitgebreide bundel is niet geknipt Gauss.
  7. Pas M1 om de bundel op L1 te centreren (Fifiguur 1) en M2 de straal op L2 (Figuur 1) iteratief centreren. Een slechte liggerprofiel betekent meestal dat de laser wordt geknipt; gebruik maken van een stuk wit papier om de bundel te blokkeren nadat de bundel expander om de bundel profiel controleren met de ogen. Voor hoge precisie analyse, gebruik maken van een optische bundel profiler.
  8. Pas de afstand tussen L1 en L2, zodat de bundel gecollimeerd. Herhaal stap 1.8 en 1.9 indien nodig.
    OPMERKING: Wanneer de bundel grootte verandert niet met de afstand, de straal gecollimeerd genoeg voor een TIRFM setup. Ter verbetering van de balk collimatie, kunnen instrumenten zoals een afschuifinterferometer gebruikt. Een typische bundelbreedte na expansie ~ 20 mm.
  9. Shutter de laser. Schroef de microscoop objectief en schroef in een tl-uitlijning doel. Place spiegels M3 en M4 (figuur 1) de geëxpandeerde bundel direct in de microscoop haven en op de dichroïsche spiegel in de toren. Zorg ervoor dat de laserstraal weerkaatst thij Dichroic en naar het plafond.
  10. Stel M3 het helderste gedeelte van de bundel centreren op de fluorescerende doel en M4 de bundelkanteling passen verticaal worden.
  11. Shutter de laser en schroef het doel weer in. Als de aanpassing in de vorige stap is het goed gedaan moet er een symmetrische plek het doel verlaten zijn. Fine-tunen van de kantelingen van de M3 en M4 naar het laservermogen en balk profiel optimaliseren van de doelstelling.
  12. Monteer een EMCCD camera aan de microscoop en sluit de camera aan op een computer. Start de software voor de camera.
  13. Monteer een fluorescerende steekproef (oplossing van fluoroforen) op de microscoop. Kijk naar het felle fluorescerende vlek op de camera. Controleer dat de spot niet verschuift op het scherm als de focus is veranderd.
  14. Plaats de TIR lens (L3, figuur 1) op het XYZ translatietrap op afstand van de achterkant brandvlak van het doel gelijk aan de brandpuntsafstand van L3 (~ 30 cm) is. Pas de positie van L3zodat de laser gaat door het midden van de lens.
  15. Vertaling L3 langs de stralengang aan de balk collimatie passen. Zorg ervoor dat de bundel nog steeds is gericht op de monitor en symmetrisch van vorm.
    OPMERKING: De verlichting gebied aan de steekproef vliegtuig toeneemt bij afnemende TIR brandpuntsafstand van het objectief. In het algemeen gebruik maken van de kleinste brandpuntsafstand die zou kunnen passen aan de set-up.
  16. Vertaling L3 loodrecht op de bundel pad naar de bundelkanteling uit het doel. Houd het vertalen van de TIR lens zodanig dat TIR wordt bereikt. Observeer een steekproef van fluorescerende kraaltjes door de EMCCD camera, en fine-tunen van L3 naar goede SNR krijgen.

figure-protocol-1
Figuur 1 optische configuratie voor totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM).

2 FIONA on Cy3-DNA

  1. Clean objectglaasjes en dekglaasjes: spoel objectglaasjes en dekglaasjes met DDH 2 O en isopropanol en droog ze af met stikstofgas; plaats de dia's en dekglaasjes in het plasma reiniger voor 5 min onder argon plasma.
  2. Construct monsterkamers (zoals geschetst in figuur 2).
    1. Leg een tissue op de bank en zet dan een stuk van de lens papier bovenop het weefsel. Plaats de dia op de lens papier. Zorg ervoor dat de schone kant van de glijbaan is naar boven.
    2. Breng twee stroken dubbelzijdig tape op de slede langs de lange randen, waardoor een spleet van 3-5 mm in het midden. Plaats de gereinigde dekglaasje bovenop de dia. Zorg ervoor dat de schone kant van het dekglaasje wordt geconfronteerd met de glijbaan.
    3. Gebruik een pipet tip om druk naar beneden over de dubbelzijdige tape. Gebruik een scheermesje om het overtollige tape van de dia te verwijderen, zodat de tape blijft alleen onder het dekglaasje.
      OPMERKING: De open einden van de kamer worden opengelaten en dienen als inlaat en uitlaten. Het volume van de kamer is enkele microliter.

figure-protocol-2
Figuur 2 Schets van een typisch monster kamer (a) Bovenaanzicht.; (B) Zij aanzicht van rechts; (C) Zij aanzicht vanaf de voorkant.

  1. Immobiliseer Cy3-DNA op binnenoppervlakken van de monsterkamers.
    1. Bereid T-50 buffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM NaCl). Bereid BSA-biotine in T-50 met een eindconcentratie van 1 mg / ml. Bereid T50-BSA buffer door oplossen BSA in T-50 met een eindconcentratie van 10 mg / ml.
    2. Bereid 0,5 mg / ml neutravidine in T50-BSA buffer. Bereid gebiotinyleerd Cy3 gemerkte DNA (Cy3-DNA) in T50-BSA bij een uiteindelijke concentratie van 5-10 pM.
    3. Pipetteer 10 ul BSA-biotine (1 mg / ml) in de monsterkamer. Wacht 5 minuten.
    4. Was de kamer met 40 pi T50-BSA. Pipetteer 10 ul neutravidine (0,5 mg / ml) in de monsterkamer. Incubeer gedurende 5 minuten.
    5. Was de kamer met 40 pi T50-BSA. Pipet 20 ul Cy3-DNA in het monster kamer. Incubeer gedurende 5 minuten en spoel daarna de kamer met 80 ul T50-BSA.
  2. Afbeelding Cy3- DNA enkelvoudige moleculen onder TIRFM.
    1. Bereid imaging buffer (100 pl) door mengen van 1 pl protocatechuaat 3,4-dioxygenase (PCD, 5 uM), 4 ui protocatechuidezuur zuur (PCA, 62,5 mM), 50 pl 6-hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carbonzuur (Trolox, 2 mM in T-50) en 45 gl T50-BSA.
    2. Pipet in 30 ul beeldvorming buffer en wacht 8-10 minuten.
    3. Monteer de steekproef voor de beeldvorming op een TIRFM dat is uitgerust met een groene laser (532 nm), een 100x olie-immersie objectief (1.45 NA), en een EMCCD camera.
    4. Stel de belichtingstijd om 100 tot 500 msec en EM winst tot 25 tot 100 Acquire een filmpje van het monster voor 1,000 frames.
  3. Voeren FIONA data-analyse op de opgenomen beelden van Cy3-DNA.
    1. De effectieve pixelgrootte (dwz conversiefactor van pixels tot nanometer) door deling van het fysieke pixelgrootte (gelezen specificatie vel van de EMCCD camera) van de totale vergroting (de vergroting van het microscoopobjectief vermenigvuldigd met extra vergroting).
    2. Bepaal de omrekenfactor van pixel intensiteiten nummers foton door CCD-gevoeligheid (dwz elektronen per A / D tellen, lezen uit de technische fiche van de CCD-camera) van het elektron multiplier (EM) winst gebruikt tijdens beeldopname te delen.
    3. Compileren en uitvoeren FIONA.pro voor FIONA analyse. Gebruik dit IDL programma om de verworven beeld te importeren, het invoeren van de effectieve pixelgrootte (uit stap 2.5.1) en de omrekenfactor van intensiteit naar foton nummer (van stap 2.5.2), en plekken voor FIONA analyse kiezen.
      OPMERKING: Op het einde, het program zal de output van de fitting resultaten met 2D Gaussische functies, evenals de totale foton nummers en lokalisatie precisie. Een typisch resultaat is weergegeven in de sectie van de vertegenwoordiger van de resultaten en de figuren 4c-4d.
    4. Compileren en uitvoeren phcount.pro om foton tellen karakteriseren. Gebruik dit IDL programma om het gemiddelde aantal fotonen uitgezonden door een fluorofoor voor fotobleken meten de verkregen afbeelding en het invoeren van de omzettingsfactor importeren intensiteit foton nummer (uit stap 2.5.2).
      Opmerking: Het programma wordt automatisch gevonden fluorescerende spots automatisch (handmatige selectie is een optie) berekenen fotontellingen als functie van framenummer, en output de sporen van fotontellingen.
      1. Gooi slechte sporen en geef kader ranges na photobleaching voor baseline correctie. Op het einde, zal het programma een lijst produceren van in totaal foton nummers voor alle plekken niet weggegooid. Plot dan de verdeling van de foton-nummers en passen de distributietie met een exponentiële verval naar de gemiddelde foton nummer te verkrijgen. Een typisch resultaat is weergegeven in de sectie van de representatieve resultaten en cijfers 4e-4f.

3 FIONA Toegepast op Motor (bijvoorbeeld Myosin op actine) Dynamics Kwantificeren op nanometerschaal

  1. Polymeriseren actine (dwz bereiden F-actine) een dag voor FIONA experiment.
    1. Reconstitueren G-actine (monomeer) en biotine G-actine (monomeer) tot 10 mg / algemene actine ml buffer. Roer om ervoor te zorgen dat beide volledig zijn opgelost, en houdt zowel op ijs.
    2. Meng 10 ul G-actine (monomeer) met 1,7 ul biotine G-actine in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Voeg 100 ul ijskoude actine polymerisatie buffer.
    3. Laat het mengsel overnacht bij 4 ° C (F-actine gevormd) en voeg DDH 2 O tot een totaal volume van 1 ml.
    4. Bewaar de actine filamenten (F-actine) bij 4 ° C voor later gebruik in proeven.
      OPMERKING: Filamenten desintegreren en verkort de tijd, maar kan gebruikt worden voor ten minste twee weken.
  2. Bereid monster voor beeldvorming.
    1. Maak een monster kamer (zoals beschreven in het protocol 2.1 en 2.2). Pipetteer 20 ul gebiotinyleerd BSA 1 mg / ml in DDH 2 O. Incubeer gedurende 10 minuten. Spoelen met 30 ul DDH 2 O.
      OPMERKING: Dit blokkeert het glasoppervlak en stelt biotine voor het binden van de actine-filamenten. Gebiotinyleerde poly-L-lysine - polyethyleenglycol (PLL-PEG) kan dezelfde functie hebben.
    2. Pipet in 0,5 mg / ml neutravidine. Incubeer gedurende 2 minuten en spoel daarna de kamer met 30 ul M5 buffer.
    3. Pipetteer de gevulde F-actine 25 keer verdund algemeen actine buffer tot een eindconcentratie ~ 0.004 mg / ml. Wacht 10 minuten, spoel de kamer met 30 ul buffer.
    4. Verdun myosine Va met FLAG-tags 30-voudig in M5 buffer (20 mM HEPES (pH 7,6), 2 mM MgCl2, 25 mM KCl, 1 mM EGTA) tot een eindconcentratie of 250 nM. Meng 1 ui myosine met 1 pl Anti-FLAG-Qdot705 (~ 1 uM, geconjugeerd van anti-FLAG antilichamen en Qdot705 behulp van de Qdot705 Antibody Vervoeging Kit volgens de handleiding van de fabrikant). Voeg in 8 ul M5 te vullen tot 10 pl. Pipet op en neer om goed te mengen. Incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
      Opmerking: Dit levert een mengsel van 1 motor 4 quantum dots, bij ~ 25 nM myosine concentratie.
  3. Beeldvorming van de myosine lopen op actine.
    1. Bereid imaging buffer (100 pl) door mengen 84 ul M5-BSA (M5 buffer met 1 mg / ml BSA), 1 ui ATP (50 pM in DDH 2 O), 2 pi DTT (500 mM in DDH 2 O), 1 CK gl (500 U / ml), 5 ui CP (200 mM), 1 ui PCD, 4 ui PCA, 1 ui myosine-Qdot na verdunning andere 10-voudig tot 2,5 nM myosine concentratie en 1 pl BME.
    2. Pipet in 20 ul beeldvorming buffer naar kamer proeven en incubeer gedurende 8-10 minuten.
    3. Beeld van het monster op TIRF microscoop bij 30 msec blootstelling. Verwerven van minstens 1.000 frames. Pas het volume van myosine-Qdot in stap 3.3.1 indien nodig.
  4. Voeren data-analyse en vind de stap-grootte van myosine wandelen.
    1. Open het videobestand in ImageJ 17 en gewas de video rond een bewegende spot. Gewas een groot genoeg gebied dat ter plaatse wordt nooit binnen 20 pixels van de rand, en zorg ervoor dat er geen andere plekken in de video. Zorg ervoor dat deze plek beweegt zich in een lineair pad.
    2. Volg ter plaatse door de video te genereren x en y-coördinaten door de tijd, in pixels, door het toepassen van FIONA analyse (stap 2.5.3) om elk frame van de video.
    3. Zet pixels naar nanometer, zoals beschreven in de vorige paragraaf.
    4. Bereken verplaatsing van de eerste positie als functie van de tijd.
    5. Run t-test de verplaatsing naar de trap van myosine lopen verkrijgen.
      OPMERKING: Het programma voorzag t-test (step_t_test.zip) wordt gecodeerd in IDL en constaat uit 14 subroutines in de map.
      1. Open alle subroutines in IDL en compileren al twee keer. Dan start mtltyanalysis_ttest.pro en kies een tekstbestand met alleen de data op afstand in een enkele kolom. Een uitgang Excel file wordt gegenereerd, die de ruwe gegevens, de pasvorm en de stapgrootte.
    6. Verwijder alle nul-waarden uit de kolom stapgrootte. Zet de verdeling van de stap maten met behulp van Origin of MATLAB. Monteer een Gauss om het histogram.
      OPMERKING: Stap groottes van nul-waarden moeten worden verwijderd omdat een stap van nul betekent dat er geen stap uit het vorige frame. De fitting geeft een piek rond 36 nm (zie figuur 5).

4 Dikke Monstervoorbereiding voor FIONA

  1. Bereid quantum dots ingekapseld in sol-gel.
    1. Meng 4,5 ml TMOS, 1 ml DDH 2 O en 100 pl HCl (120 mM). Ultrasone trillingen het mengsel op ijs gedurende 30 minuten in het ultrasoon reiniger specified in de lijst van materialen (frequentie = 40 kHz, verwarming = uit). Meng de oplossing om de 10 minuten.
    2. Verdun 1,5 pi Qdot605 in 1,5 ml HEPES (50 mM pH 7,2). Meng oplossing 1,5 ml TMOS van de vorige stap.
    3. Giet het mengsel in een glazen onderste schaal. Dicht de glazen bodem schotel met Parafilm en bewaar bij 4 ° C voor 1 5 uur.
    4. Voeg 2 ml 1% BME in PBS om het monster schotel en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten voor beeldvorming.
  2. Bereid hoornvlies monster gekleurd met quantum dots.
    OPMERKING: Rabbit-ogen waren geschenken van Dr Marina Marjanovic.
    1. Scheid het hoornvlies van de ogen en snijd hem in 3 mm x 3 mm stukken.
    2. Verdun 1 pl Qdot 605-streptavidine in 1 ml PBS. Incubeer de cornea weefsel met 1 nM Qdots oplossing bij 4 ° C gedurende 1 uur. Was het weefsel met PBS.
    3. Neem een ​​schoon glasplaatje en een # 1.5 dekglaasje. Put 4 lagen dubbelzijdig tape op het glaasje langs de lange zijde eennd Met andere 4 lagen dubbelzijdig tape parallel aan de vorige band en een kanaal ongeveer 1 cm ertussen. Doe het materiaal uit de vorige stap in het midden van het kanaal, en bedek het met een dekglaasje.
    4. Druk zachtjes op de zijkanten van het dekglaasje om het plakken op de tapes. Bevochtig het kanaal met 50 ul PBS voor de beeldvorming.
  3. Afbeelding quantum dots in sol-gel en cornea.
    1. Voor FIONA beeldvorming in dikke monsters, gebruikt u een 60X water-immersie objectief met een werkafstand van 0,27 mm of een 60X water-immersie objectief met een werkafstand van 0,28 mm.
    2. Monteer het monster op de microscoop. Stel de TIRF lens zodanig dat de epi-fluorescentie stand bereikt (de laserstraal komt uit het doel met een hoek tegen de dekglaasje). Plaats een extra vergroting lens (3,3 maal of 4.0X).
    3. Verplaats het brandvlak van de doelstelling om een gewenste z positie (bijvoorbeeld> 200 pm). Record beelden van immobielequantum dots in het monster.
  4. Voeren FIONA analyse zoals beschreven in paragraaf 2.5 van dit protocol.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een typische doelstelling type TIRFM setup is getoond in figuur 3. Eerst werd het oppervlak geïmmobiliseerd Cy3-DNA sample afgebeeld. Een typisch beeld is weergegeven in figuur 4a. Het beeld werd genomen met een belichtingstijd van 0,5 sec, met EM gain = 50 en CCD gevoeligheid = 12.13 voor de camera. Het point-spread-functie (PSF) van een Cy3-DNA-molecuul wordt getoond in figuur 4b (van de plaats aangegeven door de pijl in figuur 4a), waarbij de kleur-t...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

FIONA is een techniek om de positie van een fluorescent emitter (organische fluorofoor of quantum dot) met nanometer nauwkeurigheid en tijdsresolutie tot 1 msec 4-8 lokaliseren. Wanneer voldoende fotonen worden verzameld, deze techniek maakt het mogelijk de positie van een fluorescent emitter veel nauwkeuriger dan de diffractielimiet (~ 200 nm) te bepalen en dus deze techniek opent een manier te observeren wat niet gezien conventionele / traditionele optische microscopie 4 - 8. Sinds de uitvinding ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door NIH Grants 068.625, NSF subsidies 1.063.188 en het centrum van de fysica van levende cellen 0822613. Speciale dank gaat uit naar Dr Marina Marjanovic in Beckman Institute for Advanced Science and Technology voor de gave van de ogen van konijnen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Double-sided tape3M~75 µm dik
EMCCD cameraAndor TechnologyDU-897E-CS0-#BV
Ultrasonic cleanerBranson2510
Fluorescence filter setChroma49016
Actin polymerization buffer Cytoskeleton BSA02
Biotin G-actinCytoskeleton AB07
G-actin Cytoskeleton AKL95
General actin buffer Cytoskeleton BSA01
Laser shutter (with driver)Electro-Optical Products Corp. SH-10-MP
IDLExelis Visual Information Solutions
Neutravidin Fisher ScientificPI-31000
CoverslipFisherbrand 22X30-1.50.16-0.19 mm dik
Microscope slideGold Seal Microslides 30103X10.93-1.05 mm dik
Plasma cleanerHarrick PlasmaPDC-001
Glass bottom dish In Vitro ScientificD35-20-1.5-N
Cy3-DNA oligosIntegrated DNA Technologies5'-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3'Bio
Fluorescent beads InvitrogenT-7280
Qdot 605-streptavidin InvitrogenQ10101MP
Qdot605 InvitrogenQ21301MP
Qdot705InvitrogenQ22021MP 
Qdot705 Antibody Conjugation KitInvitrogenQ22061MP
MATLABMathWorks
Optical tableNewport CorpRS4000 Series
60X ObjectiveNikonPlan Apo VC 60x WI
100X ObjectiveOlympusPlanApo 100X/1.45 Oil ∞/0.17
60X ObjectiveOlympusUPlanApo 60X/1.20W
Inverted microscopeOlympusIX71/IX70/IX81
OriginOriginLab
Anti-FLAG antibodySigma AldrichF7425-.2MG
ATPSigma AldrichA7699
BME Sigma Aldrich63689-25ML-F
BSASigma AldrichA7906
BSA-biotinSigma AldrichA8549-10MG
CKSigma AldrichC3755Creatine Phosphokinase from rabbit muscle
CPSigma AldrichP1937Phosphocreatine di(tris) salt
DTTSigma Aldrich43815DL-Dithiothreitol
EGTASigma AldrichE3889Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid
HCl Sigma Aldrich93363-500G
HEPES Sigma AldrichH0887
KClSigma AldrichP9333
MgCl2Sigma AldrichM1028
NaClSigma AldrichS7653
PCASigma Aldrich03930590Protocatechuic acid 
PCDSigma AldrichP8279Protocatechuate-3,4-dioxygenase 
TMOSSigma Aldrich341436-25GTetramethyl orthosilicate
Tris-HCl Sigma Aldrich93363
TroloxSigma Aldrich2388136-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid
1” diameter broadband dielectric mirrors with mountsThorlabs BB1-E02, KM100Aantal: 2
½” diameter postsThorlabs TR4Aantal ≥ 6
10X beam expanderThorlabs BE10M-A
2” diameter f = 300 mm lens with mountThorlabs LA1256-A, LMR2TIR lens
Fluorescent alignment target Thorlabs VRC2SM1
Laser safety gogglesThorlabs LG3
ND filter(s)Thorlabs FW1AND
Optical beam profilerThorlabs BP209-VIS
Post-mounted iris diaphragmThorlabs ID25Aantal: 2
Shearing interferometerThorlabs SI100
XYZ translation stage, ½” travel Thorlabs T12XYZ
LaserWorld Star Technologies TECGL-30532 nm, 30 mW
```

Referenties

  1. Abbe, E. The Relation of Aperture and Power in the Microscope. Journal of the Royal Microscopical Society. 2 (3), 300-309 (1882).
  2. Abbe, E. The Relation of Aperture and Power in the Microscope (continued). Journal of the Royal Microscopical Society. 2 (4), 460-473 (1882).
  3. Thompson, R. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  4. Yildiz, A., et al. Myosin V Walks Hand-Over-Hand: Single Fluorophore Imaging with 1.5-nm Localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
  5. Yildiz, A., Tomishige, M., Vale, R. D., Selvin, P. R. Kinesin Walks Hand-Over-Hand. Science. 303 (5658), 676-678 (2004).
  6. Yildiz, A., et al. Myosin VI Steps via a Hand-over-Hand Mechanism with Its Lever Arm Undergoing Fluctuations when Attached to Actin. Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37223-37226 (2004).
  7. Yildiz, A., Selvin, P. R. Fluorescence Imaging with One Nanometer Accuracy: Application to Molecular Motors. Accounts of Chemical Research. 38 (7), 574-582 (2005).
  8. Toprak, E., Yildiz, A., Hoffman, M. T., Rosenfeld, S. S., Selvin, P. R. Why kinesin is so processive. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (31), (2009).
  9. Kural, C., et al. Tracking melanosomes inside a cell to study molecular motors and their interaction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5378-5382 (2007).
  10. Gordon, M. P., Ha, T., Selvin, P. R. Single-molecule high-resolution imaging with photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6462-6465 (2004).
  11. Qu, X., Wu, D., Mets, L., Scherer, N. F. Nanometer-localized multiple single-molecule fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11298-11303 (2004).
  12. Churchman, L. S., Ökten, Z., Rock, R. S., Dawson, J. F., Spudich, J. A. Single molecule high-resolution colocalization of Cy3 and Cy5 attached to macromolecules measures intramolecular distances through time. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1419-1423 (2005).
  13. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  14. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Meth. 3 (10), 793-796 (2006).
  15. Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor Super-Resolution Imaging with Photo-Switchable Fluorescent Probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
  16. Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  17. Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics international. 11 (7), 36-42 (2004).
  18. Enderlein, J., Toprak, E., Selvin, P. R. Polarization effect on position accuracy of fluorophore localization. Optics Express. 14 (18), 8111-8120 (2006).
  19. Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles. Biophysical Journal. 81 (4), 2378-2388 (2001).
  20. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  21. Zhuang, X., et al. A Single-Molecule Study of RNA Catalysis and Folding. Science. 288 (5473), 2048-2051 (2000).
  22. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

FIONA techniektotale interne reflectiefluorescentiemicroscopielokalisatie van enkelvoudige moleculenquantum dot labelingmyosin Va motortracking van actinefilamentenCy3 DNA immobilisatieTIRF uitlijningnanometerprecisie

Gerelateerde artikelen