Isolatie, identificatie en zuivering van Muriene thymus epitheelcellen

Samenvatting

Hier beschrijven we een efficiënte methode voor isolatie, identificatie en zuivering van muizen thymus epitheelcellen (TEC). Het protocol kan worden gebruikt voor studies van thymus functie voor normale T-cel ontwikkeling, thymus en T cel reconstitutie.

Samenvatting

De thymus is een vitaal orgaan voor T-lymfocyten ontwikkeling. Van thymus stromale cellen, thymus epitheelcellen (TEC) zijn vooral belangrijk bij meerdere stadia van de T-cel ontwikkeling: T-cel betrokkenheid, positieve selectie en negatieve selectie. Toch blijft de functie van TEC in de thymus onvolledig begrepen. In het artikel geven we een methode om TEC subsets van verse muis thymus met behulp van een combinatie van mechanische verstoring en enzymatische afbraak te isoleren. De werkwijze maakt thymus stromale cellen en thymocyten efficiënt vrijkomen van cel-cel en cel-extracellulaire matrix verbindingen en een eencellige suspensie. De geïsoleerde cellen kunnen multiparameter flowcytometrie worden toegepast op de identificatie en karakterisering van TECs en dendritische cellen. Omdat TEC een zeldzame celpopulatie in de thymus, ook een effectieve manier te verrijken en zuiveren TEC door afbreken thymocyten, het meest voorkomende celtype in de thymus te beschrijven. Follovleugel verrijking, celsortering tijd worden verminderd zodat het verlies van cellevensvatbaarheid tijdens zuivering van TEC's worden geminimaliseerd. Gezuiverde cellen zijn geschikt voor verschillende stroomafwaartse analyses zoals Real Time-PCR, Western blot en genexpressie. Het protocol onderzoek TEC functie en evenals de ontwikkeling van in vitro T-cel reconstitutie promoten.

Inleiding

Vroeg in T-cel ontwikkeling, zijn beenmerg hematopoietische stamcellen afgeleide multipotente voorlopercellen aangeworven om de cortex van de thymus, ondergaan inzet voor T afstamming en word T cel precursoren ^1. In de cortex, T-cel voorloper CD4-en CD8 dubbele ontkenning (DN) thymocytes uitbreiden en differentiëren in onvolwassen CD4 en CD8 dubbel positieve (DP) thymocytes, de vorming van een grote pool van voorouders met zeer variabele T-cel-receptoren ^1. Slechts een select MHC-beperkte subset van DP cellen CD4 en CD8 enkele positieve (SP) thymocyten worden, migreren naar de medulla van de thymus en differentiëren tot functioneel bevoegde rijpe T-cellen, een gebeurtenis die wordt aangeduid als positieve selectie ^{2- 6.} In tegenstelling, klonen van auto-reactieve thymocytes ondergaan negatieve selectie en verwijderd via apoptose, omgerekend naar regulatoire T-cellen voor zelf-tolerantie, of omgeleid naar intra-epitheliale lymfocyten voor doeleinden die nog niet duidelijk ^3,7-10.

In de thymus, thymus stromale cellen vormen een unieke micro-omgeving verschaffen signalen voor deze verschillende T cel ontwikkeling lot ^5,11,12. Thymus stromale cellen zijn samengesteld uit de thymus epitheelcellen (TEC) - waaronder corticale TEC's (cTECs) en medullaire TEC (mTECs), dendritische cellen, macrofagen, fibroblasten, endotheelcellen, neurale-kuif afgeleid pericytes en andere mesenchymale cellen ^13-15. Onder deze, TEC's zijn cruciaal in de verschillende stadia van de T-cel ontwikkeling ^1,2,16,17. Echter, het ontbreken van een robuuste manier om TEC te isoleren een uitgebreide kennis van hun functies ¹⁶ belemmerd. Vooral cTECs, die een driedimensionaal netwerk rond voorlopers in de cortex vormen, zijn essentieel voor positieve selectie ^13,18,19 om redenen die nog niet duidelijk. Eerdere studies die aanwijzingen in verband met de heterogeniteit en de rol van de TEC, meestal een beroep op morfologische en histologische gereedschap ¹³ . Onlangs werden de unieke rol van de TEC subsets aangepakt door genetische benaderingen in muismodellen ^12,20. Een robuuste en reproduceerbare manier om TEC te isoleren is fundamenteel voor onpartijdige karakterisering van TEC subsets, kwantitatieve en kwalitatieve evaluatie van de TEC-functies, en verduidelijking van de mechanismen te realiseren hoe cTECs ondersteunen positieve selectie.

Vanwege de zeldzaamheid van TEC in de thymus en de strakke interacties vormen ze in de intacte orgaan is de isolatie van TEC uitdagend. De hier beschreven protocol gebaseerd op de eerdere ontdekkingen momenteel verkrijgbare middelen, technieken en kennis van structuur en thymus stromale samenstelling. Bijna twee decennia geleden, werden verschillende procedures gemeld aan thymus weefsels ^21-27, waarbij verschillende enzymen werden gebruikt tijdens de spijsvertering, waaronder trypsine, collagenase en Dispase disaggregeren. Gray et al. tegenover deze enzymen in hun precedure ²⁸ en meldde een verbeterde method met een multiple-stap spijsvertering enzym cocktails ²⁹ dat werd op grote schaal gebruikt ^20,30. Deze werkwijze is een lange voorbereidingstijd en complexe digestie stappen en resulteert in variabele uiteindelijke cel aantallen en percentages TEC zelfs in dezelfde muizen cohort ^29,30. Enkele jaren geleden, Liberase onderzoek leerjaar enzym, met daarin sterk gezuiverd Collagenase en neutraal protease begon te worden gebruikt in de thymus weefsel dissociatie ^30. We beschrijven hier een Liberase spijsvertering-gebaseerd protocol, met geoptimaliseerde mechanische scheiding procedures, dat een groot aantal levensvatbare TEC levert vanaf muis thymus weefsels. .

Om gedissocieerde stromale cellen te verrijken, hebben eerdere studies ofwel gradiënten dichtheid of magnetische kraal scheiding ^21,29 gebruikt. Beide methoden leiden tot ernstige verlies van bepaalde populaties van thymus stromale cellen, met name de populatie van cTECs ^29. Cytotoxische eliminatie en panning technieken ^{31,32 zijn op grote schaal gebruikt voor uitputting of scheiding van lymfocyten in het veld immunologische 12,31. Na vergelijking van deze technieken hebben we de huidige panning protocol voor verrijking van TEC. De zachte conditie tijdens de verrijking procedure leidt tot minder celdood en onpartijdige en verhoogde TEC herstel.}

De geïsoleerde thymus celsuspensie in punt 3 beschreven kunnen direct worden aangebracht op cytometrische analyse stroom voor identificatie en karakterisatie van TEC subsets en dendritische cellen. Hoofdstuk 4 beschrijft een eenvoudige en handige manier om TEC subsets met multiparameter doorstroomcytometer identificeren. Voor experimenten die streven naar gezuiverd cTECs of mTECs, TEC verrijking en celsortering procedures te verkrijgen zijn te vinden in hoofdstuk 5 en 6.

Protocol

In deze studie, volwassen - werden (6 8 weken) vrouwelijke C57BL / 6 muizen gebruikt. Muizen werden gekocht bij het National Cancer Institute en onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden gehouden. De Universiteit van Minnesota Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) keurden alle dierproeven.

1 Voorbereiding van instrumenten en Buffers

1. Bereid enzymoplossing (RPMI1640 medium met 0,05% [w / v] van Liberase TH en 100 U / ml DNase I), albumine-rijke buffer (1X PBS [Ca2 ⁺ / ^{Mg2 +} -vrij] met 0,5% runderserumalbumine albumine en 2 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur [EDTA]), FACS buffer (1X PBS [Ca2 ⁺ / ^{Mg2 +} -vrij] dat 1% foetaal runderserum [FBS] en 0,02% _NaN3), FACS sortering buffer (1X PBS [Ca2 ⁺ / ^{Mg2 +} -vrij] dat 2% FBS) en RP 10 medium (RPMI-1640 medium geleverd met 10% FBS).
2. Bereid 10 panning platen. Bereid 40 ml bekledingsoplossing (0,01 mg / ml Ghaver anti-rat IgG in 0,1 M _NaHCO3 Buffer), en voeg 4 ml coating oplossing in elk 100 x 15 mm plaat, swirl en incuberen bij 4 ° CO / N. Giet antilichaam oplossing en spoel de plaat met behulp van 5 ml 1x PBS voor 2 keer, zwenk krachtig tussen spoelingen. Bewaar de bereide platen bij 4 ° C.

2 Oogst van Thymus Tissue

1. Euthanaseren muis in een CO ₂ kamer. Leg het dier op zijn rug op een dissectie mat, speld de voeten op de mat en nat de vacht door te besproeien met 70% ethanol.
2. Voeg een middellijn incisie door de huid, vanaf boven de urethrale opening direct naar de onderkaak met een schaar en neerwaartse uitbreiding van de incisie op de knieën op beide zijden. De incisie ziet eruit als een omgekeerde "Y". Trek de losse huid terug op de zijkanten, en speld het aan de dissectie mat.
3. Prik het middenrif van de zwaardvormig, snij de ribben aan elke kant tot ongeveer het sleutelbeen, til de ribben metpincet en speld het aan de dissectie mat. De thymus is net onder de ribben, en ziet eruit als twee dunne witte lobben bovenop het hart (figuur 1). Koppel bindweefsel rondom de thymus, trek en verwijder het paar thymus lobben met gebogen gekartelde tang. Plaats thymus lobben in een plaat met 6 putjes met 5 ml RPMI-1640.

3 Bereiding van thymus stromacellen

1. Snijd elke omgeving vet en bindweefsel en breng de thymus lobben in nieuw putje van de plaat met 6 putjes met 5 ml verse enzymoplossing te bereiden. Voeg kleine incisies in de thymus lobben met fijne schaar, en incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 20 minuten.
2. Voorzichtig pipet verteren thymus weefsel op en neer 2 - 3 keer met 5 ml pipet voor weefsel dissociatie. Verzamel supernatant fractie in een 50 ml buis met 10 ml koud albumine-rijke buffer enzymen neutraliseren. Houd de collectie buis op ijs. Voeg 2,5ml enzymoplossing het restmateriaal en incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
3. Voeren zachte mechanisch roeren met een 3 ml spuit en 18 G-naald te breken aggregaten. Pool supernatant in de collectie buis. Voeg 2,5 ml enzymoplossing het restmateriaal en incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
4. Herhaal zacht mechanisch roeren met een 3 ml spuit en een 25 G naald, en incubeer de plaat extra 5 - 10 minuten.
5. Na volledige spijsvertering, bundelen de bovenstaande vloeistof in de collectie buis. Centrifugeer de verzamelbuis bij 400 xg, 4 ° C gedurende 8 minuten om de cellen te verzamelen. Zuig de vloeistof op te schorten en de pellet cellen in 10 ml albumine-rijke buffer en filteren het monster door 100 mm maaswijdte. Tellen cellen met een hemocytometer. Presteren dan stroom cytometrische analyse (hoofdstuk 4) of TEC verrijking (hoofdstuk 5).

4 Identificatie van TEC door flowcytometrie

1. Bereid cellen om een eindconcentratie van 4 x 10 ⁶ cellen per 100 ui in FACS buffer kleuring in een 96 putjes met ronde bodem testplaat en houdt de plaat op ijs. Voeg 20 ul Fc blokkeeroplossing (anti-CD16 / CD32 antilichaam bij 10 ug / ml in FACS-buffer) aan de cellen en incubeer de cellen gedurende 10 min op ijs. Draai de plaat bij 400 xg, 4 ° C gedurende 3 minuten. Gooi vloeistof uit putten door flicking de plaat gezicht naar beneden in een gootsteen.
2. Hang de pellet cellen in 100 pi antilichaam cocktail (anti-CD45, -EpCAM, -MHC klasse II, en -Ly51 antilichamen, en de UEA-1 lectine gelabeld met verschillende fluorchromen bij de fabrikant aanbevolen of getest optimale concentraties van elk antilichaam in FACS-buffer ) en incubeer de cellen op ijs gedurende 20 min in het donker. Tot schadevergoeding, vlekken 1 x 10 ⁶ cellen met elk individu fluorchroom.
3. Voeg 100 ui FACS buffer aan elk putje en draaien de plaat bij 400 xg, 4 ° C gedurende 3 minuten. Herhaal de wasstap eentijd, en resuspendeer cellen in 100 ui FACS-buffer. Breng de cellen om een ​​12 x 15 mm ronde bodem FACS buis gevuld met 300 ul FACS-buffer. Verwerven monsters op flowcytometer en analyseren middels FACS-analyse software. TEC gating strategie wordt getoond in figuur 2.

5 Verrijking van TEC door Pannen

1. Spin down de thymus cellen (opgesteld in hoofdstuk 3) bij 400 xg, 4 ° C gedurende 5 minuten. Zuig de vloeistof en schorsen gepelleteerde cellen in FACS sortering buffer bij een concentratie van 2 x 10 ⁸ cellen per ml in een 15 ml of 50 ml conische buis. Add anti-CD90.2 antilichaam (kloon 30-H12) (of anti-CD45) bij een eindconcentratie van 2,5 ug / ml celsuspensie en incubeer cellen zachtjes op een roterende menger bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Na de incubatie, wassen met een 5 - 10x volume RP 10 medium en centrifugeer de buis bij 400 xg, 4 ° C gedurende 5 minuten.
2. Zuig de vloeistof en resuspendeer de gepelleteerde cellen inRP 10 medium bij een concentratie van 1 x 10 ⁷ per ml. Voeg 5 ml celsuspensie elke panning beklede plaat (bereid in stap 1.3), werveling en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Wervelen krachtig; breng de supernatanten in een conische buis. Spoel de plaat twee keer met RP10 medium en de supernatants in de collectie buis.
3. Centrifugeer de verzamelbuis bij 400 xg, 4 ° C gedurende 5 minuten. Zuig de vloeistof en resuspendeer de gepelleteerde cellen in 5 ml RP10 medium. Voeg de celsuspensie in nieuw panning plaat wervelen en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verzamel de cellen spoel de plaat en samen te in een conische buis. Zodra TEC verrijkt, spin down de cellen op 400 xg, 4 ° C gedurende 5 minuten en suspendeer de cellen in 5 ml FACS sortering buffer.

6 Zuivering van TEC door Cell Sorting

1. Tellen cellen met een hemocytometer en bereiden celsuspensie bij een concentratie van 4 x 10 ⁷ cellen in FACS sortering buffer. Antilichamen des toevoegencribed in paragraaf 4.4 in cel-oplossing en incubeer cellen zachtjes op een roterende mixer bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Na kleuring, wassen en cellen opschorten tot een concentratie van 10 x 10 ⁶ cellen per ml van FACS sortering buffer.
2. Sorteer TEC subsets door een 100 uM nozzle met behulp van fluorescentie-geactiveerde cel sortering. Gesorteerd cellen worden verzameld in 30% (v / v) FBS in RPMI-1640). Zodra celsortering gedaan, centrifuge cellen bij 400 xg, 4 ° C gedurende 5 min en voorbereiden downstream analyse.

Resultaten

Met dit protocol werd een thymus orgaan uit een volwassen muis (deel 2) en een thymus celsuspensie werd bereid zoals uiteengezet in punt 3 Het verkregen celsuspensie bestond uit thymocyten, hematopoietische afgeleide stromale cellen en niet-hematopoietische stromale cellen. CD45 is een pan-hematopoietische marker expressie zowel thymocyten en hematopoietische stromale cellen zoals macrofagen en dendritische cellen. In tegenstelling, TEC's zijn niet van hematopoietische oorsprong en geen CD45 ¹⁵ niet te ui...

Discussie

In het protocol, kritische stappen zijn de voorbereiding van de thymus stromale cellen (hoofdstuk 3) en de verrijking van de TEC's (paragraaf 4). Het wordt sterk aanbevolen dat verse enzym wordt bereid elke keer en het weefsel wordt zo snel mogelijk behandeld. Voor samengevoegd thymi, optimale volume enzymoplossing wordt afhankelijk van het aantal thymi. Indien weefsel residuen na de verwerking, het toevoegen van meer enzymoplossing en verlenging incubatietijd kan celopbrengst toenemen. Tijdens de verrijking van TEC...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anti-mouse EpCAM	eBioscience	XX-5791-YY*	Clone G8.8
Anti-mouse MHC II	eBioscience	XX-5321-YY*	Clone M5/114.15.2
Anti-mouse Ly51	eBioscience	XX-5891-YY*	Clone 6C3
UEA-1	Vector Laboratory	FL-1061
Flow cytometer	BD Biosciences	LSRFortessa
Flow cell sorter	BD Biosciences	FACSAria
FACS tubes	BD Biosciences	352052
Flow cytometry analysis software	TreeStar - Flowjo	FlowJo v7/9
*XX varies by fluorochrome en YY varies by vial size.