Dissectie en Immunokleuring van Imaginal schijven uit Drosophila melanogaster

Summary

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Abstract

Een aanzienlijk deel van de post-embryonale ontwikkeling in de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, plaatsvindt binnen een set van sac-achtige structuren, genaamd imaginaire schijven. Deze schijven leiden tot een hoog percentage volwassen structuren die worden gevonden in de volwassen vlieg. Hier een protocol dat is geoptimaliseerd om deze schijven te herstellen en hen voor te bereiden voor analyse met antilichamen, transcriptie verslaggevers en eiwit valkuilen beschrijven we. Deze procedure is vooral geschikt voor dunne weefsels zoals imaginal schijven, maar kan eenvoudig worden aangepast voor gebruik met dikkere weefsels zoals de hersenen larven en volwassen eierstok. Het schriftelijk protocol en bijbehorende video zal de lezer / kijker te begeleiden bij de dissectie van derde instar larven, fixatie van het weefsel, en de behandeling van imaginaire schijven met antilichamen. Het protocol kan worden gebruikt om imaginal discs ontleden van larven jonger eerste en tweede instar ook. Het voordeel van dit protocol is dat het relatief kort en heeft zijnen geoptimaliseerd voor de hoge kwaliteit behoud van ontleed weefsel. Een ander voordeel is dat de fixatie procedure die wordt toegepast werkt goed met het overgrote aantal antilichamen dat Drosophila eiwitten herkennen. In onze ervaring, is er een zeer klein aantal gevoelige antilichamen die niet goed werken met deze procedure. In deze situaties, lijkt de oplossing te zijn om een ​​alternatieve fixatie cocktail te gebruiken terwijl u de richtlijnen die wij hebben toegelicht voor de dissectie stappen en antilichaam incubatie volgen.

Introduction

Al meer dan een eeuw de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, is een van de beste systeem om de ontwikkeling, het gedrag en de fysiologie te bestuderen geweest. Ontwikkeling in de vlieg kan worden onderverdeeld in twee grote fasen: de embryonale en post-embryonale met veel van deze laatste hebben binnen monolaag epithelia genoemd imaginaire schijven ^1-3. Tekeningen van imaginaire schijven werden voor het eerst gepubliceerd in 1864 door August Weismann, als onderdeel van zijn brede monografie over insecten ontwikkeling ^1. Deze schijven beginnen hun ontwikkeling tijdens de embryogenese, worden gevormd tijdens de larvale ....

Protocol

1 Voorbereiding van Larven

1. Vul een 35 mm petrischaal met dissectie buffer.
2. Plaats larven in petrischaal en hen in staat stellen om rond te zwemmen voor een paar minuten (zelfreinigende stap).
3. Transfer larven tot een pool van dissectie buffer op basis van siliconen dissectie plaat. Dit zwembad moet aan de ene rand van de plaat. De dissectie plaat bestaat uit een siliconen oplossing werd gegoten en gehard in een glazen petrischaal.
4. Met behulp van een pasteur-pipet, plaats een grotere groep dissectie buffer in het midden van de dissectie plaat.
5. Met behulp van # 5 tang, de overdracht van een enkel gereinigd larve uit het....

Results

De methode die hiervoor betrouwbaar wordt beschreven produceert hoogwaardige materiaal voor analyse met in situ sondes, transcriptie verslaggevers, eiwit vallen en antilichamen. In figuur 1 geven we oog-antenne, genitale, vleugel, haltere en been schijven die routinematig worden hersteld met deze methode. Deze schijven werden behandeld met een falloïdine-geconjugeerd fluorofoor, dat bindt aan F-actine en derhalve schetst elke cel. Wanneer het weefsel is goed dan vastgestelde morfogenetische gro.......

Discussion

Hoewel deze procedure is grotendeels gericht op de isolatie en daaropvolgende behandeling van oog-antennaal discs, het gemakkelijk kan worden gebruikt voor het isoleren en analyseren van de vleugel, haltere, been en genitale discs (figuur 4). De enige vereiste wijziging van het protocol voor het isoleren van deze schijven (in tegenstelling tot de eye-antennal disc) is de methode van grove dissectie (deel 2 van het protocol). De eerste thoracale been (T1) pair is te vinden op de voorste van de larve en k.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5 KG	Used to create base for dissection plate
Pryex Glass Petri Dish 150 x 20 mm	Dow Corning	3160-152CO	Use the cover for dissection plate
#5 Dissecting Forceps	Ted Pella	525	Forceps must be kept very sharp
9 well watch glass	Vairous Vendors		Used for fixation of imaginal disc complexes
50 ml Erlenmeyer Flask	Various Vendors
Small Stir Bar	Various Vendors		Small enough to fit into Erlenmeyer Flask
50 ml Conical Tubes	Various Vendors
1.5 ml Microfuge Tubes	Various Vendors		Clear or Dark depending upon application
Microfuge Rack	Various Vendors
Benchtop Rotator	Various Vendors		100 μl volume should not splatter at low setting
Paraformaldehyde	Macron Chemicals	2-26555-1	Serves as fixative
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma Chemical Co	S-3139	Used to make dissection and wash buffers
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Chemical Co	71636	Used to make dissection and wash buffers
Lysine	Acros Organics	125221000	Used in the fixative solution
Sodium Periodate	Sigma Chemical Co	S-1878	Used in the fixative solution
Triton X-100	EMD Chemicals	MTX1568-1	Used to perforate imaginal discs
Sodium Hydroxide	EM Science	SX0593-3	Used to dissolve paraformaldehyde
100% Normal Goat Serum	Jackson Laboratories	005-000-121	Serves as a blocking solution
Primary Antibodies	Various Vendors		Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer
Secondary Antibodies	Various Vendors		Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer
Vectashield	Molecular Probes	H-1000	Prevents bleaching of samples
Microscope Slides	Fischer Scientific	48312-003
Glass Cover Slips 18 x 18 mm	Fischer Scientific	12-542A
Kimwipe Tissue	Various Vendors		Prevents Glass slides from adhering to silicone base
Panit Brush 000	Various Vendors		Use to gently lower coverslip on to samples