Dissectie en Immunokleuring van Imaginal schijven uit Drosophila melanogaster

Samenvatting

De volwassen structuren van Drosophila zijn afgeleid van zak-achtige structuren die imaginale schijven worden genoemd. Analyse van deze schijven biedt inzicht in vele ontwikkelingsprocessen, waaronder weefselbepaling, oprichting van compartimentgrenzen, celproliferatie, celbestemmingsspecificatie en cellulaire planaire polariteit. Dit protocol wordt gebruikt om imaginale schijven voor te bereiden op licht-/fluorescentiemicroscopie.

Samenvatting

Een aanzienlijk deel van de post-embryonale ontwikkeling in de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, plaatsvindt binnen een set van sac-achtige structuren, genaamd imaginaire schijven. Deze schijven leiden tot een hoog percentage volwassen structuren die worden gevonden in de volwassen vlieg. Hier een protocol dat is geoptimaliseerd om deze schijven te herstellen en hen voor te bereiden voor analyse met antilichamen, transcriptie verslaggevers en eiwit valkuilen beschrijven we. Deze procedure is vooral geschikt voor dunne weefsels zoals imaginal schijven, maar kan eenvoudig worden aangepast voor gebruik met dikkere weefsels zoals de hersenen larven en volwassen eierstok. Het schriftelijk protocol en bijbehorende video zal de lezer / kijker te begeleiden bij de dissectie van derde instar larven, fixatie van het weefsel, en de behandeling van imaginaire schijven met antilichamen. Het protocol kan worden gebruikt om imaginal discs ontleden van larven jonger eerste en tweede instar ook. Het voordeel van dit protocol is dat het relatief kort en heeft zijnen geoptimaliseerd voor de hoge kwaliteit behoud van ontleed weefsel. Een ander voordeel is dat de fixatie procedure die wordt toegepast werkt goed met het overgrote aantal antilichamen dat Drosophila eiwitten herkennen. In onze ervaring, is er een zeer klein aantal gevoelige antilichamen die niet goed werken met deze procedure. In deze situaties, lijkt de oplossing te zijn om een ​​alternatieve fixatie cocktail te gebruiken terwijl u de richtlijnen die wij hebben toegelicht voor de dissectie stappen en antilichaam incubatie volgen.

Inleiding

Al meer dan een eeuw de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, is een van de beste systeem om de ontwikkeling, het gedrag en de fysiologie te bestuderen geweest. Ontwikkeling in de vlieg kan worden onderverdeeld in twee grote fasen: de embryonale en post-embryonale met veel van deze laatste hebben binnen monolaag epithelia genoemd imaginaire schijven ^1-3. Tekeningen van imaginaire schijven werden voor het eerst gepubliceerd in 1864 door August Weismann, als onderdeel van zijn brede monografie over insecten ontwikkeling ^1. Deze schijven beginnen hun ontwikkeling tijdens de embryogenese, worden gevormd tijdens de larvale stadia, overleef de massale histolysis van de vroege stadia popstadium en uiteindelijk leiden tot een hoog percentage volwassen structuren die binnen de volwassen vliegen ^1-14. Tijdens de ontwikkeling van de larven elke schijf maakt een aantal belangrijke beslissingen met betrekking tot het lot, vorm en grootte. Binnen de eerste en tweede larvale stadia, worden de schijven belast met de vaststelling van een primaire lot, establishing compartiment grenzen, de vaststelling van de juiste vorm en het genereren van de benodigde aantal cellen ^15-16. Tijdens het derde larvale instar en vroege pre-popstadium, de imaginaire schijven blijven delen en zijn patroon als cellen hun terminal lot ¹⁶ vast te stellen.

Tijdens de vroege geschiedenis van Drosophila ontwikkelingsbiologie, werden imaginal schijven vrijwel uitsluitend onderzocht in het kader van de normale ontwikkeling en in de beperkte gevallen waarin een verlies of winst-of-function mutant levensvatbaar was. Het gebruik van X-stralen induceren mitotische recombinatie toegestaan ​​letale mutaties in celklonen binnen de larven en volwassen weefsels te analyseren. Deze werkwijze is verbeterd door de introductie van transgene methoden verlies analyseren en gain-of-function mutaties in zowel larven en volwassen weefsels. Het aantal antilichamen, transcriptie verslaggevers en eiwit vallen voor het beschrijven van de moleculaire landschap van wild-type en mutante weefsels is ook constantly groeien. Met deze moleculaire merkers verlies analyseren en gain-of-function mutante celklonen is het steeds mogelijk om een ​​real-time begrijpen hoe mutantcellen afwijken van hun wildtype neven tijdens ontwikkeling krijgen. Om goed gebruik maken van deze instrumenten en reagentia is het essentieel om een ​​hoge kwaliteit van de voorbereidingen imaginal schijven die kunnen worden bekeken, gefotografeerd en geanalyseerd hebben. Het doel van dit manuscript is een geoptimaliseerd protocol voor de isolatie en de voorbereiding van de eye-antennaal schijf complex (Figuur 1A) te verstrekken. Het kan ook met succes worden gebruikt om een groot aantal extra schijven zoals die welke tot de vleugels, halters, T1-T3 benen en genitaliën (Figuur 1B-E) te isoleren. Deze procedure, met kleine aanpassingen is gebruikt om imaginal discs isoleren van Drosophila bijna tachtig jaren.

Zoals hierboven beschreven, aangezien de meeste genen die tijdens multiple ontwikkelingsstadia en in een veelheid van weefsels, is het vaak onmogelijk om de effecten te onderzoeken die null-mutanten op het hele oog als het dier sterft ruim voor het derde instar larvale stadium. Vier methoden hebben de studie van de meer ontwikkelde weefsels gemaakt, zoals het netvlies significant meer handelbaar. De eerste is de methode flippase (FLP) / flippase Recombinatie Target (FRT) genereren mutante cel klonen in een overigens wildtype weefsel ^17-19. In dit geval de mutant weefsel wordt geïdentificeerd door de afwezigheid van een markering zoals Green Fluorescent Protein (GFP) en kan worden vergeleken met de omringende wildtype weefsel waarin GFP aanwezig is (figuur 2D). De tweede is de "FLP-out" werkwijze waarbij een transgen tot expressie wordt gebracht in een populatie van cellen ^20. In dit geval de cel klonen worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van GFP en vergeleken met de omringende wildtype weefsel dat de GFP reporter mist (figuur2E). De derde is de Mosaic-analyse met een onderdrukbare Cell Marker (MARCM) techniek, die elementen van de FLP / FRT mutant kloon en FLP-out expressie systemen ²¹ combineert. Met deze methode een transgen kan worden uitgedrukt in een populatie van cellen die tegelijkertijd mutant voor individuele genetische locus. Like flp-out klonen worden MARCM klonen geïdentificeerd door de aanwezigheid van GFP en vergeleken met de omringende wildtype weefsel dat de GFP merker (figuur 2F) mist. Tenslotte, de genen en RNAi constructen kunnen worden die binnen imaginaire weefsels onder controle van promotor-GAL4 constructen. Deze vier methoden hebben de belangstelling voor het bestuderen denkbeeldige schijven toegenomen sinds mutant en overexpressie klonen of direct kunnen worden vergeleken met aangrenzende wildtype weefsel. Werkwijze in deze procedure wordt beschreven is ontwikkeld om onderzoekers die de post-embryonale ontwikkeling van volwassen weefsels in Drosophila bestuderenname afkomstig uit de oog-antennaal disc, kunnen hoge kwaliteit weefsel te verkrijgen voor analyse. Hoewel individuele onderzoekers lichte wijzigingen hebben gemaakt, heeft de kern van deze procedure (die we hier beschrijven) grotendeels onveranderd gebleven. Na het behalen van hoge kwaliteit weefsel is van cruciaal belang voor de studie van de imaginaire schijven we hopen dat dit schriftelijk protocol en de bijbehorende video zal dienen als een waardevol leermiddel.

Protocol

1 Voorbereiding van Larven

1. Vul een 35 mm petrischaal met dissectie buffer.
2. Plaats larven in petrischaal en hen in staat stellen om rond te zwemmen voor een paar minuten (zelfreinigende stap).
3. Transfer larven tot een pool van dissectie buffer op basis van siliconen dissectie plaat. Dit zwembad moet aan de ene rand van de plaat. De dissectie plaat bestaat uit een siliconen oplossing werd gegoten en gehard in een glazen petrischaal.
4. Met behulp van een pasteur-pipet, plaats een grotere groep dissectie buffer in het midden van de dissectie plaat.
5. Met behulp van # 5 tang, de overdracht van een enkel gereinigd larve uit het kleine zwembad op de grotere pool van dissectie buffer.

2 Grof Dissectie van Larven

1. Terwijl de larve is nog steeds binnen het grote zwembad van dissectie buffer omklemmen de larve met de tang. Een pincet worden gebruikt om de mond haken grijpen terwijl de andere tang wordt gebruikt om de anim houdenal nog (pak de larve zachtjes op 1/3 lichaamslengte).
2. Houd stabiliseren de tang met de cuticula bij mondhaken snel trekken terwijl de rest van het lichaam veranderen met het tweede paar pincetten.
3. Als de larve begint te scheuren je een lichte versie van de spanning voelen. Laat de larve van de tang en laat voor het "lef" van de larve te morsen. Dit zorgt voor de imaginaire schijven in hun normale conformatie te blijven en voorkomt dat ze worden vervormd.
4. Met een pincet grijpen weer de mond haken aan het vooreinde van de larve plaats houden. De andere paar pincetten verwijder de onderste 2/3 van de larven onder de binnenste ingewanden. Let op: een complex met de mond haken, de eye-antennal schijven, hersenhelften, ventrale ganglion, de speekselklieren, wat been schijven, en de bovenliggende opperhuid zal blijven.
5. Met een pincet voorzichtig verwijderen bovenliggende opperhuid, speekselklieren, been schijven enander weefsel. Let op: alleen weefsel dat moet blijven is de mond haken, oog-antennale schijven, hersenhelften, en ventrale ganglion (Figuur 3).
6. Herhaal stappen 2.1-2.5 met extra larven gedurende 15-20 minuten. Opmerking: denkbeeldige schijven die blijven dissectie buffer voor langere tijd meestal afneemt en uiteindelijk zal als minder dan ideaal specimens worden gefotografeerd. Aldus, na maximaal 20 minuten alle ontlede weefsels worden overgedragen aan de PLP fixatief (zie hieronder).

3 door fixatie en kleuring van weefsel met antilichamen

1. Met behulp van een P-200 pipetman, de overdracht van de ontleed weefsels om een ​​horloge glas met koud Paraformaldehyde-lysine-Periodaatoxidatie (PLP) fixatief. Beperk het volume van de overgedragen dissectie buffer om 50 pi tot verdunning van PLP minimaliseren. Zorg ervoor dat de punt snijden met een scheermesje zodat de tip opening is groot genoeg om de ontleed weefsels tegemoet. Met behulp van een pincet ofEen wolfraam naald toe dat de ontleed weefsel volledig ondergedompeld zodat goede fixatie optreedt. Incubeer ontleed weefsel in koude PLP fixatief 45 minuten. Deze incubatie kan plaatsvinden bij kamertemperatuur zonder roeren.
2. Met behulp van een P-200 pipetman, de overdracht van de ontleed weefsels aan buffer te wassen (RT) met een andere gesneden gele punt voor 45 min. Beperk het volume van de overgedragen PLP 50 pi tot verwatering van de wasbuffer minimaliseren. Let op: alle ontleed weefsels moeten volledig worden ondergedompeld.
3. Overdracht 20-30 sets van ontleed weefsel tot 1,5 ml microcentrifugebuis. Opmerking: Als grotere aantallen eye-antennaal disc complexen worden gecombineerd in de buis, is er een mogelijkheid dat het weefsel op de bodem van de buis niet correct worden blootgesteld aan de antilichamen. Voor optimale resultaten niet meer dan 20-30 eye-antennaal disc complexen moeten aanwezig zijn binnen een enkele buis. De ontleed weefsel naar de bodem van de microcentrifugebuis. Daarom, in opeenvolgende stappen use een pipetman te verwijderen en te vervangen wasbuffer, het blokkeren van oplossing, en antilichamen.
4. Verwijder wasbuffer en vervangen door 100 pl blokkeeroplossing: 10% normaal geit serum in wasbuffer. Incubeer bij kamertemperatuur met zachte rotatie op een tafelblad rotator gedurende 10 minuten.
5. Verwijder het blokkeren oplossing en te vervangen door 100 ul van primaire antilichamen die adequaat werd verdund in 10% normaal geit serum. Incubeer bij kamertemperatuur onder zacht rotatie gedurende 16 uur.
6. Verwijder primaire antilichamen en te vervangen door 750 ul wasbuffer. Plaats buisjes op een nutator en laat nutate bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Opmerking: Het primaire antilichaam kan worden opgeslagen (opslag bij 4 ° C) en later hergebruikt. Hergebruik antilichamen meerdere keren kan helpen bij het verminderen van niet-specifieke binding.
7. Laat hoofden naar de bodem van de buis, verwijder wasbuffer en voeg 100 pl secundaire antilichamen die adequaat werd verdund in 10% normaal serum. Incubeer bij RT met zachte rotatie voor 2̵1, 4 uur.
8. Verwijder secundair antilichaam oplossingen van weefsel en vervangen door 500 ui wasbuffer. Laat weefsel naar de bodem van de buis.
9. Met behulp van een P-200 en een cut gele tip breng dan ontleed weefsels in een pool wasbuffer die aan de dissectie schotel geplaatst. Terwijl gaan met de volgende stap van fijne dissectie zal het weefsel incuberen in de wasbuffer. Dit helpt om overmaat secundaire antilichamen te verwijderen.

4 Fine Dissectie van Eye-Antennaal Disc Complexen en montage op Slides

1. Gebruik een pincet om de cuticula gesp door de mond haken met de ventrale zijde van het complex naar beneden. Met een tweede tang verwijder de twee hersenkwabben het sluiten van de tweede tang in de ruimte tussen de hersenen en de ogen discs (figuur 3, rode pijl) en snel trekken de hersenen verwijderd uit de mond haken.
2. En tegelijkertijd vast te houden aan de mond haken, knijpenhet weefsel zo dicht mogelijk bij de verbinding tussen de antennaal gedeelte van de eye-antennaal disc en de mond haken (figuur 3, blauwe pijl). Let op: de eye-antennal disc complexen moet vrij zijn van alle weefsels (figuur 1A) zijn. Ga door tot alle gewenste weefsel gewenst dat op dia's kunnen worden geplaatst is ontleed. Dit protocol kan worden aangepast aan de vleugel, haltere, been en genitale verbeelding discs (Figuur 1B-E) isoleren.
3. Voeg twee kleine stukjes vloeipapier (grootte van dekglaasjes) ongeveer 3 in. Elkaar op het ontleden schotel. Plaats een glasplaatje op de schotel - de twee stukken vloeipapier moet onder de uiteinden van de schuif. Dit voorkomt dat de glijbaan van het vasthouden aan de siliconen basis van het ontleden schotel.
4. Met behulp van een P-20 met een geslepen punt, voeg 9 ul van een anti-bleekmiddel naar het midden van het microscoopglaasje. Dit voorkomt bleken van het weefsel wanneer bekeken met fluorescentelicht.
5. Met behulp van dezelfde ongesneden tip, verzamel alle eye-antennal schijven en voeg ze toe aan de daling van de anti-blekingsreagens. Het minimaliseren van de hoeveelheid wasbuffer dat dan wordt uitgevoerd. Probeer de hoeveelheid wasbuffer beperken tot 10 gl of minder.
6. Gebruik een pincet om te scheiden en spreiden de eye-antennal schijven binnen de druppel anti-blekingsreagens. Laat discs incuberen in anti-blekingsreagens enkele minuten. NB: Geen duidelijk zal blijken als het weefsel absorbeert de anti-blekingsreagens.
7. Met een fijn penseel voorzichtig zakken een dekglaasje op het monster. Dit voorkomt de vorming van luchtbellen.
8. WINKEL glijdt bij -20 ° C tot klaar voor het oog-antennaal of andere imaginaire discs met licht of fluorescentiemicroscopie bekijken.

Resultaten

De methode die hiervoor betrouwbaar wordt beschreven produceert hoogwaardige materiaal voor analyse met in situ sondes, transcriptie verslaggevers, eiwit vallen en antilichamen. In figuur 1 geven we oog-antenne, genitale, vleugel, haltere en been schijven die routinematig worden hersteld met deze methode. Deze schijven werden behandeld met een falloïdine-geconjugeerd fluorofoor, dat bindt aan F-actine en derhalve schetst elke cel. Wanneer het weefsel is goed dan vastgestelde morfogenetische gro...

Discussie

Hoewel deze procedure is grotendeels gericht op de isolatie en daaropvolgende behandeling van oog-antennaal discs, het gemakkelijk kan worden gebruikt voor het isoleren en analyseren van de vleugel, haltere, been en genitale discs (figuur 4). De enige vereiste wijziging van het protocol voor het isoleren van deze schijven (in tegenstelling tot de eye-antennal disc) is de methode van grove dissectie (deel 2 van het protocol). De eerste thoracale been (T1) pair is te vinden op de voorste van de larve en k...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5 KG	Wordt gebruikt om de basis voor de dissectieplaat te maken
Pryex Glass Petri Dish 150 x 20 mm	Dow Corning	3160-152CO	Gebruik de deksel voor de dissectieplaat
#5 Dissecting Forceps	Ted Pella	525	De pincetten moeten erg scherp worden gehouden
9 well watch glass	Vairous Vendors		Wordt gebruikt voor het fixeren van imaginaire schijfcomplexen
50 ml Erlenmeyer Flask	Various Vendors
Small Stir Bar	Various Vendors		Klein genoeg om in de Erlenmeyer Flask te passen
50 ml Conical Tubes	Various Vendors
1.5 ml Microfuge Tubes	Various Vendors		Duidelijk of donker, afhankelijk van de toepassing
Microfuge Rack	Various Vendors
Benchtop Rotator	Various Vendors		100 μl volume mag niet spatten op lage instelling
Paraformaldehyde	Macron Chemicals	2-26555-1	Dient als fixeermiddel
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma Chemical Co	S-3139	Wordt gebruikt om dissectie- en spoelbuffers te maken
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Chemical Co	71636	Wordt gebruikt om dissectie- en spoelbuffers te maken
Lysine	Acros Organics	125221000	Wordt gebruikt in de fixeeroplossing
Sodium Periodate	Sigma Chemical Co	S-1878	Wordt gebruikt in de fixeeroplossing
Triton X-100	EMD Chemicals	MTX1568-1	Wordt gebruikt om imaginaire schijven te perforeren
Sodium Hydroxide	EM Science	SX0593-3	Wordt gebruikt om paraformaldehyde op te lossen
100% Normal Goat Serum	Jackson Laboratories	005-000-121	Dient als blokkeringsoplossing
Primary Antibodies	Various Vendors		Verdun in 10% geitenserum zoals aangegeven door de fabrikant
Secondary Antibodies	Various Vendors		Verdun in 10% geitenserum zoals aangegeven door de fabrikant
Vectashield	Molecular Probes	H-1000	Voorkomt verbleken van monsters
Microscope Slides	Fischer Scientific	48312-003
Glass Cover Slips 18 x 18 mm	Fischer Scientific	12-542A
Kimwipe Tissue	Various Vendors		Voorkomt dat glazen platen aan de siliconen basis blijven plakken
Panit Brush 000	Various Vendors		Gebruik om de dekglas voorzichtig op de monsters te leggen