Snelle analyse van chromosoomafwijkingen in Muis B-lymfocyten door PNA-FISH

Samenvatting

DNA herstelmechanismen zijn essentieel om de genomische integriteit en preventie mutatie en kanker. Het doel van dit protocol is om instabiliteit van het genoom te kwantificeren door middel van directe observatie van chromosoomafwijkingen in metafase verspreidt van de muis B-cellen met behulp van fluorescente in situ hybridisatie (FISH) voor telomeer DNA herhalingen.

Samenvatting

Defecte DNA herstel leidt tot genomische instabiliteit, wat de oorzaak van mutaties die leiden tot tumorvorming toegenomen. Analyse van de frequentie en de aard van de chromosoomafwijkingen in verschillende celtypes laat defecten in DNA-herstel trajecten worden opgehelderd. Inzicht zoogdieren DNA-reparatie biologie is enorm geholpen door de productie van muizen met uitstoters in specifieke genen. Het doel van dit protocol is om genomische instabiliteit in de muis B-lymfocyten te kwantificeren. Etikettering van de telomeren met PNA-FISH probes (peptide nucleïnezuur - fluorescerende in situ hybridisatie) vergemakkelijkt de snelle analyse van genomische instabiliteit in metafase chromosoom spreads. B-cellen hebben specifieke voordelen ten opzichte van fibroblasten, omdat ze normaal ploïdie en een hogere mitotische index. Korte termijn kweek van B-cellen kunnen dus nauwkeurige meting van genomische instabiliteit in een primaire celpopulatie die waarschijnlijk minder secundaire genetische mutaties dan is typisch in getransformeerde fibroblasten of patiënt cellijnen.

Inleiding

Kanker wordt veroorzaakt door de accumulatie van mutaties die genen die normale celgroei reguleren. Mutatie is een gevolg van veranderingen in de structuur en sequentie van het genoom veroorzaakt door beschadiging van DNA. DNA schade kan ontstaan ​​door een verscheidenheid van proces, waaronder exogene middelen zoals ioniserende straling, en als een bijproduct van normale cellulaire metabolisme zoals spontane deaminatie van nucleotide basen of schade ontstaat contact met reactieve zuurstof species ^1.

Hoewel zoogdiercellen een scala aan reparatie activiteiten die DNA-schade kan terugdraaien of herstellen van de volgorde bij breuk locaties bezitten, mutaties toch verzamelen gedurende de levensduur van een cel. DNA schade kan bovendien bijdragen tot senescentie en verlies van vermogen van stamcellen, twee processen die zijn geassocieerd met veroudering geassocieerde ziekte ^2. Inzicht in de reparatie van DNA-schade is daarom van vitaal belang voor het aanpakken van twee tekenificant vraagstukken in volksgezondheid. Meer gegevens suggereren dat zoogdier-DNA herstelmechanismen kan bijdragen aan de evolutie van de kankercel genoom ^3,4, waardoor het nog noodzakelijk om de bij het ​​onderdrukken mutatie op moleculair niveau processen te begrijpen.

Directe visualisatie van chromosoomafwijkingen is een krachtige en kwantitatieve wijze bepalen van de mate van genomische instabiliteit in een bepaald celtype. Gecondenseerde chromosomen uit cellen in metafase kan worden geïsoleerd en geïnspecteerd door licht of fluorescentiemicroscopie. Dergelijke cytogenetische benaderingen in de praktijk al tientallen jaren en kan worden gebruikt om het uiterlijk van translocaties of specifieke types chromosoomafwijkingen aan een verminderde DNA reparatiewerkzaamheden tonen. Het protocol leent zich voor verschillende potentiële extensies: chromosomen kunnen met probes voor spectrale karyotypering (SKY) of meerkleurige fluorescerende in situ hybridisatie worden geëtiketteerd(MFISH) om translocaties ^5,6 identificeren. Deze technieken de frequentie van chromosoom translocaties en de structuur van complexe chromosoom translocaties te bepalen, die aanvullende informatie biedt dan wat er mogelijk is met dit protocol in te schakelen ook. Alternatief kunnen sequentie-specifieke probes gegenereerd en gebruikt om de frequentie van DNA breuken testen geselecteerde genome locaties ^7.

In dit protocol beschrijven we bereiding van metafase chromosoom spreads van B lymfocyten. Een fluorescentie-gemerkt peptide nucleïnezuur (PNA) probe voor telomeer herhalingen gebruikt, die efficiënt merken telomeren in metafase chromosoom spreads Dit protocol heeft verschillende voordelen. B-cellen kunnen worden geïnduceerd te groeien bij hoge mitotische index zodat hoogwaardige spreads logischerwijze kan worden geproduceerd. B-cellen van genetisch gemodificeerde muizen zijn ook veel minder waarschijnlijk secundaire genetische mutaties die de analyse van de bijdrage kan verwarren bevattenspecifieke genen genomische integriteit. De PNA-FISH aanpak kan in een dag worden afgerond, en maakt het mogelijk nauwkeuriger scoring van chromosoom breekt. Door deze benadering, met name in combinatie met specifieke apparatuur beschreven in dit protocol is het mogelijk om zeer consistent hoge kwaliteit spreads produceren en snel analyseren de snelheid en aard van genomische instabiliteit.

Protocol

Deze procedure werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan Rutgers, de State University van New Jersey. Muizen werden behandeld in overeenstemming met de NIH Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren. Wetenschappers moeten hun nationale en institutionele dierlijke organisaties raadplegen voor gevestigde en erkende richtlijnen.

Voordat u begint, voor te bereiden van de in tabel 1 vermelde oplossingen.

1 B Cell Isolatie en Activering

Euthanaseren een muis met behulp van CO _2, gevolgd door cervicale dislocatie. Plaats de muis, zodat de linkerkant van het lichaam is op en spuit de muis met 70% ethanol tot de vacht is vochtig. Ontleden de milt en in een 35 mm weefselkweekplaat met 2 ml wasbuffer. In een laminaire stroming kap voorzichtig breken de milt in de weefselkweek schaal met het vlakke uiteinde van een injectiespuit 5 ml.

1. Plaats een 70 pm nylon mesh in een 50ml buisje en breng de milt monster in 2 ml wasbuffer in de nylon mesh. Voorzichtig verstoren de milt in het gaas met het platte uiteinde van de spuit.
2. Spoel de achterkant van de injectiespuit en de 35 mm plaat met 8 ml wasbuffer en filtreer door 70 urn nylon mesh. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
3. Zuig en gooi en resuspendeer de pellet in 3 ml ACK lysis buffer. Pipet op en neer kort om klonten te verstoren en incubeer gedurende 5 minuten. Voeg 10 ml wasbuffer en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
4. Zuig en verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet door de bodem van de buis te tikken vervolgens pipetteren in 1 ml wasbuffer. Voeg 50 ul van anti-CD43 MACS micro-kralen en incubeer op ijs gedurende 30 minuten. Voeg 10 ml wasbuffer, meng en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Voeg 10 ml wasbuffer, meng en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
5. Het opzetten van eenMini-MACS kolom door het plaatsen van een kolom aan de MACS magneet. Plaats een gelabelde 15 ml conische buis onder de kolom. Voeg 1 ml wasbuffer naar kolom en laat doorlopen tot de 15 ml buis.
6. Zuig het supernatant en resuspendeer in 1 ml wasbuffer. Plaats het monster in de kolom na het wassen buffer is doorgelopen.
7. Nadat het monster door de kolom, 1 ml wasbuffer op de kolom te wassen. 7 ml wasbuffer direct naar opgevangen monster in de 15 ml buis.
8. Tel de cellen met een hemocytometer. Breng de gewenste hoeveelheid cellen die nodig zijn voor 5.000.000 cellen / putje in een 50 ml buis. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Supplement B-celmedium met LPS 1: 500 en IL4 1: 1.000.
9. Zuig het supernatant en voeg de juiste hoeveelheid aangevuld B celmedium nodig voor eindconcentratie van 1.000.000 cellen / ml.
10. Plaat cellen in 6-well platen met 5 ml van cellen bij 1.000.000 cellen / ml en in een bevochtigered celkweek incubator bij 37 ° C, 5% _CO2.

2 B Cell Fixation

1. Voeg 50 ul van colcemide het putje met 5 ml van B-cellen (een eindconcentratie van 100 ng / ml) en incubeer 1 uur bij 37 ° C. Voorverwarming 75 mM KCl oplossing in een 37 ° C waterbad. Breng de B-cellen een gelabeld 15 ml buis. Bedek het label met tape en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
2. Zuig het supernatant verlaten van 1 ml in de buis en resuspendeer de pellet door pipetteren. Voeg 5 ml van de voorverwarmde KCl druppelsgewijs terwijl tikken of pulseren op een vortex.
3. Voeg 10 ml van KCl en meng door. Incubeer in een 37 ° C waterbad gedurende 15 minuten. Voeg 5 druppels verse fixatief en meng door. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Zuig het supernatant verlaten van 1 ml in de buis en resuspendeer pellet door en neer te pipetteren.
4. Voeg 5 ml vers fixatief er druppelsgewijs bij tikken of pulseren op een vortex. Een extra 10 ml fixeermiddel en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
5. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Zuig het supernatant verlaten van 1 ml in tube en resuspendeer door pipetteren. Voeg 14 ml vers fixeermiddel en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
6. Herhaal stap 2.7 tweemaal.
7. Voeg 14 ml vers fixeermiddel. Sluit de doppen met Parafilm en bewaar overnacht bij -20 ° C.

3 Voorbereiding van de metafase chromosoom Spreads

1. Stel een gereguleerd klimaatkamer tot 22,9 ° C en 52% luchtvochtigheid.
2. Centrifugeer de vaste B-cellen bij 300 g gedurende 10 min bij 4 ° C. Zuig fixeermiddel verlaten 70 ul in de buis en resuspendeer door pipetteren.
3. Plaats het label dia's in de vochtige kamer bij een 35 ° hoek. Drop 35 ul van de geresuspendeerde B-cellen op een dia en drop twee glaasjes per monster. Laat de dia's te drogen in de vochtige kamer gedurende 30 minuten vervolgens de dia's op te slaanin een dia doos bij 37 ° C.

4 telomeren PNA FISH

1. Bereiding van Probe
   1. Pre-warm gedeïoniseerd formamide bij 37 ° C. Meng 2 ui telomere PNA probe met 7 pl gedeioniseerd voorverwarmde formamide en incubeer bij 37 ° C onder schudden gedurende 1 uur.
   2. Pre-warme FISH master mix tot 37 ° C. Voeg 7 ul voorverwarmde FISH master mix aan het mengsel van stap 4.1.1 en incubeer bij 37 ° C gedurende 1-3 uur.
   3. Denatureren de sonde mengsel gedurende 8 minuten bij 80 ° C. Pre-de probe hybridiseren gedurende 1 uur bij 37 ° C.
2. Voorbehandeling van chromosoom Slides
   1. Pre-warm een ​​glasplaatje-kleuring pot bevattende 50 ml 0,01 M HCl tot 37 ° C in een waterbad.
   2. Plaats de glaasjes in een andere objectglaasje-kleuring pot met 2x SSC gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
   3. Voeg 2 pl pepsine bouillon aan de voorverwarmde glasplaatje-kleuring pot en meng door. Breng de dia's aan dit glas slide-kleuring pot en incubeer 90 seconden bij 37 ° C.
   4. Was de dia 2x in een andere objectglaasje-kleuring pot met 1x PBS gedurende 5 min elk bij kamertemperatuur schudden. Was daarna de objectglaasjes gedurende 5 min in 1x PBS / _MgCl2 bij kamertemperatuur schudden.
   5. Breng de dia een glasplaatje-kleuring pot die vers bereide 1% formaldehyde / 1x PBS / _MgCl2 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
   6. Was de dia's voor 5 min in een andere objectglaasje-kleuring pot met 1x PBS bij kamertemperatuur schudden.
   7. Bereid een ethanol uitdroging serie van met verschillende glasplaatje-kleurbakjes bevattende 70%, 90% en 100% ethanol.
   8. Breng de objectglaasjes elke pot gedurende 3 minuten, te beginnen met 70% ethanol, vervolgens 90% ethanol en vervolgens 100% ethanol. Plaats ethanol potten bij -20 ° C als u klaar bent.
   9. Laat de dia's aan de lucht drogen door een teveel ethanol te tikken op een papieren handdoek en stutten dia's in een 35 ° hoek. Eenmaal droog, mark een 18 x 18 mm stippellijn voor hybridisatie op de achterkant van de objectglaasjes met een diamant pen.
3. Denaturatie van Dia's voor FISH
   1. Solliciteer 120 ul 70% gedeïoniseerd formamide / 2X SSC tot een 24 x 60 mm dekglaasje. Tik op de schuif om het dekglaasje. Denatureren de glijbaan bij 80 ° C op een hete plaat gedurende 90 sec.
   2. Snel en voorzichtig schuif het dekglaasje en plaats de dia in ijskoude 70% ethanol gedurende 3 min, gevolgd door 90% ethanol en 100% ethanol elk voor 3 minuten. Laat de glaasjes aan de lucht drogen.
   3. Bereid een vochtige kamer door de voering van een plastic doos met een strakke deksel en nat vloeipapier. Het papier moet vochtig, maar niet verzadigd met water.
   4. In een vochtige kamer, passen de pre-gehybridiseerde probe-mengsel uit stap 4.1.3 tot het gemarkeerde gebied op de dia, bedekken met een 18 x 18 mm dekglaasje en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
4. Post-incubatie Wast
   1. Voorverwarmen 50% formamide / 2 x SSC, 1 x SSC en 4x SSC / 0,1% Tween-20 in een 45 °, C waterbad.
   2. Verwijder voorzichtig de dekglaasjes en het wassen van de objectglaasjes in de voorverwarmde 50% formamide / 2x SSC 3xfor 5 min elk in het donker en schudden. Was de dia's in de voorverwarmde 1x SSC 3xfor 5 minuten elk, schudden. Tot slot, was de dia's in voorverwarmde 4x SSC / 0,1% Tween-20 3xfor 5 min elk.
   3. Vlekken op de dia's voor 3 min in DAPI in een licht beschermde glasplaatje kleuring pot.
   4. Was de dia's voor 5 min in 2x SSC, schudden. Breng 35 pl Mowiol fixeermiddel, behandel met 24 x 60 mm dekglaasjes en de glijbanen bewaren bij 4 ° C.

5 Microscopische analyse van Chromosomen

1. Analyseer de metafase dia's met behulp van een standaard epi-fluorescentie microscoop. Gebruik een imaging platform met een geautomatiseerd stadium zoals de MetaSystems Metafer platform om de beste resultaten te verkrijgen. Voor elke metafase spread, voor het fluorescerend signaal van de telomeren p eentje op te halen het ene beeld voor DAPI fluorescentie om chromosomen te visualiseren, engewaad. (Bijvoorbeeld Cy3- andere fluoren zijn en even goed werken.)
2. Overlay van de beelden met een beeldanalyse programma en analyseren.

Resultaten

Metafase chromosomen afkomstig ve cel moet een discrete cluster met 40 chromosomen (bij gebruik muizencellen) (Figuur 1A) vormen. Elk chromosoom een ​​centromeer aan een einde, die zichtbaar als een lichtblauwe bol. In normale chromosomen, zijn twee telomeer signalen van eind van de chromatiden en twee signalen door elke centromeer. Interfase kernen zal aanwezig zijn op de foto ook. Deze zijn zichtbaar als blauwe bollen, rode telomere signalen, maar geen gecondenseerde chromosomen (zie bijvoorbeeld

Discussie

Dat geactiveerde B-lymfocyten zijn bijzonder geschikt voor bereiding van mitotische chromosomen smeersels kunnen andere celtypes worden gebruikt. T lymfocyten hebben veel van de voordelen van B-cellen, zoals ze kunnen worden gezuiverd uit de milt of lymfeknopen, en hebben een hoge mitotische index wanneer gestimuleerd door groei in medium dat adequate mitogenen ^8. Embryonale stamcellen (ES-cellen) zijn ook geschikt voor metafase chromosoom analyse ^9. Indien deze niet beschikbaar zijn, kan fibroblas...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
50% Dextran sulfate	Intergen	S4030
Deionized formamide	Ambion	9342
Pepsin (5 g)	Sigma	P 6887
FCS	Gemini	100-106
LPS (100 mg)	Sigma	L2630
IL-4 (5 μg)	Sigma	I1020
PNA Telomere Probe	PNA Bio Inc	F1002	(CCCTAACCCTAACCCTAA)
Colcemid	Roche	295892
Mowiol 4-88	Sigma	81381-50g
CD43 (ly-48_) micro-beads	Miltenyl Biotec.	130-049-801
DAPI	Sigma	32670-5MG
Eclipse E800	Nikon
AxioImager.Z2	Zeiss
CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber	Thermotron