Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

A Novel In vivo Gene Transfer Techniek en In vitro Cel-gebaseerde testen voor de studie van botverlies bij musculoskeletale aandoeningen

11.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51810

⸱

8 juni 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Rheumatology, Allergy and Clinical Immunology, University of California, Davis, 2Institute for Pediatric Regenerative Medicine, Shriners Hospitals for Children - Northern California, 3Department of Dermatology, University of California, Davis

In dit artikel

Samenvatting

De differentiatie van precursorcellen in osteoclasten wordt gereguleerd door cytokinen en groeifactoren. Hier worden een nieuwe genoverdrachtstechniek voor differentiatie van osteoclasten in vivo en celkweekprotocollen voor het differentiëren van precursorcellen in osteoclasten in vitro beschreven als een methode om de effecten van cytokinen op osteoclastogenese te bestuderen.

Samenvatting

Differentiatie en activering van osteoclasten spelen een sleutelrol in de ontwikkeling van musculoskeletale ziekten, aangezien deze cellen voornamelijk betrokken zijn bij botresorptie. Osteoclasten kunnen in vitro worden gegenereerd uit monocyt/macrofaag-precursorcellen in aanwezigheid van bepaalde cytokinen, die overleven en differentiatie bevorderen. Hier worden zowel in vivo als in vitro technieken gedemonstreerd, die wetenschappers in staat stellen om verschillende cytokine-bijdragen aan osteoclast-differentiatie, signalering en activering te bestuderen. Het minicircle DNA-leveringsgenoverdrachtssysteem biedt een alternatieve methode om een osteoporose-gerelateerd model te vestigen, wat bijzonder nuttig is om de werkzaamheid van verschillende farmacologische remmers in vivo te bestuderen. Evenzo, in vitro kweekprotocollen voor het produceren van osteoclasten uit humane precursorcellen in aanwezigheid van specifieke cytokinen stellen wetenschappers in staat om osteoclastogenese in menselijke cellen te bestuderen voor translationele toepassingen. Gecombineerd hebben deze technieken het potentieel om de ontwikkeling van geneesmiddelen voor op osteoclasten gerichte therapieën te versnellen, wat miljoenen osteoporose- en artritispatiënten wereldwijd ten goede kan komen.

Inleiding

Musculoskeletale aandoeningen invloed op miljoenen mensen in de Verenigde Staten en de huidige ernstige gevolgen voor de nationale en lokale systemen gezondheid 1. Deze aandoeningen worden gekenmerkt door het verlies van bot-en gewrichtsziekten functie die uitgebreide behandeling en lange periodes van herstel nodig hebben. Gewoonlijk, een relatieve toename van het aantal en / of activiteit van osteoclasten, cellen gespecialiseerd bot resorberen, bij osteoporose en artritis waargenomen 2. Onder fysiologische omstandigheden het aantal en de activiteit van osteoclasten wordt geregeld door receptor activator van nucleaire factor κ B-ligand (RANKL), die wordt geproduceerd door osteoblasten. Osteoprotegerine (OPG), is een decoy receptor voor RANKL ook geproduceerd door osteoblasten 3 In vivo diermodellen dat de systemische overexpressie van sRANKL, of verwijdering van OPG betrokken zijn zeer waardevol bij osteoporose onderzoek.; Deze werkwijzen vereisen het genereren van transgene muizen 4,5. Hier, een nieuw alternatiefWerkwijze overexpressie sRANKL voor de studie van spier-gerelateerde stoornissen beschreven. Specifiek minicircle (MC)-DNA-technologie en hydrodynamische levering methoden werden gebruikt om genoverdracht van sRANKL in vivo te bereiken en overexpressie muis sRANKL systemisch 6.

Deze methode is ook een aanvulling op andere in vivo modellen van osteoporose, zoals hormonale modulatie van osteoclasten na ovariëctomie 7 en dieetinterventie door laag-calcium dieet 8. Deze modellen zijn zeer nuttig om de verschillende aspecten van het bewegingsapparaat gerelateerde stoornissen maar ze chirurgische procedures vereisen en kan tot enkele maanden, tegen aanzienlijke kosten 9 bestuderen. Ovariëctomie (OVX) knaagdier model is een proefdiermodel waar verwijdering van de eierstokken leidt tot een tekort aan oestrogeen waardoor de menselijke postmenopauzale osteoporose 10 nabootsen. Human postmenopauzale osteoporose, een aandoening waarbij oestrogeen Deficirantie leidt tot een verhoogd risico op botbreuken en osteoporose treft ongeveer acht miljoen vrouwen in de Verenigde Staten alleen. Hoewel de OVX model is handig voor postmenopauzale osteoporose biedt beperkte voordelen in het bestuderen van osteoporose in het algemeen. Oestrogeen onderdrukt botverlies, door het induceren van osteoclasten en osteoblasten remmen apoptose, derhalve in zijn afwezigheid een verhoogde activiteit van de osteoclasten wordt waargenomen 10-12. Een RANKL-OPG-ratio onbalans die botresorptie gunsten is ook waargenomen 13. Echter oestrogeendeficiëntie in vivo ook gepaard met verlaagde transformerende groeifactor β (TGF β), verhoogde interleukine-7 (IL-7) en TNF, IL-1 en IL-6 14,15. Aangezien deze cytokinen bekend botremodellering modulerende functies onafhankelijk van de RANKL-route, is het onmogelijk om eventuele osteoclast activering kenmerk uitsluitend de RANKL RANK-as. De in dit document beschreven model stelt onderzoekers in staat om te studeren in vivo RANKL-RANK as in osteoclastogenese en botverlies zonder pro-inflammatoire cytokines in vergelijking met OVX knaagdier modellen.

Bovendien, in vitro osteoclastogenese technieken zijn essentiële instrumenten om osteoclasten activering studeren voor potentiële therapeutische behandelingen van musculoskeletale aandoeningen. Eerdere studies hebben ook aangetoond dat het kweken van muizen beenmerg afgeleide macrofagen (BMMs), muis-macrofaag kolonie stimulerende factor (M-CSF) en muis sRANKL kan leiden tot differentiatie van osteoclasten 3,16,17. Hier, de protocollen meerkernige osteoclast-achtige cellen uit muizen beenmerg en uit humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) in vitro 18 genereren beschreven. Het celgebaseerde proeven vereist een volwassen terminaal gedifferentieerd en volledig functionele osteoclasten bepalen worden ook kort beschreven. Deze in vitro technieken aanvulling op de roman in vivo benadering en samen dienen als powerful onderzoeksinstrumenten om de differentiatie van osteoclasten en activering te bestuderen. Met deze systemen kunnen wetenschappers osteoclasten in vivo en in vitro genereren en bepalen de prikkels en signalen nodig zijn voor de proliferatie en activering en test de effectiviteit van farmacologische en biologische remmers.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Hydrodynamische Levering van sRANKL MC DNA

  1. Hydrodynamische Levering via Muisstaartje Vein
    1. Weeg de muis voordat de staart ader injectie. Verdun sRANKL of groen fluorescerend eiwit (GFP) MC in Ringer's oplossing (voorverwarmen bij 37 ° C) in een totaal volume van ~ 10% van de muis lichaamsgewicht.
    2. Warm de muis in een kooi voor 10 minuten voorafgaand aan de injectie om de bloedvaten verwijden en maak zijnerven (GW) zichtbaar. Bewaak de muis zorgvuldig om uitdroging en hyperthermie te voorkomen.
    3. Zodra de LVs zijn verwijde en zichtbaar, de overdracht van de muis om de restrainer en steek de stekker ver genoeg in het vat om beweging te beperken. Monitor de muis voor normale activiteit zoals ademhaling. Pas de stekker van restrainer indien nodig.
    4. Ontsmet de injectieplaats 3/4 van de punt van de staart met een alcoholdoekje. Gebruik een 27-30 G naald voor muis staartaderinjectie. Houd de staart stevig met een hand en steek de naald inde staartader. Oefen druk uit op de spuit en vul de injectie binnen 5-7 sec.
    5. Haal de naald uit de staart ader en druk uit te oefenen met een watje op de injectieplaats te stoppen met bloeden. Monitor de muis voor 15-30 minuten, breng de muis terug naar vivarium zodra de ademhaling tarief wordt verlaagd tot het normale tarief.
  2. Bevestiging van Systemische Muis sRANKL Expressie en kwantificering van Muis Serum TRACP5b bericht Gene Transfer
    1. Warm de muis in een kooi gedurende 5-10 minuten om de bloedvaten verwijden en maak LVs zichtbaar. Bewaak de muis zorgvuldig om uitdroging en hyperthermie te voorkomen.
    2. Maak een kleine incisie met een mes aan de staart van de muis op een site een kwart van de punt van de staart.
    3. Verzamel ongeveer 100 pi bloed serum verdeelbuizen.
    4. Incubeer serumafscheiding buizen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
    5. Centrifugeer de monsters bij 10.000 xg gedurende 5 minuten en verzamel het serum. Store serum -80 ° C voor verdere analyse.
    6. Voer sRANKL ELISA en muisserum TRACP5b test op serum monsters met behulp van een commercieel verkrijgbare kit.

2. In vitro Osteoclast Generatie van Mouse BMMs

  1. Isolatie en kweken van BMMs
    1. Isolatie van het scheenbeen en het dijbeen botten: Euthanaseren de donor muis met CO 2, en desinfecteer de benen met 70% ethanol. Ontleden van het schaambeen naar de calcaneus bot, aan het bovenbeen en onderbeen botten intact te verwijderen.
    2. Verwijder de huid en spieren voorzichtig zonder beschadiging van het bot. Plaats verwerkt femur en tibia in een petrischaal met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
    3. Verwijdering van het beenmerg: Snij het puntje aan de ene kant van het bovenbeen en onderbeen botten en spoel het beenmerg in een 50 ml buis met behulp van een 1 ml spuit met een 25 G naald, geladen met α-MEM bevattende 1% penicilline / streptomycine (Osteoclast Cultuur Medium / OCM).
    4. Proces beenmerg: Meng en breng beenmerg schorsing om een ​​nieuwe 50 ml tube door het door een 70 um nylon cel zeef. Centrifugeer de cellen op 300 xg en opnieuw te schorten in α-MEM dat 1% penicilline / streptomycine en 10% FBS (Osteoclast Cultuur medium / OCM (+)).
  2. Cultuur van macrofagen
    1. Tellen cellen met behulp van een hemocytometer of automatische cel teller.
    2. Plaat 1 x 10 6 cellen per putje van een 6-well plaat of 3 x 10 5 cellen op glazen dekglaasjes (5 mm) of dentineplakjes geplaatst in 96-well plaat en incubeer bij 37 ° C.
    3. Zuig alle media met niet-hechtende cellen en incubeer cellen bij 37 ° C met verse OCM (+) met 25 ng / ml muis M-CSF gedurende 48 uur.
    4. Zuig alle media en incubeer cellen bij 37 ° C met verse OCM (+) medium dat 25 ng / ml muis M-CSF en 30 ng / ml muis sRANKL osteoclastogenese te initiëren. Vullen media om de 3 dagen, zoals vereist.
    5. Groeien cellenongeveer 6-8 dagen tot reusachtige multinucleaire cellen kunnen resorbeerbare botvorming. Zodra meerkernige cellen blijken, voeren TRAP (tartraat resistente zure fosfatase) kleuring met behulp van een commercieel verkrijgbare kit, en wanneer deze volledig gerijpt, voert functionele testen. Visualiseer F-actine ringen op coverslips gebruik phalloidin vlek en het imago van de cellen die aan plakjes dentine door scanning elektronenmicroscopie (SEM), zoals eerder 19 beschreven.

3. In vitro osteoclasten Generatie van Human PBMC

  1. Isolatie van menselijke PBMC
    1. Voeg 10 ml van de voorverwarmde Histopaque-1077 in een 50 ml buis.
    2. Lege leukocyten filter verkregen uit bloedbank met steriele PBS in een 50 ml buis (1:1 verhouding van bloed met PBS). Het verdunde bloed over de histopaque oplossing heel langzaam in lagen, om ervoor te zorgen dat het bloed niet mengen met de Histopaque.
    3. Centrifugeer monsters bij 1000 xg gedurende 20 minuten bij 18 ° C. Volgening centrifugatie voorzichtig isoleren witte buffy coat laag die de witte bloedcellen en naar een nieuwe buis van 50 ml.
    4. Verdun cellen met PBS en centrifugeer opnieuw bij 650 xg gedurende 5 minuten om de cellen te verzamelen.
    5. Verwijder supernatant en resuspendeer cellen in OCM (-) media en tel cellen met behulp van cel teller.
  2. Plating en kweken van PBMCs
    1. Resuspendeer de cellen in OCM (+) media en plaat 8 x 10 6 cellen / ml per putje in een 6-well plaat of 1 x 10 6 cellen / ml per putje in 96-well plaat. Plaat cellen op dekglaasjes (5 mm) overeenkomstig immunofluorescentie beeldvorming en op botplakjes voor botresorptie assays zoals eerder beschreven 20.
    2. Verandering kweekmedia, aanvulling van de cellen met humaan M-CSF elke 2-3 dagen of zoals vereist. Ga dan naar differentiatie stap op dag 5 door toevoeging van 30 ng / ml humaan sRANKL samen met 25 ng / ml humaan M-CSF in OCM (+) media om osteoclastogenes initiërenis.
    3. Kweek cellen ongeveer 14 tot 21 dagen tot reusachtige multinucleaire cellen vormen. Zodra meerkernige cellen blijken, kunnen deze cellen vervolgens gelabeld voor TRAP, en wanneer volledig gerijpt, kunnen functionele testen worden uitgevoerd. F-actine ringen kunnen worden gevisualiseerd op dekglaasjes met phalloidin vlek. De morfologie van de cel kan worden onderzocht in cellen bevestigd aan plakjes dentine met SEM.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hier wordt een nieuwe genoverdracht techniek voor differentiatie van osteoclasten in vivo en celkweek protocollen voor differentiëren voorlopercellen in osteoclasten in vitro als methode om de effecten van cytokines op osteoclastogenese studie beschreven. In figuur 1 zijn de representatieve resultaten van succesvolle genoverdracht van GFP en muis sRANKL MC bij muizen weergegeven. In figuur 2 zijn de representatieve beelden van muizen beenmerg of humane PBMC celdifferen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Musculoskeletale aandoeningen zijn belangrijkste oorzaken van morbiditeit en invaliditeit en zijn samengesteld uit meer dan 150 ziekten en syndromen; die ongeveer 90 miljoen Amerikanen vandaag. Gewrichtsontsteking en botafbraak zijn overheersende kenmerken van musculoskeletale aandoeningen, met inbegrip van artritis en osteoporose. Osteoporose is een aandoening die bot integriteit verzwakt, wat vaak leidt tot breuken van het bot. Artritis is een chronische, invaliderende ziekte die wordt gekenmerkt door een ontsteking v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Het onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door NIH-onderzoekssubsidies R01 AR062173 en SHC 250862 aan IEA. ES is de ontvanger van NIH T32 CTSC-predoctorale beurs.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
alpha-MEMLife Technologies 12561-056
Human M-CSFMiltenyi Biotec130-096-492
Mouse M-CSFMiltenyi Biotec130-094-643
Human RANK-Ligand - solubleMiltenyi Biotec130-094-631
Mouse RANK-Ligand - solubleMiltenyi Biotec130-094-076
Tailveiner Restrainer for miceBraintreeTV-150 STD
Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit R&D systemsMTR00
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) KitSigma387A
MouseTRAP assay immunodiagnostic systemsSB-TR103

Referenties

  1. Yelin, E. Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline. The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).
  2. Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T. The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone disease. European journal of clinical investigation. 42, 1332-1341 (2012).
  3. Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
  4. Mizuno, A., et al. Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (sODF) exhibit severe osteoporosis. Journal of bone and mineral metabolism. 20, 337-344 (2002).
  5. Bucay, N., et al. osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification. Gene., & development. 12, 1260-1268 (1998).
  6. Suda, T., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 2063-2069 (2007).
  7. Wronski, T. J., Dann, L. M., Scott, K. S., Cintron, M. Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton. Calcified tissue international. 45, 360-366 (1989).
  8. Seto, H., Aoki, K., Kasugai, S., Ohya, K. Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats. Bone. 25, 687-695 (1999).
  9. Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comparative medicine. 58, 424-430 (2008).
  10. Sherman, B. M., West, J. H., Korenman, S. G. The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol, and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women. The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 42, 629-636 (1976).
  11. Hughes, D. E., et al. Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta. Nature medicine. 2, 1132-1136 (1996).
  12. Kousteni, S., et al. Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity. Cell. 104, 719-730 (2001).
  13. Ominsky, M. S., et al. RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 23, 672-682 (2008).
  14. Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., Pacifici, R. Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice. The Journal of clinical investigation. 94, 2397-2406 (1994).
  15. Weitzmann, M. N., Pacifici, R. Estrogen deficiency and bone loss: an inflammatory tale. The Journal of clinical investigation. 116, 1186-1194 (2006).
  16. Suda, T., Nakamura, I., Jimi, E., Takahashi, N. Regulation of osteoclast function. J Bone Miner Res. 12, 869-879 (1997).
  17. Asagiri, M., Takayanagi, H. The molecular understanding of osteoclast differentiation. Bone. 40, 251-264 (2007).
  18. Matsuzaki, K., et al. Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures. Biochemical and biophysical research communications. 246, 199-204 (1998).
  19. Adamopoulos, I. E., et al. Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption. The Journal of pathology. 208, 35-43 (2006).
  20. Adamopoulos, I. E., et al. Interleukin-17A upregulates receptor activator of NF-kappaB on osteoclast precursors. Arthritis researc., & therapy. 12, (2010).
  21. Jones, D., Glimcher, L. H., Aliprantis, A. O. Osteoimmunology at the nexus of arthritis, osteoporosis, cancer, and infection. J Clin Invest. 121, 2534-2542 (2011).
  22. Sato, K., Takayanagi, H. Osteoclasts, rheumatoid arthritis, and osteoimmunology. Curr Opin Rheumatol. 18, 419-426 (2006).
  23. Das, S., Crockett, J. C. Osteoporosis - a current view of pharmacological prevention and treatment. Drug design, development and therapy. 7, 435-448 (2013).
  24. Chen, Z. Y., He, C. Y., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 8, 495-500 (2003).
  25. Kay, M. A., He, C. Y., Chen, Z. Y. A robust system for production of minicircle DNA vectors. Nature biotechnology. 28, 1287-1289 (2010).
  26. Chen, Z. Y., He, C. Y., Kay, M. A. Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo. Human gene therapy. 16, 126-131 (2005).
  27. Halleen, J. M., et al. Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 15, 1337-1345 (2000).
  28. Adamopoulos, I. E., et al. IL-23 is critical for induction of arthritis, osteoclast formation, and maintenance of bone mass. J Immunol. 187, 951-959 (2011).
  29. Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. Modulation of osteoclast differentiation. Endocrine reviews. 13, 66-80 (1992).
  30. Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123, 2600-2602 (1988).
  31. Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
  32. Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. The Journal of experimental medicine. 190, 1741-1754 (1999).
  33. Fuller, K., et al. Macrophage colony-stimulating factor stimulates survival and chemotactic behavior in isolated osteoclasts. The Journal of experimental medicin. 178, 1733-1744 (1993).
  34. Edwards, J. R., Mundy, G. R. Advances in osteoclast biology: old findings and new insights from mouse models. Nature reviews. Rheumatology. 7, 235-243 (2011).
  35. Weinstein, R. S., et al. Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids. The Journal of clinical investigation. 109, 1041-1048 (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Osteoclastdifferentiatiehydrodynamische genoverdrachtin vivo osteoclastmodelin vitro generatie van osteoclastenbeenmergsmacrofagenhumane PBMC-osteoclastenRank-ligand mini-circleMCSF-suppletieTrap-positieve cellenvorming van F-actine-ringen
A Novel In vivo Gene Transfer Techniek en In vitro Cel-gebaseerde testen voor de studie van botverlies bij musculoskeletale aandoeningen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.