Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Verbeterde Northern Blot detectie van kleine RNA Species in Drosophila melanogaster

22.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51814

⸱

21 augustus 2014

 , 
1Département de Génomique Fonctionnelle et Cancer, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, 2Center for Life NanoScience, Istituto Italiano di Tecnologia

In dit artikel

Samenvatting

Het doel van deze publicatie is om te visualiseren en te discussiëren over de operatieve stappen van een Enhanced Northern Blot protocol op RNA geëxtraheerd uit Drosophila melanogaster embryo's, cellen en weefsels. Dit protocol is bijzonder bruikbaar voor de efficiënte detectie van kleine RNA species.

Samenvatting

De laatste decennia hebben de explosie van wetenschappelijke belangstelling rond genexpressie controlemechanismen op het RNA-niveau meegemaakt. Deze tak van de moleculaire biologie is sterk aangewakkerd door de ontdekking van niet-coderende RNA's als belangrijke spelers in het post-transcriptionele regulatie. Zo'n revolutionair perspectief is gepaard gegaan en veroorzaakt door de ontwikkeling van krachtige technologieën voor het profileren van korte RNA expressie, zowel op de high-throughput niveau (genoom-brede identificatie) of als single-kandidaat-analyse (steady state accumulatie van specifieke soorten). Hoewel verschillende state-of-art strategieën zijn momenteel beschikbaar voor het doseren of het visualiseren van een dergelijke vlucht voor moleculen, Northern Blot test blijft de in aanmerking komende aanpak in de moleculaire biologie voor de onmiddellijke en nauwkeurige evaluatie van RNA-expressie. Het is een eerste stap naar de toepassing van meer geavanceerde, dure technologieën en in veel gevallen blijft preferentiële werkwijze gemakkelijk inzichtenin RNA biologie. Hier het overzicht hebben we een efficiënt protocol (Enhanced Northern Blot) voor het detecteren zwak uitgedrukt microRNAs (of andere kleine regulerende RNA-soorten) van Drosophila melanogaster hele embryo's, handmatig ontleed larvale / volwassen weefsels of in vitro gekweekte cellen. Een zeer beperkte hoeveelheid RNA is vereist en het gebruik van materiaal van flowcytometrie-geïsoleerde cellen kunnen ook overwogen.

Inleiding

RNA biochemie heeft spectaculaire vooruitgang ervaren in de afgelopen jaren 1. Ons begrip van RNA potentieel in de controle van genexpressie werd barsten van het identificatienummer van krachtige noncoding ribo-regulatoren 2, door de ontdekking van nieuwe RNA gebaseerde regulerende mechanismen 3,4 en een diepere karakterisering van reeds bekende post-transcriptionele gebeurtenissen 5. Alles bij elkaar deze studies hebben toegestaan ​​RNA biologie drastisch maken de scène, steeds in de huidige wetenschappelijke landschap een belangrijk onderwerp van onderzoek. Met name de laatste jaren krijgen we een gevoel van de doordringende invloed van de 'RNA-wereld "op moleculaire neurobiologie 6, een van de meest dynamische onderzoeksgebieden in de moderne life science. In het laatste decennium van de vorige eeuw, heeft de algemene wetenschappelijke scenario is een revolutie door de ontdekking van de RNA-interferentie 7,8 en van de kleine regulerende RNA's 9,10met bijzondere aandacht voor microRNAs 11, endogeen tot expressie kleine niet-coderende RNA's betrokken bij de controle van bijna alle cellulaire functies als pleiotropische en combinatorische regulatoren van genexpressie.

Bijna 10 jaar na miRNA eerste ontdekking in Caenorhabditis elegans door Ambros en Ruvkun's laboratoria, werd hernieuwd aandacht gericht op het veld bij hoge aantallen van miRNAs werden geïdentificeerd in Drosophila en in menselijke cellen en 12-15. Sindsdien, dankzij de veelzijdige transgene benaderingen, Drosophila melanogaster heeft opviel als een waardevolle biologische context te verdiepen in miRNA biosynthese en activiteit. Drosophila miRNAs hebben verschillende functies onthuld in insect-specifieke of evolutionair geconserveerd processen, variërend van veroudering om de stofwisseling, signaalwegen , gedrag en natuurlijk, neurogenese. Langs deze richting, hebben we onlangs een nieuwe koppeling 16 in de intrigerende co onthuldrrelation optreden tussen de master-gen GCM / glijden en de RNA-pad. De fly transcriptiefactor Gcm / Glide 17-19 vormt een uniek voorbeeld van lot van de cel determinant, die dicteert de gliale versus neuronale lot keuze in multipotente vliegen neurale voorlopers 20. Twintig jaar lang onderzoek naar dit onderwerp is duidelijk onderstreept het optreden van meerdere en overlappende ingangen van genexpressie regulatie convergerende dan GCM / glijden 21-28 aan de drempelwaarden die nodig zijn voor het balanceren van de delicate verhouding tussen neuronale en gliale tegenhangers tijdens neurale ontwikkeling vast te stellen.

We ontdekten dat regulering via DMEL-miR279 targeting is een verdere controle niveau bij te dragen tot post-transcriptionele fine-tuning van GCM / glijden meningsuiting 16. Wereldwijd zijn deze onderzoekslijnen vereist specifieke methodologische verbeteringen: langs jaren hebben verschillende technologieën oorspronkelijk ontwikkeld om trad analyserennele RNA's zijn omgebouwd voor het kwantificeren van kleine niet-coderende RNA's, zoals zoals RNAse bescherming assays, cDNA arrays 29-31, real-time PCR methoden 32-35 en sequentiebepaling van 36,37. Aan de andere kant, heeft herijking van technische benaderingen voortdurende vooruitgang bevorderd in het veld.

Northern Blot assay (NB, of RNA gel blotbepaling) vormt een representatief voorbeeld: het wordt grotendeels gebruikt om RNA accumulatie profileren, omdat zij garant staat voor expressie kwantificatie evenals grootte bepalen. De intrinsieke lage sensitiviteit van de werkwijze wordt beperkt wanneer het moet worden toegepast op lage overvloedige genexpressie fijnstemmers, zoals korte RNA's. Een nadelig gevolg is het vereiste van grote hoeveelheden totaal RNA, die moeilijk zijn toepassing op specifieke biologische monsters maakt. Om bovenstaande redenen is specifiek NB varianten voor kleine RNA-detectie zijn ontwikkeld 38-40: we hebben geprofiteerd van een verbeterde NB procedure 41 (ENB, Enhanced Northern Blot), terwijl het ophelderen van de bovengenoemde wisselwerking tussen DMEL-miR279 en GCM / glide.

Deze werkwijze berust op een chemische verknopende stap gebaseerd op de activiteit van een carbodiimide derivaat [1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC] nucleïnezuur bevestigen op vaste dragers. Carbodiimide is een veelzijdige verknoper waarover de vorming van amidebindingen tussen geactiveerde carboxyl of fosfaatgroepen en aminegroepen 42 katalyseren. Deze eigenschap kan worden benut om covalent paar kleine RNAs via hun mono-gefosforyleerde 5'-hydroxylgroep aminogroepen aan het oppervlak van nylon membranen. De resulterende configuratie onderdeel vergroot de toegankelijkheid van het geïmmobiliseerde nucleïnezuur en op zijn beurt de efficiëntie van probe-doel hybridisatie, wat resulteert in opmerkelijke detectieverfijning 43.

De techniek gaat ervan bijzonder relevance in Drosophila moleculaire studies, waarbij het ​​optreden van nieuwe en onderscheidende klassen van kleine niet-coderende RNA's is in opkomst 44. Hiervan rasiRNAs 45,46 vormen een specifiek subtype van piwi interactie RNAs (piRNAs 47) betrokken bij sequentie-specifieke gen-silencing. Operative details van deze werkwijze zijn volledig beschreven en gevisualiseerd hierna opzichte van de analyse van de microRNA DMEL-miR279 en DMEL-miR286 en, voor het eerst van een rasiRNA, rasi4. We geduwd deze werkwijze, die ons toegelaten onthullen slecht uitgedrukt doelen van minimale hoeveelheden RNA (minder dan 1 ug) uitersten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1 Sample Collection

  1. Los semi-adherente Schneider 2 cellen (1-5 x 10 6 cellen gemiddeld), door pipetteren en oogsten ze door centrifugeren (100 g gedurende 1 min). In het geval van in vitro gekweekte hechtende cellen, trypsinize ze in normale omstandigheden of direct te verzamelen van platen in een geschikte hoeveelheid RNA extractie reagens, met behulp van een cel schraper.
  2. Voor het embryo, groeien Drosophila stammen in fly kooien en laat embryo's zich ophopen op eierleggende platen. Veeg embryo's uit door een penseel in gedestilleerd water (dH 2 O), gooi afval door zeef filteren, spoelen en embryo's terug te krijgen in een flacon 48.
  3. Als een alternatieve techniek, handmatig ontleden weefsels / organen. Isoleer testes (een preferentiële Pirna analyse) van Drosophila buik in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) onder een stereomicroscoop (vergroting 20X), met dissectie naalden of forceps zoals visualized in Sullivan et al 49.
  4. Stamper homogeniseren monsters op verslaving van 0,5 volumes van RNA-extractie reagens.

2 RNA-extractie / Analyse

  1. Instructies van onderstaande fabrikant 'presteren RNA isolatie via commerciële reagentia. LET OP! RNA-extractie agenten zijn meestal giftig en bijtend. Ook verzoeken een Proteinase K-gebaseerd protocol voor RNA isolatie 50, als volgt:
    1. Verdunnen monsters in 400 ul van Stop Mix en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
    2. Recover wateroplosbare componenten door standaard fenol: chloroform: isoamylalcohol en chloroformextracties en door ethanol (EtOH) neerslag / wassen. Lucht drogen van de monsters en mengen in diethylpyrocarbonaat (DEPC) behandelde dubbel gedistilleerd (dd) H 2 O.
  2. Beoordelen RNA concentratie door UV spectrofotometrische meting. Zorg er ook voor de RNA zuiverheid is hoog, dicht bij 2.0, based op A260 / A280 lezen.
  3. Controleer RNA preparaat denaturerende agarose gel als volgt:
    1. In een schone beker, los 1,2 g agarose in 82 ml DEPC DDH 2 O, onder voortdurend roeren. Kook totdat het volledig is opgelost.
    2. Laat de gel oplossing afkoelen; wanneer de temperatuur bereikt van 60 ° C toe te voegen 10 ml 10X 4-morfolinepropaansulfonzuur (MOPS) bufferen tot 1X uiteindelijke concentratie (FC) en 8 ml van 37% formaldehyde tot 3% FC. LET OP! Formaldehyde is een kankerverwekkende stof.
    3. Giet de gel in een horizontale elektroforese cel. Laat de gel stollen in een zuurkast gedurende ten minste 1 uur. Na het stollen, dompel de gel in MOPS 1X.
    4. Aliquot 2 ug van RNA monster en 1 ug van Ladder (gebruik een RNA-marker bij nauwkeurige evaluatie gewenst is). Voeg 3 delen agarose ladingskleurstof (ALD) RNA en Ladder. Verhit bij 70 ° C gedurende 5 minuten en onmiddellijk afkoelen op ijs. CAUTION! Inhoud van ALD (ethidiumbromide en formamide, zie ook Materiaal) zijn ingedeeld en corrosief, respectievelijk.
    5. Laad de monsters en laat de gel bij 50 V voor ongeveer 1 uur met af en toe een buffer recycling. Controleer de RNA fractionering patroon door UV-visualisatie of gel beeldvorming. Herkennen discrete banden die overeenkomen met 28S en 18S rRNA's en tRNA (zie figuur 1).
  4. Ga verder naar de Noordelijke Assay of winkel RNA bij -80 ° C.

3 Denaturing acrylamidegel Voorbereiding

  1. Gebruik een kleine verticale elektroforetische apparaten voor deze fractionering stap (plaat afmeting ongeveer 8 cm x 9 cm, kam dikte 0,75 mm).
  2. Monteer schone glazen samen in een casting frame.
  3. Bereid 10 ml van 10% acrylamide / bis-acrylamide (19 1) opgelost in 1X MOPS, 7 M ureum. Onmiddellijk voor gieten, voeg 100 pl 10% ammoniumpersulfaat en 10 ui TEMED en de oplossing snel mengen. VOORZICHTIG! Acrylamide is neurotoxisch en kankerverwekkend is.
  4. Giet de gel tussen de glasplaten en steek het goed kam voorzichtig om luchtbellen te vermijden. Laat de gel polymeriseren bij kamertemperatuur gedurende ten minste 45 minuten voor gebruik. Of bewaar de gel O / N, verpakt in water doordrenkte papieren filters en verzegeld in Saran Wrap.

4 Monstervoorbereiding

  1. Aliquot 0,5-20 ug totaal RNA voor elk monster. Als het volume groter is dan 3-4 pi, vacuüm drogen van het monster.
  2. Voor de grootte bepalen, lopen een hoeveelheid (20-30 CPS) van radioactief gemerkt lage bereik ladder parallel aan monsters, als een marker (zie rubriek 4.3 en 4.4 voor de bereiding). Behandel het parallel monsters, zoals beschreven in stap 4.5.
  3. Ladder: het opzetten van een fosfaat vooruit reactie met 0,1 ug van een 10 bp-laddertje. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten en stop de reactie door toevoeging van ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) aan 20 mM FC.
  4. Zuiver door EtOH precipitatie / wassen, drogen aan de lucht enmengen in DDH 2 O (ongeveer 100 pl). LET OP! 32 P is een radioactieve bron.
  5. Voor elk monster een gelijk volume van acrylamide blauwe kleurstof (ABD) toe. Denatureren door verhitting bij 80 ° C gedurende 5 minuten en koel op ijs tot het laden. LET OP! Formamide (gehalte in ABD) is corrosief.

5 Elektroforetisch Fractionering

  1. Verwijder de glasplaten van de casting ondersteuning en goed monteer ze in de elektroforese cel. Vul beide binnenste en buitenste kamer met voldoende lopende buffer (RB).
  2. Verwijder voorzichtig de kam en pre-run de gel bij 200 V gedurende 10 minuten. Voor het laden van monsters, afwassen ureum afzettingen van de putten door spuiten sommige RB door middel van een injectiespuit.
  3. Gebruik platte tips zorgvuldig stratify monsters uit stap 4.5 op de bodem van elk putje. Bekijk de anode en kathode verbindingen met omgekeerde running voorkomen. Nadat de monsters Voer de gel bij 100 V gedurende 5 min, increase de spanning tot 200 V.
  4. Voor een fractionering lengte van ongeveer 7 cm, een 45 min-lange termijn voldoende is. Vermijd broomfenolblauw (tracking pigment in ABD) om de gel overstromen.
  5. Zichtbaar op de gel gefractioneerd lange RNAs door ethidiumbromide (EtBr) kleuring, als facultatieve stap:
    1. Knip 2 cm van de bovenkant van de gel en de spoel kort segment in DDH 2 O.
    2. Incubeer de gel slice bij KT 15 minuten onder zacht shacking in RB, EtBr 0,5 ug / ml FC.
    3. Destain de gel gedurende 15 minuten in RB, visualiseren lange rRNA door UV-bestraling of gel beeldvorming. Controleer RNA laden en kwaliteit (zie Figuur 1, paneel 7). LET ethidiumbromide mutageen.
  6. Ondertussen gaat blotting het onderste gedeelte van de gel met kleine RNA species.

6 Gel Blotting

  1. Snijd 6 stukjes vloeipapier aan de blotting omgeving passen en een equivalent stuk te ontladend nylon membraan. Bevochtig vellen papier, membraan en 2 onderleggers in RB. Zorg ervoor dat u volledig genieten van de pads door hen herhaaldelijk knijpen in RB.
  2. Verwijder de gel uit het apparaat en de bril openen door gemiddelde van een spatel. Gebruik een schoon mes om de putten te verwijderen. Leg een vel nat Whatman papier op de gel en til het op.
  3. Plaats het nylon membraan op het vrije oppervlak van de gel. Markeer een hoek om het filter te oriënteren volgens monster laden. Voltooi de "sandwich" (3 papieren stukken aan elke zijde). Rol een plastic staaf op het oppervlak blot, om eventuele luchtbellen te verwijderen.
  4. Leg de vlek tussen twee onderleggers en vervolgens in de blotting cassette. Monteer de cassette in de blotting module, vult de kamer met RB en controleren op de juiste richting (nylon membraan moet blijven tussen de gel en de positieve eindpunt).
  5. Transfer bij 20 V gedurende 20 minuten. Opmerking: om ervoor te zorgen homogene omstandigheden, na 10 min de blotting module en r openenraaien de sandwich van 180 ° voor het voltooien van de overdracht.

7 Membraan Crosslinking

  1. Bereid 6 ml vers Crosslinking Solution (XLS). Verzadigen een 10 cm x 10 cm (groter dan nylonmembraan) stukje vloeipapier met XLS. VOORZICHTIG! HCl (een onderdeel van XLS) is zeer corrosief.
  2. Ontmantelen van de vlek en leg het membraan op de natte 3MM filterpapier. Opmerking: RNA niet in direct contact met de verzadigde papieren. Plaats het filter en het papier tussen twee glasplaten en wikkel in Saran-wrap.
  3. Verwarm het membraan bij 60 ° C gedurende 2 uur, gevolgd door een DDH 2 O wassen. Bewaren bij -20 ° C of overgaan tot hybridisatie.

8 Membraan Prehybridisatie

  1. Als RNA laden is gecontroleerd (optionele stap 5.5), direct overgaan tot hybridisatie. Of anders, opengewerkt 1 cm van de top van het nylon filter met probe cross-hybridizatio voorkomenns aan gefractioneerde lange RNA's.
  2. Verwarm 10 ml hybridisatieoplossing (HS) bij 37 ° C. Denatureren 1 mg van de Zalm van het sperma bij 95 ° C gedurende 5 minuten, koel op ijs en voeg aan GS.
  3. Incubeer de filter HS bij 37 ° C gedurende ten minste 1 uur onder rotatie in een hybridisatie oven. Controleer of de RNA-zijde van het filter gezichten HS.

9 Probe Synthese

  1. Stel een fosfaatgroep uit reactie op 10 pmol van specifieke antisense oligonucleotide, zoals beschreven in 4.3.
  2. Voeg 5 volumes Tris-EDTA-NaCl (TEN) buffer aan de reactie en zuivering van het gemerkte primer opgenomen nucleotiden door gelexclusiechromatografie over Sephadex G-25 kolommen (of ook door EtOH precipitatie). Probe-activiteit kan worden beoordeeld door vloeistofscintillatieteller.

10 Membraan hybridisatie

  1. Vervang uitgeput HS met een verse 10 ml aliquot (bereid en aangevuld zoals boven beschreven). Verwarm de sonde op95 ° C gedurende 10 min, koel op ijs en toevoegen van nieuwe HS. Incubeer het filter bij 37 ° C ON.

11 Membraan Wassen

  1. Herstel de hybridisatie-oplossing en het op -20 ° C in een radioactiviteit afscherming box.
  2. Spoel het filter in Washing Buffer (WB) en was deze zorgvuldig gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
  3. Gebruik een Geiger Mueller Detector voor het controleren van de resterende radioactiviteit op de hoeken filter. Als achtergrond emissie is ongeveer 5 cps, overgaan tot expositie membraan.

12 Signal Detection

  1. Expose de filter op autoradiografie films of op moleculair imager scherm ON. Reveal signalen door fotografische verwerking of digitale omzetting.
  2. Analyseer de band intensiteit door toegewijde kwantificering software (ImageJ of Optiquant).

13 Membraan Strippen

  1. Voor primaire signalen te verwijderen, onderdompelen membraan in 500 ml kokend stripoplossingVervolgens incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut. Ga verder naar de roman (pre) hybridisatie of bewaar het filter bij -20 ° C.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Door het volgen van de in de tekst beschreven en schematisch weergegeven in figuur 1 algemeen procedure, onderzochten we kleine RNA expressie van complexe RNA-monsters van verschillende oorsprong. In het experiment weergegeven in figuur 1, werd RNA geïsoleerd uit Drosophila Schneider 2-cellen door Proteinase K extractie, gecontroleerd op integriteit (optionele stap: denaturerende agarose gel fractionering) en dubbel geladen. Een helft van de gel werd geblot op een membraan en n...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hoewel onze waardering voor de verfijnde verwevenheid waardoor RNA reguleert neurogenese neemt voortdurend toe, de mechanistische implicaties van RNA gebaseerde circuits beïnvloeden neurale stamcellen biologie, neuronale differentiatie / functionele integratie, ontwikkeling van neurale aandoeningen en kanker blijft onontgonnen. Het onderhoud van deze netwerken door koninkrijken maakt van de mogelijkheden van genetische systemen zoals Drosophila melanogaster instrumenteel om onontgonnen cellulaire routes, waarbi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale, giet het Centre National de la Recherche Scientifique, de Universite de Strasbourg, het Hôpital de Strasbourg, de Vereniging la Recherche sur le Cancer, het Institut National du Cancer, de Agence Nationale de la Recherche en de Elzas.

Pietro Laneve werd ondersteund door de Fondation pour la Recherche Medicale. Momenteel is hij een ontvanger van een Istituto Italiano Tecnologia (IIT) fellowship. Publicatiekosten worden ondersteund door de Neurex netwerk (TriNeuron - Programma Interreg IV Boven-Rijn)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
FINAL COMPOSITION/NAMECOMPANYCATALOGUE (Stock)COMMENTS
GENERAL REQUIREMENT
Centrifuge, 5418Eppendorf5418 000.017
Decontaminant, RNase AwaySigma-Aldrich83931Apply on glass/plasticware, wipe and rinse
RNase inhibitor, DEPCSigma-AldrichD5758Hazardous //// 1609-47-8
SAMPLE PREPARATION
Stereo Microscope, M60Leica 
1X PBS Buffer
137 mM NaClSigma-AldrichS30147647-14-5  
2.7 mM KClSigma-AldrichP95417447-40-7 
10 mM Na2HPO4Sigma-AldrichS32647558-79-4 
1.8 mM KH2PO4Sigma-AldrichP97917778-77-0 
RNA EXTRACTION/ANALYSIS
UV-Vis SpectrophotometerThermo ScientificNanodrop 2000
Gel Imager, ChemiDoc XRS+Biorad170-8265
Horizontal Electrophoresys, Mini-Sub Cell GTBioRad170-4487EDU
RNA extraction reagent, TRIzol ReagentLife Technologies15596026Hazardous
PCA (25:24:1), 1:1 for extractionSigma-Aldrich77617136112-00-0
Chlorophorm, 1:1 for extractionSigma-AldrichC243267-66-3  
EtOH, 2.5 vol. for precipitation, 70% for washingSigma-Aldrich5984464-17-5 
Gene Ruler 1Kb DNA LadderThermo ScientificSM0311
Stop Mix
300 mM NaOAc, pH 5.5Sigma-AldrichS2889127-09-3
1x RSB Solution
2% sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma-Aldrich71736Never cool down SDS to avoid  precipitation //// 151-21-3
2 mg/ml Proteinase KRoche Applied Science0-3115828001EC 3.4.21.64 9
10X Reticulocyte Standard Buffer (RSB)
100 mM Tris-Cl, pH 7.4Sigma-AldrichT59411185-53-1  
100 mM NaClSigma-AldrichS30147647-14-5  
30 mM MgCl2Sigma-AldrichM82667786-30-3
Denaturing Agarose Gel
1.2% AgaroseSigma-AldrichA9539Let the gel solidify for at least 1 hr //// 9012-36-2
10X MOPS Buffer
0.2 M MOPS sodium salt, pH 7Sigma-AldrichM9381Do not confuse MOPS sodium salt with MOPS //// 71119-22-7
Agarose Loading Dye
1x MOPS Buffer
3% formaldehydeSigma-AldrichF8775Hazardous //// 50-00-0
50% formamideSigma-Aldrich47670Hazardous //// 75-12-7
Ethidium bromide (EtBr) 30 μg/mlSigma-AldrichE1510Hazardous //// 1239-45-8
Bromophenol blue Sigma-AldrichB0126115-39-9 
SMALL RNA FRACTIONATION
Flat gel loading tipsLife TechnologiesLC1002
Savant SpeedVac ConcentratorThermo Scientific DNA120
Vertical Electrophoresis, Mini-PROTEAN Tetra Cell Biorad165-8000
Denaturing Acrylamide Gel
10% acrylamide/bis-acrylamide (19:1)Sigma-AldrichA3449Hazardous. Let the gel polymerize for 45 min before use
1x TBE Buffer (or 1x MOPS Buffer)
7 M ureaSigma-AldrichU650457-13-6
0.1% ammonium persulfateSigma-Aldrich2155897727-54-0 
0.1% TEMEDSigma-AldrichT9281110-18-9
Gene Ruler Ultra Low Range DNA Ladder (10 bp-step)Thermo ScientificSM1211Label 0.1 μg, as described in the "probe labeling" reaction
Acrylamide Blue Dye 
50% formamideSigma-Aldrich47670Hazardous //// 75-12-7
Bromophenol blueSigma-AldrichB0126115-39-9 
Running Buffer (RB)
1x MOPS Buffer 
Alternative RB: 1x TBE Buffer
1x TBE Buffer
5X TBE
445 mM Tris-baseSigma-AldrichT150377-86-1 
445 mM boric acidSigma-AldrichB790110043-35-3
20 mM EDTASigma-AldrichEDS60-00-4  
Gel Staining Solution
Ethidium bromide 0.5 μg/mlSigma-AldrichE1510Hazardous //// 1239-45-8
1x RBStain for 15 min with EtBr, destain for 15 min w/o EtBr

Referenties

  1. The RNA World. Gesteland, R. F., Cech, T. R., Atkins, J. F. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2006).
  2. Mercer, T. R., Dinger, M. E., Mattick, J. S. Long non-coding RNAs: insights into functions. Nat Rev Genet. 10, 155-159 (2009).
  3. Salmena, L., Poliseno, L., Tay, Y., Kats, L., Pandolfi, P. P. A ceRNA hypothesis: the Rosetta Stone of a hidden RNA language? Cell. 146, 353-358 (2011).
  4. Cesana, M., et al. A long noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA. Cell. 147, 358-369 (2011).
  5. Orphanides, G., Reinberg, D. A unified theory of gene expression. Cell. 108, 439-451 (2002).
  6. Mehler, M. F., Mattick, J. S. Noncoding RNAs and RNA editing in brain development, functional diversification, and neurological disease. Physiol Rev. 87, 799-823 (2007).
  7. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M., Kostas, S., Driver, S., Mello, C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  8. Hamilton, A., Baulcombe, D. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science. 286, 950-952 (1999).
  9. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. Elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75, (1993).
  10. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
  11. Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu Rev Biochem. 79, 351-379 (2010).
  12. Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408, 86-89 (2000).
  13. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Lendeckel, W., Tuschl, T. Identification of novel genes coding for small expressed RNAs. Science. 294, 853-858 (2001).
  14. Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294, 858-862 (2001).
  15. Lee, R. C., Ambros, V. An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans. Science. 294, 862-864 (2001).
  16. Laneve, P., et al. The Gcm/Glide molecular and cellular pathway: new actors and new lineages. Dev Biol. 375, 65-78 (2013).
  17. Hosoya, T., Takizawa, K., Nitta, K., Hotta, Y. Glial cells missing: a binary switch between neuronal and glial determination in Drosophila. Cell. 82, 1025-1036 (1995).
  18. Jones, B. W., Fetter, R. D., Tear, G., Goodman, C. S. Glial cells missing: a genetic switch that controls glial versus neuronal fate. Cell. 82, 1013-1023 (1995).
  19. Vincent, S., Vonesch, J. L., Giangrande, A. Glide directs glial fate commitment and cell fate switch between neurons and glia. Developement. 122, 131-139 (1996).
  20. Cattenoz, P. B., Giangrande, A. Lineage specification in the fly nervous system and evolutionary implications. Cell Cycle. 12, 2753-2759 (2013).
  21. Jones, B. W., Abeysekera, M., Galinska, J., Jolicoeur, E. M. Transcriptional control of glial and blood cell development in Drosophila: cis-regulatory elements of glial cells missing. Dev Biol. 266, 374-387 (2004).
  22. Ragone, G., et al. Transcriptional regulation of glial cell specification. Dev Biol. 255, 138-150 (2003).
  23. Akiyama-Oda, Y., Hosoya, T., Hotta, Y. Asymmetric cell division of thoracic neuroblast 6-4 to bifurcate glial and neuronal lineage in Drosophila. Development. 126, 1967-1974 (1999).
  24. Bernardoni, R., Kammerer, M., Vonesch, J. L., Giangrande, A. Gliogenesis depends on glide/gcm through asymmetric division of neuroglioblasts. Dev Biol. 216, 265-275 (1999).
  25. Ragone, G., Bernardoni, R., Giangrande, A. A novel mode of asymmetric division identifies the fly neuroglioblast 6-4T. Dev Biol. 235, 74-85 (2001).
  26. Soustelle, L., Roy, N., Ragone, G., Giangrande, A. Control of gcm RNA stability is necessary for proper glial cell fate acquisition. Mol Cell Neurosci. 37, 657-662 (2008).
  27. Akiyama, Y., Hosoya, T., Poole, A. M., Hotta, Y. The gcm-motif: a novel DNA-binding motif conserved in Drosophila and mammals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 25, 14912-14916 (1996).
  28. Miller, A. A., Bernardoni, R., Giangrande, A. Positive autoregulation of the glial promoting factor glide/gcm. EMBO J. 17, 6316-6326 (1998).
  29. Krichevsky, A. M., King, K. S., Donahue, C. P., Khrapko, K., Kosik, K. S. A microRNA array reveals extensive regulation of microRNAs during brain development. RNA. 9, 1274-1281 (2003).
  30. Liu, C. G., et al. An oligonucleotide microchip for genome-wide microRNA profiling in human and mouse tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 9740-9744 (2004).
  31. Yin, J. Q., Zhao, R. C., Morris, K. V. Profiling microRNA expression with microarrays. Trends Biotechnol. 26, 70-76 (2008).
  32. Schmittgen, T. D., Jiang, J., Liu, Q., Yang, L. A high-throughput method to monitor the expression of microRNA precursors. Nucleic Acids Res. 32, E43(2004).
  33. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).
  34. Shi, R., Chiang, V. L. Facile means for quantifying microRNA expression by real-time PCR. Biotechniques. 39, 519-525 (2005).
  35. Raymond, C. K., Roberts, B. S., Garrett-Engele, P., Lim, L. P., Johnson, J. M. Simple quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring of microRNAs and short-interfering RNAs. RNA. 11, 1737-1744 (2005).
  36. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
  37. Linsen, S. E., et al. Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling. Nat Methods. 6, 474-476 (2009).
  38. Valoczi, A., et al. Sensitive and specific detection of microRNAs by northern blot analysis using LNA-modified oligonucleotide probes. Nucleic Acids Res. 32, e175(2004).
  39. Varallyay, E., Burgyan, J., Havelda, Z. Detection of microRNAs by Northern blot analyses using LNA probes. Methods. 43, 140-145 (2007).
  40. Kim, S. W., et al. A sensitive non-radioactive northern blot method to detect small RNAs. Nucleic Acids Res. 38, e98(2010).
  41. Pall, G. S., Hamilton, A. J. Improved northern blot method for enhanced detection of small RNA. Nat Protoc. 3, 1077-1084 (2008).
  42. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , 2nd, Academic Press, Inc. (2008).
  43. Pall, G. S., Codony-Servat, C., Byrne, J., Ritchie, L., Hamilton, A. Carbodiimide-mediated cross-linking of RNA to nylon membranes improves the detection of siRNA, miRNA and piRNA by northern blot. Nucleic Acids Res. 35, e60(2007).
  44. Guzzardo, P. M., Muerdter, F., Hannon, G. J. The piRNA pathway in flies: highlights and future directions. Curr Opin Genet Dev. 23, 44-52 (2013).
  45. Aravin, A. A., et al. Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline. Curr. Biol. 11, 1017-1027 (2001).
  46. Vagin, V. V., et al. A distinct small RNA pathway silences selfish genetic elements in the germline. Science. 313, 320-324 (2006).
  47. Brennecke, J., et al. Discrete small RNA-generating loci as master regulators of transposon activity in Drosophila. Cell. 128, 1089-1103 (2007).
  48. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  49. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. J. Vis. Exp. (51), e2641(2011).
  50. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning : a laboratory manual. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  51. Alwine, J. C., Kemp, D. J., Stark, G. R. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridisation with DNA probes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74, 5350-5354 (1977).
  52. Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495, 384-388 (2013).
  53. Flores-Jasso, C. F., Salomon, W. E., Zamore, P. D. Rapid and specific purification of Argonaute-small RNA complexes from crude cell lysates. RNA. 19, 271-279 (2013).
  54. Specchia, V., et al. Hsp90 prevents phenotypic variation by suppressing the mutagenic activity of transposons. Nature. 463, 662-665 (2010).
  55. Várallyay, E., Burgyán, J., Havelda, Z. MicroRNA detection by northern blotting using locked nucleic acid probes. Nat Protoc. 3, 190-196 (2008).
  56. Koscianska, E., Starega-Roslan, J., Czubala, K., Krzyzosiak, W. J. High-resolution northern blot for a reliable analysis of microRNAs and their precursors. ScientificWorldJournal. 11, 102-117 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

RNA-detectieacrylamidegelelektroforeseRNA-extractieprobe-hybridisatieautoradiografische detectieRNA-isolatiegeltransfer
Verbeterde Northern Blot detectie van kleine RNA Species in Drosophila melanogaster
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.