Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Metabolomic Analyse van de hersenen van de rat door de hoge resolutie nucleaire magnetische resonantie spectroscopie van Tissue Extracten

14.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51829

⸱

21 september 2014

 ,  , 
1Centre de Résonance Magnétique Biologique et Médicale, UMR 7339 CNRS, Faculté de Médecine, Aix-Marseille Université, 2Centre de Recherches en Oncologie Biologique et Oncopharmacologie, UMR 911 INSERM, Faculté de Médecine, Aix-Marseille Université

In dit artikel

Samenvatting

De neurochemie van het zoogdierbrein verandert bij vele neurologische en systemische ziekten. Karakteristieke profielen van cerebrale metabolieten kunnen efficiënt worden verkregen op basis van ruwe extracten van hersenweefsel. Hiervoor wordt hoge-resolutie NMR-spectroscopie gebruikt, wat een gedetailleerde kwantitatieve analyse van metabolietenconcentraties (metabolomics) mogelijk maakt.

Samenvatting

Studies van genexpressie op het niveau van RNA en eiwitten worden al lang gebruikt om biologische processen die ten grondslag liggen aan ziekten te onderzoeken. Meer recent zijn genomics en proteomics aangevuld met een uitgebreide kwalitatieve analyse van de metabolietpool die aanwezig is in biologische systemen. Deze strategie, metabolomics genoemd, streeft ernaar een globale karakterisering te geven van de kleine-molecuulcomplement betrokken bij de stofwisseling. Terwijl het genoom en het proteoom de taken definiëren die cellen kunnen uitvoeren, is het metaboloom onderdeel van het feitelijke fenotype. Onder de methoden die momenteel worden gebruikt in metabolomics, zijn spectroscopische technieken van bijzonder belang omdat ze het mogelijk maken om tegelijkertijd een groot aantal metabolieten te analyseren zonder voorafgaande selectie voor specifieke biochemische routes, waardoor een brede onbevooroordeelde aanpak mogelijk wordt. Hier wordt een geoptimaliseerd experimenteel protocol voor metabolomicsanalyse door hoog-resolutie NMR-spectroscopie gepresenteerd, wat de methode van keuze is voor efficiënte kwantificering van weefselmetabolieten. Belangrijke sterktes van deze methode zijn (i) het gebruik van ruwe extracten, zonder de noodzaak om het monster te zuiveren en/of metabolieten te scheiden; (ii) de intrinsiek kwantitatieve aard van NMR, die kwantificering van alle metabolieten mogelijk maakt die worden weergegeven door een NMR-spectrum met slechts één referentiecompound; en (iii) de niet-destructieve aard van NMR die herhaald gebruik van hetzelfde monster voor meerdere metingen mogelijk maakt. Het dynamische bereik van metabolietenconcentraties dat kan worden bestreken, is aanzienlijk vanwege de lineaire respons van NMR-signalen, hoewel metabolieten die voorkomen in extreem lage concentraties moeilijk te detecteren kunnen zijn. Voor de minst voorkomende verbindingen kan de zeer gevoelige massaspectrometriemethode voordelig zijn, hoewel deze techniek meer ingewikkelde monstervoorbereiding en kwantificeringsprocedures vereist dan NMR-spectroscopie. We presenteren hier een NMR-protocol aangepast voor rattenhersenanalyse; echter, hetzelfde protocol kan met kleine wijzigingen op andere weefsels worden toegepast.

Inleiding

Muismodellen zijn uitgebreid gebruikt in hersenonderzoek 1. Genotype-fenotype correlaties zijn onderzocht bij muizen en ratten hersenen door het bestuderen van genexpressie op het RNA en / of eiwit niveaus enerzijds en morfologische, functionele, elektrofysiologische en / of gedragsmatige fenotypen anderzijds 2-6. Echter volledig begrijpen van de mechanismen link fenotype aan genotype, is het noodzakelijk om de moleculaire gebeurtenissen stroomafwaarts van eiwitexpressie ie onderzoeken. het metabolisme van de biochemische substraten waarop enzymen werken 7. Deze eis heeft geleid, in de afgelopen 10 tot 15 jaar, naar een renaissance van het metabool onderzoek in vele takken van de biologie 8,9. Terwijl klassieke metabole studies zijn vaak gericht op de details van specifieke studierichtingen, wordt de nieuwe metabolomic aanpak gericht op een allesomvattend onderzoek van de globale metabole profiel van het weefsel in kwestie.Een gevolg van dit concept is een duidelijke behoefte aan analytische tools die voorkeur voor specifieke metabole routes en / of klassen van verbindingen te minimaliseren. Echter een klassieke biochemische assay gebaseerd op een specifieke chemische reactie van een specifiek analyt dat moet worden bepaald voordat de test wordt uitgevoerd. Daarentegen worden spectroscopische technieken zoals nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie en massaspectrometrie (MS) (i) gebaseerd op specifieke moleculaire (fysische) eigenschappen van biochemische stoffen, die elk aanleiding geeft tot een of meer afzonderlijke signalen in een spectrum gedetecteerd in de loop van een experiment; en (ii) detectie een groot aantal verschillende verbindingen per experiment.

Dus elk spectrum bevat de gecombineerde informatie van een hele reeks van metabolieten. Daarom spectroscopische methoden geschikte instrumenten voor metabolomics, als geen voorafgaande selectie moet worden gemaakt over de aard van de analyt te meten 8 . Bijgevolg deze technieken nature lenen voor experimentele studies omdat zij zeer detectie van onverwachte metabole veranderingen vergemakkelijken.

Hoewel NMR spectroscopie en MS uitwisselbaar worden gebruikt voor de analyse van vele metabolieten, elke methode bezit specifieke voordelen en nadelen die recentelijk hebben beoordeeld 10. In het kort kan NMR spectroscopie gewoonlijk uitgevoerd uit ruwe extracten en geen chromatografische scheiding van het monster verbindingen voor de analyse vereist. Daarentegen MS werkt met gas of vloeistof chromatografie (GC of LC) scheiding, behalve voor bepaalde recente ontwikkelingen, zoals massaspectrometrie imaging. In enkele speciale gevallen zoals de analyse van suikers, kunnen LC scheiding noodzakelijk voor NMR-spectroscopie en omdat de resonantie lijnen van verschillende suikers aanzienlijk overlappen in proton (1H)-NMR spectra. Niettemin, 1H NMR spectroscopie zonder chromatographic scheiding blijft de meest populaire, bijna universeel toegepaste metabolomic NMR-methode. In het algemeen, monstervoorbereiding is meer tijdrovend en complex voor MS dan voor NMR-spectroscopie. Ernstige problemen door matrixeffecten veel minder vaak in NMR spectroscopie dan in MS wanneer deze kunnen leiden tot aanzienlijk verzwakt signalen. Afbraakproduct kwantificatie kan worden bereikt met deze methoden. Er zijn echter meerdere standaard verbindingen die nodig zijn voor MS te wijten aan variaties in matrix-effecten en de ionisatie-efficiëntie tussen metabolieten. Daarentegen is slechts een standaard per monster nodig voor een NMR spectroscopische analyse omdat onder geschikte meetomstandigheden laatstgenoemde mogelijkheid intrinsiek kwantitatieve dankzij de strikt lineaire NMR reactie van de kernen waargenomen. Een belangrijk nadeel van NMR is de relatief lage gevoeligheid. MS, in het bijzonder LC-MS, is gevoeliger dan NMR door verscheidene orden van grootte; Daarom MS de voorkeur boven NMR voor deanalyse van verbindingen optreden bij zeer lage concentraties. Anderzijds, het destructieve karakter van de NMR experiment is een duidelijk voordeel ten opzichte MS; Zo kan NMR herhaaldelijk worden uitgevoerd op hetzelfde monster, bijvoorbeeld voor verschillende NMR-actieve kernen zoals 1H, fosfor-31 (31P), koolstof-13 (13C), fluor-19 (19 F) etc. als geen materiaal verbruikt door NMR tegenover MS metingen.

Zowel NMR en MS kunnen worden toegepast in verschillende modi, elk optimaal is voor de detectie van verbindingen met bepaalde chemische eigenschappen. Bijvoorbeeld, 31P NMR vaak beter geschikt dan 1H NMR voor de analyse van matig geconcentreerd gefosforyleerde verbindingen, hoewel bijna alle gefosforyleerde metabolieten protonen bevatten. Toch kan hun 1H NMR signalen onzichtbaar door 1H NMR signalen van andere, niet-gefosforyleerde verbindingen, terwijl de laatsteuiteraard niet leiden achtergrond signalen in 31 P-NMR-spectra. In een analoge situatie, 19F NMR analyse de voorkeur voor fluorverbindingen, bijvoorbeeld gefluoreerde drugs (geen achtergrond signalen van endogene metabolieten), terwijl het bijzondere geval van 13 C NMR plaats bijna uitsluitend als het lot van 13 C gelabelde exogene metabole precursors moet worden gevolgd door de extreem lage natuurlijke abundantie van de 13C isotoop (ongeveer 1%). Veel massaspectrometers werken negatief ion mode of positieve ion modus. Daarom is het belangrijk om vóór de analyse of de ionen worden genomen negatief of positief geladen kent. We richten ons hier op een protocol voor de analyse van het hersenweefsel metabolome door 1H en 31P NMR spectroscopie omdat deze methode levert een groot aantal van de belangrijkste metaboliet concentraties tegen lage kosten in termen van (i) de tijd die nodig is voor de bereiding van de monsters eennd (ii) inspanning die nodig is voor de metaboliet kwantificatie. Alle experimenten worden uitgevoerd met behulp van de apparatuur van een standaard nat-chemisch laboratorium en een hoge-resolutie NMR spectroscopie faciliteit. Verdere eisen zijn beschreven in het onderstaande protocol.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: ANIMAL ETHIEK STATEMENT
Dierstudies met ratten volgden de richtlijnen geldig in Frankrijk, en werden goedgekeurd door de lokale ethische commissie (# 40.04, Universiteit van Aix-Marseille Medical School, Marseille, Frankrijk).

1 Oogst en Bevriezing Rat Brain

  1. Bereid werkmateriaal: vloeibare stikstof (N 2liq.) In Dewar dat groot genoeg is om een bevriezing klem (ten minste 2-3 L volume) houden; verdoving (bijvoorbeeld isofluraan of ketamine / xylazine); anesthesie kamer; steriele dissectie-instrumenten: chirurgische schaar, scalpel, tang; weefsel doekjes en de fles met het schoonmaken van alcohol (ethanol); naalden (25 G); 1 ml en 10 ml spuiten. Label aluminium platen (ca. 10 x 10 cm) met plakband. Gebruik vellen individuele freeze-geklemde rat hersenen wikkelen.
    LET OP: Draag altijd beschermende handschoenen en een veiligheidsbril of masker bij het werken met vloeibare stikstof!
  2. Vul Dewar met N 2liq. En plaats vrijzing klem in een Dewar. Controleer de hoeveelheid N 2liq in het Dewar is voldoende voor herhaalde vries-clamp procedures (verscheidene liters, de hoeveelheid N 2liq verdampen tijdens elke freeze-klemmen afhankelijk van de grootte van de klem).
  3. Verdoven van dieren (bijvoorbeeld door isofluraan of door intraperitoneale injectie van een ketamine / xylazine mengsel). Overgaan tot euthanasie door cardiale punctie bloedingen te voorkomen wanneer de hoofdhuid wordt verwijderd en de schedel wordt geopend. Stappen 1,4-1,7 hieronder beschrijven deze standaard procedure.
    Opmerking In speciale protocollen die maximaal behoud van glucose energy-metabolieten, offer rat door-trechter bevriezen van de hersenen van het verdoofde dier met N 2liq 11 na terugtrekken van de hoofdhuid. Vervolgens ontleden hersenen uit de schedel onder intermitterende N 2liq aan postmortale metabolisme 12 minimaliseren.
  4. Bevochtig het hoofd van de rat met het schoonmaken van alcohol. Gebruik chirurgische schaar om (i) remove hoofdhuid, en (ii) geopend schedel langs schedelnaden.
  5. Gebruik een tang om de schedel verder open, en hele brein van onder de open schedel te verwijderen, het positioneren van de kop ondersteboven. Verwijder snel zichtbare sporen van bloed met behulp van weefsel doekjes. Als hersenhelften metabolisch en morfologisch symmetrisch, is het handig om een ​​van de hemisferen voor metaboolanalyse gebruiken na afscheiding uit de andere hemisfeer door incisie met de scalpel. Indien nodig, gebruik maken van de resterende halfrond voor andere hersenen studies zoals histologie.
  6. Snel te verwijderen bevriezing klem van N 2liq -gevulde Dewar, plaatst hele of halve hersenen rat op een inwendig oppervlak, klem en steek onmiddellijk invriezen klem in N 2liq -gevulde Dewar terwijl klem stevig samengedrukt. Ervoor te zorgen dat de stappen 1.3-1.6 duren niet langer dan 60 sec.
  7. Na 1-2 minuten verwijderen bevriezen klem van de Dewar open klem, los ingevroren hersenweefsel van klem, en wrapingevroren weefsel in het gepaste label aluminium plaat (zie 1.1 hierboven). Zorg ervoor dat het leesbaar is en blijft stevig op zijn plaats nadat het monster is verpakt. Plaats snel verpakte monster in N 2liq. Voer de gehele procedure zo snel mogelijk ontdooien van bevroren hersenweefsel voorkomen.
  8. Bewaar bevroren monster in N 2liq of in een vriezer bij -80 ° C tot metaboliet extractie.
    Opmerking: Wanneer een biologisch monster worden opgeslagen meer dan een jaar opslag bij N 2liq temperatuur de voorkeur boven -80 ° C. Dit geldt ook voor de rest van dit protocol.

2 Voorbereiding van Metabolite Extraction Procedure

  1. Bereid weefselhomogenisator en bijpassende reageerbuizen (bijvoorbeeld, 10 mm binnendiameter, afhankelijk van de diameter van de schacht homogenisator, meestal van kunststof). Gebruik elektrische homogenisators plaats van handmatig aangedreven homogenisators (weefsel slijpmachines). Prepare vortexer en laboratorium balans.
  2. Bereid emmer gevuld met crushed ijs. Houd voldoende hoeveelheden van een methanol, chloroform en water op het ijs (4 ml per stuk per 250-350 mg ingevroren hersenweefsel).
  3. Bereid overdracht pipetten en flacons.
    1. Bereid glazen flesjes (≥20 volume ml) met schroefdop en plaats op ijs (een flacon per weefsel extract). Fit schroefdoppen met een Teflon septa bestand tegen chloroform.
    2. Bereid 5 ml plastic pipetten voor het afgeven van methanol en water, en glazen pipetten of Hamilton spuiten voor het afgeven chloroform. Bereid extra plastic pipetten (5 of 10 ml volume) voor het overbrengen mengsels van weefselhomogenaat en methanol.
    3. Controleer het glaswerk wordt grondig gespoeld met gedestilleerd water en zorgvuldig gedroogd voor gebruik om sporen van verontreinigingen, zoals NMR-detecteerbare formiaat en acetaat te verwijderen.
  4. Vul porseleinen vijzel met N 2liq, plaats porseleinen stamper in de vijzel en opnieuw vullen met N 2liq. Stikstof zal verdampen totdat de temperatuur van de vijzel en stamper voldoende laag is. Houd kleine hoeveelheid N 2liq in mortel.

3 Extractie van metabolieten

  1. Verwijder ingevroren hersenweefsel monster uit de opslag (N 2liq tank of -80 ° C vriezer). Dan meteen weefselmonster overbrengen naar gedeeltelijk gevuld met N 2liq mortel.
  2. Gebruik de N 2liq -koude stamper om de bevroren hersenweefsel te breken in kleinere stukken die gemakkelijk passen in de reageerbuizen gebruikt voor weefsel homogenisering. Om stukken bevroren weefsel voorkomen dat geprojecteerd van de mortel in het proces, verdeel het weefsel terwijl nog steeds verpakt in aluminiumfolie. Slijp ingevroren weefsel tot poeder als deze transfer aan de reageerbuis moeilijker (verhoogd risico op condensatie van water) zou maken. Belangrijk: Tijdens de gehele procedure, voeg N 2liq als nodig is om het monster diepgevroren houden mortel.
  3. Mix small stukken bevroren hersenweefsel grondig afgewogen 250-350 mg en over te dragen aan een reageerbuis gevuld met ijskoude methanol (4 ml voor 250-350 mg hersenweefsel). Iedere keer dat stukken bevroren weefsel worden toegevoegd, homogeniseren deze onmiddellijk met het weefsel homogenisator.
    LET OP: Vul dit hele procedure snel op het monster, die zou leiden tot een overschatting van het monster gewicht, en (ii) het verwarmen en ontdooien van het monster te voorkomen dat (i) aanzienlijke condensatie van water. Individuele weefselstukken moeten in bevroren toestand aan het begin van het homogenisatieproces.
  4. Na het laatste stuk van de bevroren rattenhersenen monster is toegevoegd aan het buisje en gehomogeniseerd, breng het homogenaat een ≥20 ml volume glazen flesje, afsluiten schroefdop en laat op ijs gedurende 15 minuten. Als het volume van de reageerbuis niet groot genoeg voor ≥4 ml methanol, een kleinere volume methanol om een ​​deel van het bevroren hersenweefsel gehomogeniseerd Breng het mengsel aan deglazen flesje en verder homogeniseren van het resterende weefsel stukken met verse methanol. Zorg ervoor dat het totale volume van methanol is 4 ml per 250-350 mg hersenweefsel.
  5. Voeg hetzelfde volume ijskoude chloroform (dwz 4 ml per 250-350 mg hersenweefsel) op homogenaat, vortex grondig en laat op ijs gedurende 15 minuten.
    OPMERKING: Gebruik altijd geventileerde chemische kap bij de omgang met vluchtige oplosmiddelen, met name chloroform!
  6. Voeg dezelfde hoeveelheid water (dwz 4 ml per 250-350 mg hersenweefsel) op homogenaat, vortex grondig en laat staan ​​bij -20 ° C overnacht.

4 Bereiding van fasescheiding en Oplosmiddel verdamping

  1. Bereid koude centrifuge (4 ° C, 13.000 xg bij maximale radius) en centrifugebuizen. Zorg ervoor dat de laatste zijn ≥20 ml volume, bestand tegen chloroform, en kan middelpuntvliedende krachten van 13.000 x g weerstaan. Gebruik speciale glazen centrifugeerbuizen maar spoel (als alle glaswerk) met gedestilleerd watervoorgrond gebruik (zie 2.3).
  2. Bereid je grondig gespoeld glas Pasteurpipetten en een geschikte propipettor (lamp, handmatige pipet pomp, automatische pipet hulp / pipet, etc.).
  3. Bereid twee extra grondig gespoeld buizen (≥15 volume ml) per hersenmonster, waarvan ook bestand zijn tegen chloroform (glas of Teflon) is, de andere aan methanol (plastiek bestand tegen methanol of glas).
  4. Bereid oplosmiddelverdamping apparaat (in de handel verkrijgbaar of zelfbouw). Zorg ervoor dat deze inrichting een fijn gecontroleerde stroom droge stikstof gas dat is gericht op het oppervlak van een extract oplossing die vluchtige oplosmiddelen (methanol, chloroform).
  5. Bereid twee extra laden of emmers gevuld met ijs: een voor de steekproef vervoer op het ijs, en een andere voor het opslaan van monsters koud tijdens het verdampingsproces.
  6. Bereid vriesdroger (vriesdroger) en materialen die nodig zijn voor vriesdrogen: (i) een 50ml centrifugebuis of vacuum rondbodemkolf per extract en (ii) N 2liq de waterfase monsters (≤0.3 L per monster) bevriezen. Als centrifugebuis wordt gebruikt, ook voorbereiden wijde hals vacuüm filter fles geschikt voor vriesdroger.

5. fasescheiding en Oplosmiddel verdamping

  1. Voor volledige fasescheiding, breng de methanol / chloroform / water / hersenweefsel homogenaat (zie 3.6) een chloroform-resistente centrifugebuis (volume ≥20 ml) en gecentrifugeerd bij 13.000 xg en 4 ° C gedurende 40 minuten.
    OPMERKING: Twee fasen zullen vormen, gescheiden door een laag neergeslagen eiwit. De onderste (zwaardere) fase bestaat uit methanol, chloroform en opgeloste lipiden, terwijl de bovenste (lichtere) fase bestaat uit water, methanol en opgelost in water oplosbare metabolieten.
  2. Met een Pasteur pipet om de bovenste fase naar een geschikte ≥15 ml buisje (plastic bestand tegen methanol of glas). Keep on ice.
  3. Gebruik een nieuw Pasteur pipet om de onderste fase naar een geschikte ≥15 ml buisje (glas of Teflon). Blijf op ijs.
  4. Bewaar de laag neergeslagen eiwit bij -80 ° C indien het wordt gebruikt voor de bepaling van totaal eiwit; of anders weggooien.
  5. Houd de tube met de water / methanol-fase (zie 5.2) op ijs en methanol verdampt door het richten van een droge stikstofstroom op het oppervlak van het extract oplossing. Als alternatief zachtjes bubble stikstof door het extract oplossing. Beëindig het verdampingsproces bij doorborrelen van stikstof veroorzaakt niet meer volumereductie van het extract oplossing. Op dit moment, verder met vriesdrogen (zie 5.7), of bevriezen en bewaren monster bij -80 ° C met de buis gesloten (schroefdop of Parafilm) tot klaar voor lyofilisatie.
  6. Plaats de buis met de methanol / chloroform fase (zie 5.3) op ijs en verdampen van methanol door het richten van een droge stikstofstroom op de suce van het extract oplossing. Wanneer alle oplosmiddel afgedampt, het proces beëindigd en houdt het monster bij -80 ° C met de buis gesloten (schroefdop of Parafilm) tot klaar voor NMR analyse.
  7. Bereid waterige fase voor Lyofilisatie
    1. Na het einde van het verdampingsproces methanol (zie 5.5), breng het monster een grondig gespoeld 50 ml centrifugebuis (als het monster bevroren is, ontdooien voor transfer). Alternatief: breng een vacuum rondbodemkolf.
    2. Freeze extractieoplossing door rotatie centrifugebuis (of rondbodemkolf) gedeeltelijk ingevoegd in N 2liq zodat het binnenoppervlak van de buis of kolf geleidelijk onder bevroren vloeistof. Zorg ervoor dat er geen N 2liq. Kan het bakje te openen.
    3. Wanneer alle vloeistof bevroren, bedekken de buis met een doorboord deksel of schroefdop om de verdamping te bevorderen, en plaats de buis in een wijde hals vacuüm filter fles.
    4. Start vriesdrogen na attaching de kolf of fles naar de vriesdroger.
  8. Beëindigen het vriesdrogen proces wanneer het monster is helemaal droog. Laat het monster bij -80 ° C in een gesloten buis (met een strakke deksel!) Tot gebruik voor NMR analyse.
    OPMERKING: Meestal maximaal 24 uur nodig voor lyofilisatie. Meerdere monsters kunnen gelijktijdig worden gevriesdroogd, afhankelijk van het ontwerp van de vriesdroger, en of centrifugebuisjes in brede hals flessen of rondbodemkolf worden gebruikt.

6 Bereiding van monsters NMR

  1. WINKEL gedroogde en gevriesdroogde extracten bij zeer lage temperatuur (≤ -80 ° C). Re-ontbinden lyofilisaten voor de bereiding van NMR monsters onmiddellijk voor NMR-experiment.
    LET OP: Het opslaan van monsters in oplossing en / of in de buurt van kamertemperatuur kan leiden tot monster degradatie!
  2. Bereid een waterige 200 mM oplossing van de chelaatvormer, trans-1,2-cyclohexyldiaminetetraacetic acid (CDTA), als volgt:
    1. Voeg zuiver water (bijvoorbeeld 20 ml) in een reageerbuis of centrifugebuis en voeg de hoeveelheid CDTA poeder moet een 200 mM oplossing te genereren.
      OPMERKING: Een aanzienlijk deel van CDTA niet oplosbaar zijn, omdat de pH laag aangezien de zuurvorm van CDTA eerder werd gebruikt dan CDTA zout.
    2. Voeg voorzichtig, stap voor stap, steeds grotere hoeveelheden CsOH poeder om de CDTA oplossing, en vortex grondig na elke toevoeging.
      OPMERKING: De oplosbare fractie CDTA zal toenemen met toenemende CsOH gehalte in de waterige oplossing. Vermijd "overtitration", dat wil zeggen minder toe dan de stoichiometrische hoeveelheid CsOH aan de CDTA oplossing.
    3. Bij bijna alle CDTA poeder is opgelost, start het meten van de pH na elke CsOH toevoeging en grondig vortexen. Beëindig CsOH Bovendien wanneer de uiteindelijke pH wordt bereikt (tabel 1).
      NB: Op dit moment worden alle CDTA worden opgelost. Het gebruik van Cs + als tegenion voor CDTA is generbondgenoot voorkeur boven Na + of K +. Cs + is een zacht Lewiszuur vanwege zijn grote ionenstraal, in tegenstelling tot Na + en K + dat de kleinere ionenstralen hebben en sterke zuren. Bijgevolg Cs + vormen complexen met fosfaten (harde basen) minder gemakkelijk dan doen Na + en K +. Dit is voordelig voor 31P NMR spectroscopie van gefosforyleerde metabolieten omdat complexering neigt NMR lijnbreedten verhogen, met name onder omstandigheden van langzaam tussenliggende ionenuitwisseling.
  3. Voor 31P NMR analyse van fosfolipiden (PL), opgelost gedroogd lipiden (zie 5.6) in 700 ui van een oplosmiddelmengsel bestaande uit gedeutereerd chloroform (CDCI3), methanol en CDTA oplossing bereid zoals beschreven in 6.2 (5: 4: 1 volumeverhouding). Breng het monster op een microcentrifugebuis. Gebruik direct-verplaatsing (of positief-verplaatsing) micropipet met chloroform-resistant tips in beide stappen.
    LET OP: Houd er rekening mee dat het veranderen van een van de volgende parameters zal de verschijning (chemische verschuiving en lijndiktes) van PL 31 P-NMR-spectra 13-17 beïnvloeden:
    (I) volumeverhouding CDCI3: MeOH: CDTA oplossing
    (Ii) het totale volume van het oplosmiddel gebruikt
    (Iii) pH van de waterige component van het oplosmiddel
    (Iv) CDTA concentratie van het waterige bestanddeel van het oplosmiddel.
    OPMERKING: In het algemeen, fine-tuning van deze steekproef parameters (tabel 1) is niet nodig, en dient te worden uitgevoerd met uiterste zorg desgewenst in speciale gevallen. De volumeverhouding oplosmiddel veranderen gemakkelijk resulteert in de vorming van een systeem bestaande uit twee fasen in plaats van een homogene fase! De een-fase systeem bleek praktischer dan de tweefasensysteem meeste toepassingen 13,14 zijn.
  4. Voor 1H NMR-analyse van in water oplosbare metabolieten, los lyofilisaat (zie 5.8) in 700 gl deuteriumoxide (D 2 O) bevattende 3 (trimethylsilyl) propionzuur-2,2,3,3-d4 natriumzout (TSPd 4) in het millimolaire bereik (D2O dat 0,05% TSPd 4 is commercieel beschikbaar) . Breng het monster op een microcentrifugebuis.
  5. Stel de pH van de verkregen waterige extract oplossing 7,3 door toevoeging van kleine hoeveelheden (ca. 2 pl) van deuterium chloride (DCI) en natrium deuteroxide (NaOD) oplossingen. Eerst beginnen met 0,02 N DCl of NaOD oplossingen. Als er 2 of 3 latere toevoegingen niet voldoende pH-verandering veroorzaken, verder met 0,2 N DCl of NaOD oplossingen. Wees voorzichtig niet te overtitrate.
    NB: Het totale bedrag van DCl of NaOD oplossing nodig is afhankelijk van de hoeveelheid hersenweefsel onttrokken; noteer deze waarde voor precieze metaboliet kwantificatie. In de meeste gevallen de gecombineerde hoeveelheden van de toegevoegde DCI en NaOD oplossingen verwaarloosbaar moet zijn (bijna 1% van NMR monstervolume).
itle "> 7. Uitvoering van de 31 P-NMR Experiment voor Brain Phospholipid Analyse 13,14

  1. Voor het beste resultaat, gebruik dan een meerkernige hoge-resolutie NMR-spectrometer (≥9.4 Tesla veldsterkte, wat overeenkomt met 162 MHz 31 P, of 400 MHz 1H resonantie frequenties). Naast de 31 P spoel, ervoor te zorgen dat de 31P NMR probe beschikt over een 1 H spoel voor protonontkoppeling. Set temperatuurregeling van de NMR probe gewenste streefwaarde (meestal 25 ° C).
    OPMERKING: Probe temperatuur kan 10-20 minuten nodig om te stabiliseren!
  2. Centrifugeer PL extractieoplossing in microcentrifugebuis (zie 6.3) bij 4 ° C en 11.000 g gedurende 30 min verminderde snelheid vaste residuen in het monster. Breng 600 pi van het supernatant met een hoge kwaliteit NMR buis (5 mm buitendiameter).
  3. Bereid geschikte coaxiale insert stengel gevuld met een waterige 20 mM methylenediphosphonate (MDP) oplossing met een pH van 7,0 voor de chemische-shift referencingen kwantificering. Plaats deze insert in de NMR-buis gevuld met PL-extract oplossing.
  4. Passen bij de NMR buis met de juiste spinner en transfer naar de NMR-magneet. Nu draaien de monster bij 15-20 Hz en wacht totdat het monster zich heeft aangepast aan de ingestelde temperatuur (ca. 10 min).
  5. Minimaliseren zorgvuldig magnetische-veldinhomogeniteit hele monster door het aanpassen van on-axis en off-axis shim spoel stromingen 18.
  6. Stel NMR spectrum opnameparameters optimale waarden, die kunnen variëren als een functie van magneet veldsterkte (voor een 9,4 T systeem, zie Tabel 1 voor de aanbevolen parameterwaarden).
  7. Stel het aantal passanten per experiment (= NS).
    1. Stel NS tot ongeveer 80 (totale duur van gegevensverzamelings ca. 20 min) als alleen de meest voorkomende PL worden gekwantificeerd nauwkeurig (fosfatidylcholine (PtdCho), fosfatidylethanolamine (PtdEtn), ethanolamine plasmalogenen).
    2. Stel NS tot ongeveer 100-200 (totale duur van data overname 1-2 uur) of minder geconcentreerd PL's moeten worden gekwantificeerd (alkyl-acyl-fosfatidylcholine, fosfatidylinositol, fosfatidylserine, fosfatidinezuur).
    3. Stel NS ongeveer 1500-2000 (totale duur van gegevensverzamelings 7-10 uur; overnight experiment) indien zeer lage concentraties PL worden gekwantificeerd, zoals fosfatidylinositol mono en difosfaten (PtdIP en PtdIP 2), cardiolipine, lyso-PLs , alkyl-acyl-fosfatidylethanolamine, en soms andere.
  8. Na het einde van het spectrum te verwerven, te verwerken vrije inductie verval (FID) met behulp van geoptimaliseerde parameters. De waarden van deze parameters variëren als functie van magnetisch-veldsterkte, shim kwaliteit en de PL signaal te kwantificeren.
    1. Om het beste resultaat te verkrijgen voor het hele scala van PL's, herhaal verwerking met behulp van meerdere (minimaal twee) verschillende filtering procedures. Gebruik sterke verbetering resolutie voor sterk overlappende signalen, bijvoorbeeld., Voor PtdCho en PtdEtngebieden.
    2. Gebruik sterke filtering (zwakke of geen verbetering resolutie) voor zwakke signalen.
    3. Filter zeer zwakke en brede signalen zonder significante overlap van apodisatie (bijvoorbeeld LB = 3 Hz) om signaal-ruisverhouding, zoals PtdIP en PtdIP 2 verhogen. Zie tabel 1 voor de karakteristieke parameters voor verwerking.
  9. Kwantificeer de oppervlakte van elke PL signaal met betrekking tot het gebied onder het signaal van de referentieverbinding (MDP) in hetzelfde spectrum.
  10. Kalibreer het signaal van de referentieverbinding (MDP) in een afzonderlijk experiment met een 5 mm NMR buis gevuld met (i) een fosforverbinding bekende concentratie, en (ii) dezelfde coaxiale insert stam gebruikt PL 31 P NMR-experimenten ( zie 7.3 en 7.9).
  11. Bereken individuele PL concentratie gebaseerd op relatieve oppervlakken van PL signalen enerzijds (zie 7.9) en kalibratiewaarde verkregen uit MDPcoax-insert op de andere (zie 7.10). Er rekening mee dat het aantal fosfor kernen bijdragen aan een specifiek 31P NMR signaal kan variëren als functie van de moleculaire oorsprong van dat signaal.
    OPMERKING: De MDP fosfonaat signaal (meestal verwezen 19,39 ppm) vertegenwoordigt twee fosfor kernen, evenals de cardiolipine fosfaat signaal. Alle andere PL 31P NMR signalen waargenomen in hersenen extracten geven een fosfor kern elk.
  12. Gebruik statistieken software als nodig is om de hersenen PL niveaus vergelijken tussen groepen dieren.

8 Uitvoering van het 1H NMR Experiment voor analyse van water-oplosbare hersenmetabolieten

  1. Set temperatuurregeling van het 1H NMR probe gewenste streefwaarde (meestal 25 ° C). Zie ook de opmerkingen in 7.1.
  2. Centrifugeer het waterige extract oplossing microcentrifugebuis (zie 6.5) bij 4 ° C en 11.000xg gedurende 30 min verminderde snelheid vaste residuen in het monster. Breng 600 pi van het supernatant met een hoge kwaliteit NMR buis (5 mm buitendiameter).
  3. Transfer NMR buis NMR magneet, shim en stel NMR-spectrum acquisitie parameters om optimale waarden zoals uitgelegd in 7,4-7,6. Zie ook Tabel 1 voor de aanbevolen parameterwaarden.
  4. Stel het aantal passanten per experiment om over NS = 32 (totale duur van de data-acquisitie ca. 13 min). Om een goede signaal-ruisverhouding te verkrijgen voor zeer zwakke signalen, met name in het aromatische gebied, gebruik NS = 64 (totale duur van gegevensverzamelings ca. 26 min) of meer.
  5. Na het einde van het spectrum te verwerven, te verwerken vrije inductie verval (FID) met behulp van geoptimaliseerde parameters. De waarden van deze parameters enigszins variëren als functie van de magnetische veldsterkte, shim kwaliteit en de metaboliet signaal te kwantificeren.
    Opmerking: In de meeste gevallen is het voldoende om elk spectrum keer verwerken, Waarbij een set van procesparameters die een goed compromis voor metaboliet signalen. Zie tabel 1 voor de karakteristieke parameters voor verwerking.
  6. Kwantificeer de oppervlakte van elk metaboliet signaal (vaak multiplet, soms overlappen met andere singlets of multiplets gevolg van verschillende moleculen) ten opzichte van de oppervlakte onder het signaal van de referentieverbinding (TSP-d4) in hetzelfde spectrum.
  7. Bereken afzonderlijk metabolietconcentraties basis van TSP-d4 concentratie (zie 6.4). Er rekening mee dat het aantal protonen bijdragen aan een specifiek 1H NMR signaal kan variëren als functie van de moleculaire oorsprong van dat signaal. De TSP-d 4 trimethyl- signaal (referentie: 0.0 ppm) vertegenwoordigt negen protonen.
  8. Gebruik statistieken software als nodig is om de hersenen metaboliet niveaus vergelijken tussen groepen dieren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De beste resolutie te verkrijgen in de metabole NMR-spectra van de hersenen en ander weefsel extracten, is het al lang gebruikelijk om masker metaalionen (belangrijker nog: paramagnetische ionen) te verwijderen of aanwezig in het extract oplossingen. Dit wordt bereikt hetzij door toevoeging van een chelerend middel zoals EDTA of CDTA het extract 19 of door het passeren van het extract door een ionenuitwisselingshars zoals Chelex-100 20. De in figuur 1 resultaten tonen aan dat deze ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

NMR spectroscopie is een efficiënte methode voor het meten van concentraties van chemische verbindingen in oplossing in een zeer reproduceerbare en accurate wijze. Echter, om kwalitatief hoogwaardige gegevens te verkrijgen is het nodig om zich te houden aan bepaalde voorschriften betreffende het monster voorbereiding en analyse. Bij het bepalen van metabolietconcentraties door NMR spectroscopie, noch de vorming of de ontvangst van het NMR signaal domineert de kwantificering fout, tenzij de intensiteit van een waargenome...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De steun van Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, UMR 6612 en 7339) wordt dankbaar erkend.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
IsofluraneVirbacVetfluraneAnestheticum voor dieren
Isoflurane verdamperOhmedaIsotec 3Nieuwere model beschikbaar: Isotec 4
Scalpel, schaar, tang, klemmenHarvard Apparatus
Fisher Scientific		various
various		Chirurgisch materiaal voor dieren
Freeze-clamp toolhomebuiltn/aTang met aluminium platen, te plaatsen
in vloeibare stikstof voor koeling
DewarNalgene4150-4000
Vloeibare stikstofAir Liquiden/a
StikstofgasAir Liquiden/a
Stijkstof verdamperOrganomation AssociatesN-EVAP 111Kan worden vervangen door een zelfgemaakt apparaat
MortarSigma-AldrichZ247472
PistoolSigma-AldrichZ247510
WeefselhomogenisatorKinematicaPolytronMet testbuisjes die passen op de homogenisatorschacht
Elektronische weegschaalSartoriusn/a
MethanolSigma-AldrichM3641
ChlorooformSigma-Aldrich366910
Centrifugebuisjes van glasKimble45500-15, 45500-30Kimax 15 ml, 30 ml buis
MicrocentrifugebuisjesKimble45150-2Kimax 2 ml buis; moet 'Eppendorf'-buis vervangen als deze compatibel is met de centrifugerotor
Polystyreen pipettenCostar CorningStripettes5 en 10 ml volumes
DeuterochloroformSigma-Aldrich43191599,96% gedeutereerd
DeuteriumoxideSigma-Aldrich42345999,96% gedeutereerd
DeuteriumchlorideAlpha Aesar4240620% in deuteriumoxide
NatriumdeuteroxideSigma-Aldrich16448830% in deuteriumoxide
LyofilisaatChristAlpha 1-2
Koude centrifugeHeraeusMegafuge 16R
pH-meterEutech CyberneticsCyberscan
CDTASigma-AldrichD0922
CesiumhydroxideSigma-Aldrich516988
NMR-buisjesWilmad528-PP
NMR-stam coaxiaal inzetstukSigma-AldrichZ278513Door Wilmad
NMR-pipettenSigma-AldrichZ255688
PipettenEppendorfResearchMet punten voor volumes van 0,5 tot 1.000 μl
Pipet-AidDrummondXP
NMR-spectrometerBrukerAVANCE 400inclusief sonde en andere accessoires
NMR-softwareBrukerTopSpin 1.3nieuwere versie beschikbaar: Topspin 3.2
In water oplosbare standaardverbindingenSigma-Aldrichvarious
Standaardverbindingen voor fosfolipidenAvanti Polar Lipids
Doosan Serdary
Sigma-Aldrich		various
various
various		Bron voor plasmalogenen, maar mogelijk <70 - 80% zuiverheid
MethylendifosfonatSigma-AldrichM9508
TSP-d4Sigma-Aldrich269913

Referenties

  1. Manger, P. R., et al. Is 21st century neuroscience too focused on the rat/mouse model of brain function and dysfunction. Front Neuroanat. 2, 5(2008).
  2. Buxbaum, J. D., et al. Optimizing the phenotyping of rodent ASD models enrichment analysis of mouse and human neurobiological phenotypes associated with high-risk autism genes identifies morphological, electrophysiological, neurological, and behavioral features. Mol Autism. 3, 1(2012).
  3. Papaioannou, V., Behringer, R. R. Mouse Phenotypes A Handbook of Mutation Analysis. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Woodbury. (2004).
  4. Yu, F. H., et al. Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy. Nat Neurosci. 9, 1142-1149 (2006).
  5. Mallolas, J., et al. A polymorphism in the EAAT2 promoter is associated with higher glutamate concentrations and higher frequency of progressing stroke. The Journal of Experimental Medicine. 203, 711-717 (2006).
  6. Crusio, W. E., Sluyter, F., Gerlai, R. T., Pietropaolo, S. Behavioral Genetics of the Mouse Genetics of Behavioral Phenotypes. Vol. 1, Cambridge University Press. New York. (2013).
  7. Viola, A., Saywell, V., Villard, L., Cozzone, P. J., Lutz, N. W. Metabolic fingerprints of altered brain growth, osmoregulation and neurotransmission in a Rett syndrome model. PLoS ONE. 2, e157(2007).
  8. Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. Methodologies for Metabolomics. , Cambridge University Press. New York. (2013).
  9. Rabinowitz, J. D., Purdy, J. G., Vastag, L., Shenk, T., Koyuncu, E. Metabolomics in drug target discovery. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 235-246 (2011).
  10. Wishart, D. S. Methodologies for Metabolomics. Wevers, R. A., Lutz, N. W., Sweedler, J. V., et al. , Cambridge University Press. New York. (2013).
  11. Ponten, U., Ratcheson, R. A., Salford, L. G., Siesjo, B. K. Optimal freezing conditions for cerebral metabolites in rats. Journal of Neurochemistry. 21, 1127-1138 (1973).
  12. Henry, P. G., Oz, G., Provencher, S., Gruetter, R. Toward dynamic isotopomer analysis in the rat brain in vivo automatic quantitation of 13C NMR spectra using LCModel. NMR Biomed. 16, 400-412 (2003).
  13. Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts 2 Line width and spectral resolution. Anal Chem. 82, 5441-5446 (2010).
  14. Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts. 1. Chemical shift and signal separation. Anal Chem. 82, 5433-5440 (2010).
  15. Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Methodologies for Metabolomics. Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. , Cambridge University Press. New York. (2013).
  16. Lutz, N. W., Fernandez, C., Pellissier, J. F., Cozzone, P. J., Beraud, E. Cerebral biochemical pathways in experimental autoimmune encephalomyelitis and adjuvant arthritis a comparative metabolomic study. PLoS ONE. 8, e56101(2013).
  17. Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Principles of multiparametric optimization for phospholipidomics by 31P NMR spectroscopy. Biophys Rev. 5, 295-304 (2013).
  18. Pearson, G. A. Shimming an NMR magnet. , University of Iowa. Iowa City. (1991).
  19. Lane, A. N., Fan, T. W. M., Higashi, R. M. Biophysical tools for biologists. Correia, J. J., Detrich, H. W. Vol. 1, In vitro techniques, Academic Press. Waltham. (2008).
  20. Peeling, J., Wong, D., Sutherland, G. R. Nuclear magnetic resonance study of regional metabolism after forebrain ischemia in rats. Stroke. 20, 633-640 (1989).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

NMR spectroscopieextracten van hersenweefselweefselhomogenisatiemethanol chloroform waterlyofilisatieprocesfosfolipidenanalysehoge resolutie NMRmetabolietenprofilering
Metabolomic Analyse van de hersenen van de rat door de hoge resolutie nucleaire magnetische resonantie spectroscopie van Tissue Extracten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.