In vivo beeldvorming van Dauer-specifieke neuronale Verbouwing in C. elegans

Samenvatting

Na blootstelling aan specifieke omgevingsstressors, ondergaat de rondworm Caenorhabditis elegans een uitgebreide fenotyische plasticiteit om een stressbestendig 'dauer'-juveniel stadium te betreden. We presenteren methoden voor de gecontroleerde inductie en beeldvorming van neuroplasticiteit tijdens dauer.

Samenvatting

De mechanismen die stress geïnduceerde fenotypische plasticiteit bij dieren vaak complex en moeilijk te bestuderen in vivo. Een klassiek voorbeeld van stress geïnduceerde plasticiteit is het dauer stadium van C. elegans. Dauers een alternatief ontwikkelings larvale stadium gevormd onder omstandigheden van lage concentraties van bacteriële voedsel en hoge concentraties van een dauer feromoon. Dauers geven uitgebreide ontwikkelings-en gedragsproblemen plasticiteit. Bijvoorbeeld, een set van vier binnenste-labiale kwadrant (IL2Q) neuronen ondergaan uitgebreide omkeerbaar verbouwen tijdens dauer formatie. Gebruik makend van de bekende milieu routes reguleren dauer ingang, een vooraf vastgestelde methode voor de productie van ruw dauer feromoon van grootschalige vloeistof nematode kweken wordt aangetoond. Bij deze methode wordt een concentratie van 50.000 - 75.000 rondwormen / ml vloeibare kweek voldoende is om een ​​zeer krachtige ruwe dauer feromoon. De ruwe feromoon potentie is determined door een dosis-respons bioassay. Ten slotte gebruikt voor in vivo time-lapse imaging van de IL2Qs tijdens dauer vorming methoden beschreven.

Inleiding

Fenotypische plasticiteit, met inbegrip van ontwikkelings-en gedragsproblemen plasticiteit, is belangrijk voor de aanpassingen aan de ongunstige omstandigheden en wordt beschouwd als een drijvende kracht in de evolutie ^1. C. elegans is een modelorganisme vaak gebruikt voor onderzoek naar de ontwikkeling en neurobiologie. Onder ideale omstandigheden, C. elegans ontwikkelt zich door vier larvale stadia voorafgaand aan het invoeren van de volwassen reproductieve fase. Echter, onder omstandigheden van lage beschikbaarheid van voedsel en de hoge bevolkingsdichtheid, C. elegans is een ontwikkelings-schakelaar te ondergaan en het aangaan van een lange levensduur en stress-bestendig dauer fase ^2. Dauers tonen verschillende morfologische en gedragsmatige verschillen van niet-dauers die waarschijnlijk bemiddelen deze stressbestendigheid. De omgevingsfactoren en genetische pathways reguleren dauer toegang is uitvoerig beschreven ^{3, 4, 5, 6, 7.} De moleculaire mechanismen die individuele fenotypische veranderingen die optreden dijdens dauer vorming zijn minder goed begrepen.

Het onderzoek van dauer-specifieke fenotypes vereist de productie van dauer dieren. Dit kan op drie manieren: 1) plukken van een uitgehongerd cultuur van C. elegans, 2) Gebruik van dauer vorming constitutieve (daf-c) mutanten, 3) Inductie van dauer vorming door gezuiverd feromoon. Het is relatief eenvoudig om dauers kiezen uit een standaard NGM plaat met een C. elegans bevolking dat de bacteriële voedselvoorziening heeft uitgeput. In onze handen, een standaard NGM plaat oorspronkelijk geënt met 50 ui OP50 Escherichia coli, kunnen groeien gedurende 3 dagen en vervolgens geïnoculeerd met 3-4 volwassen hermafrodieten bewaard bij 25 ° C zal de voedselvoorziening binnen een week uitgeput en produceren duizenden dauers binnen een extra 3 dagen (in aanvulling op tal uitgehongerd non-dauers). Echter, deze methode is onbevredigend voor de behandeling van processen die optreden tijdens de rui in dAuer. Het is moeilijk om te bepalen welke van de enkele duizenden dieren op een typische uitgehongerde plaat zijn het aangaan van dauer. Bovendien wordt het gebruik van een uitgehongerde plaat biedt geen mogelijkheid om te synchroniseren. Het gebruik van daf-c mutanten maakt synchronisatie en betrouwbare generatie dauers. Er is echter geen garantie dat een bepaald daf-c mutatie geen invloed andere dauer-specifieke fenotypes alleen of in combinatie met andere mutaties.

De aanwezigheid van een dauer feromoon werd voor het eerst gesuggereerd door Cassada en Russell en later aangetoond door Golden en Riddle. De dauer feromoon is sindsdien chemisch gekarakteriseerd ^{2, 8, 9, 10.} Het gezuiverde feromoon bestaat uit een complex mengsel van ascarosides, die in verschillende vormen reguleren van gedragsmatige en ontwikkelingsprocessen ^{9, 11.} Toepassing van een ruw extract dauer feromoon maakt betrouwbare gecontroleerde inductie van gesynchroniseerde dauers in een wild-type achtergrond.

Het zenuwstelsel en de bijbehorende gliacellen ondergaan remodeling tijdens dauer larve vorming ^{12, 13, 14.} Sommige van deze veranderingen zijn onomkeerbaar, zoals de verbouwing van gliacellen tijdens dauer ^{13, 14.} Echter andere remodeling gebeurtenissen zijn reversibel na een terugkeer naar positieve omgevingsomstandigheden. Bijvoorbeeld, een set van vier IL2Q neuronen ondergaan snelle en omkeerbare neuronale remodeling in dauer formatie inclusief: dendriet arborization, een omschakeling van enkele dendritische tot multidendritic neuronen en axonen remodeling ^12. De werkwijzen die hierin staan ​​voor een betrouwbare in-vivo beeldvorming van stress geïnduceerde neuroplasticiteit in een modelorganisme. Tot de voor de productie en het testen van ruwe dauer feromoon werkwijzen zijn eerder beschreven en samengevat van verschillende bronnen ^{4, 8, 15, 16, 17, 18.}

Protocol

1 Ruwe Dauer feromoonproductie

1. Grow OP50 E. coli van een enkele kolonie O / N bij 37 ° C onder schudden in 100 ml LB-bouillon bij 200 rpm. LET OP: Deze O / N cultuur kan vooraf worden gemaakt en opgeslagen bij 4 ° C.
2. Grow N2 C. elegans op 15-20 juni cm petrischaaltjes met NGM agar (zie recept in tabel 1) geënt met 50 ui OP50 E. coli totdat de bacteriën bijna op ^19.
3. Maak 5x 250 ml S media (zie recept in tabel 1) in 1 L erlenmeyers ^19. OPMERKING: Deze oplossing kan worden gemaakt op voorhand.
4. Kweek een cultuur van OP50 E. coli in 4 L LB bouillon O / N door het enten met 1 ml OP50 in E. coli en schudden bij 37 ° C gedurende 16 uur.
5. Was de nematoden uit platen (stap 1.2) met 1 ml van S basale oplossing (zie recept in tabel 1) en overdracht nematoden 4-5 platen in elk van 4 1 L Erlenmeyer kolven met de S media bereid in stap 1.3 (4 5 platenper kolf) ^19.
6. Centrifugeer de OP50 uit stap 1.4 bij 650 xg gedurende 10 minuten en verwijder supernatant. Resuspendeer elk bacteriële pellet in 10 ml van S basale oplossing. Transfer gelijke hoeveelheden geresuspendeerd bacteriën aan elke kolf van nematoden.
7. Plaats de kolven op een orbitale schudder bij kamertemperatuur (20 - 25 ° C) en 100 - 150 rpm gedurende 4-5 dagen tot de oplossing weer helder wordt, hetgeen een uitputting van voedsel.
8. Zodra het voedsel op is, groeien een andere O / N cultuur van OP50 E. coli in 4x 1 L van LB-bouillon. Centrifugeer de kiemen bij 650 xg gedurende 10 min en voeg een pellet ve kolf elk van de S media kolven met nematoden. Zet de S media kolven om de orbitale schudder, zoals in stap 1.7, voor een extra 3-4 dagen tot het eten weer leeg is.
9. Neem een ​​~ 1 ml van oplossing uit elke kolf en een schatting van de nematode concentratie door sub-sampling 1 pi van elk 1 ml monster en het tellen van het aantal aaltjes. OPMERKING: Denematodenpopulatie moeten 50.000 - 75.000 nematoden / ml. Bij deze concentratie de meeste nematoden dauers.
10. Gooi alle verontreinigde kolven. OPMERKING: Besmetting manifesteert vaak als schimmeldraden gezien tijdens stap 1.9.
11. Centrifugeer nematoden bij 4000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Gooi de nematode pellet en bewaar het supernatant. U kunt ook de discussie voor het gebruik van deze dieren naar een lage-potentie feromoon maken.
12. De bovendrijvende vloeistof filteren door middel van # 1 Whatman filterpapier. OPMERKING: Een thermoskan zal dit proces versnellen.
13. Verder te filteren de bovenstaande vloeistof op 0,45 micrometer steriele vacuüm filtratie-eenheden. Opmerking filtraat kan worden bewaard O / N bij 4 ° C of naar het 1.14.
14. Voeg het filtraat over in een 2 L beker met een roerstaafje. Leg ze in een zuurkast op een verwarming roerplaat. Breng aan de kook al roerend en verdampen tot ongeveer 200 ml. Breng de oplossing in een bekerglas van 500 ml. Kook dan tot ongeveer 50 ml zijn le. ft OPMERKING: Men dient bij deze stap is het mogelijk dat de oplossing overkookt. De kleur van de uiteindelijke 50 ml is donkerbruin. Op elk moment tijdens het koken, kan de warmte worden uitgeschakeld en het filtraat opgeslagen O / N bij RT of 4 ° C.
15. Laat afkoelen en centrifugeer 5 min bij 1000 x g. Giet het supernatans in een bekerglas van 100 ml en de pellet weggegooid.
16. Kook de supernatant tot een bruine korst. Haal van het vuur en het breken van de korst met een spatel. Voeg voldoende 200 bewijs ethanol om de korst te dekken. Dek het bekerglas af met Parafilm en laat het zitten O / N bij RT. Giet de ethanol in een schone beker en zet aan de kant. Voeg verse ethanol aan de korst te dekken. Herhaal O / N extracties 3 keer. Bundelen de extracten.
17. Gebruik een vacuümpomp de ethanolextracten drogen. Als een vacuümpomp niet beschikbaar, voeg het ethanolextract een schoon bekerglas en warm tot 50 ° C onder roeren in een zuurkast. OPMERKING: Zodra de ethanol een kleverige resten van l is verdamptechts bruine kleur moet blijven. Als verwarming wordt gebruikt, moet erop worden gelet dat niet de oplossing door verwarming branden te lang.
18. Los residu in 10 ml gedestilleerd steriel water. Filter steriliseer deze oplossing met een 0,22 urn spuitfilter en bewaar bij -20 ° C in 1 ml porties. Opmerking: 1 ml water wordt gebruikt voor het oplossen van het residu voor elke 100 ml van de oorspronkelijke vloeibare kweek nematode. Als bijvoorbeeld een van de vloeibare kweek flessen gevolg wordt weggegooid verontreiniging, pas dan de hoeveelheid water aan het residu opgelost.

2 Bepaling van Pheromone Dose Response

1. Bereid dauer feromoon door 6x 5 ml van NGM media Noble agar, zonder pepton, en aangevuld met 50 ug / ml streptomycine sulfaat en diverse dauer feromoon (zie recept in tabel 1) ^{4, 19.} Meng componenten in een 13x100 mm glascultuur buis, koken boven een bunsenbrander, en dan giet het in 3 cm petrischaaltjes.
2. Weeg amicrocentrifuge buis. Voeg 1 ml O / N kweek van E. coli OP50 aan de buis en centrifugeer bij ~ 17.000 xg in een microcentrifugebuis. Verwijder alle van de bovenstaande vloeistof. Weeg de buis opnieuw en bepaalt het gewicht van de bacteriële pellet. Resuspendeer de pellet met M9 buffer (zie recept in tabel 1) voor een uiteindelijke concentratie van 4% ^(w / _v). Aliquot 10 ul van de bacteriële suspensie op het midden van elk feromoon plaat ^4. Store borden O / N bij RT.
3. Pick 10-15 gravid N2 wild-type hermafrodieten een dag na de rui in de volwassenheid op het feromoon platen ^4. Bewaar de platen bij 25 ° C gedurende 3 - 4 uur.
4. Halen uit alle van de volwassen hermafrodieten. Noteer het aantal gelegd voor elke plaat eieren. Dicht de platen met Parafilm en terugkeren naar 25 ° C gedurende 3 dagen ^17.
5. Tel het percentage dauers (figuur 2). Opmerking: Voor beide methoden is het belangrijk op te merken dat dauers (en in mindere extent niet-dauers) zal klimmen de muren en op de deksel van de petrischaaltjes. Het is daarom belangrijk om alle oppervlakken van de schotel voor nematoden onderzoeken.
6. Bevestig de gegevens naar een dosis-response curve en een schatting van de EG ₉₀ concentratie van feromonen (voldoende feromoon tot 90% van de dieren bewegen om dauers vormen) zoals weergegeven in figuur 3. Opmerking: We gebruiken meestal een logistische regressie model om een schatting van de EG ₉₀ , maar verschillende statistische softwarepakketten kunnen alternatieve methoden die gelijkaardige schattingen produceren.

3 Live-Imaging van Dauer IL2 Neuronen

1. Bereid dauer feromoon platen als in protocol 2 met behulp van de EC ₉₀ waarde bepaald in stap 2.6.
2. Induceren dauers volgens de in protocol 2 met een stam die een geïntegreerde IL2 reporter transgen (myIs13 [P _KLP-6 :: GFP], myIs14 [P _KLP-6 :: GFP], myIs16 [P _KLP-6 :: tdTomato] of qIs56 [P _{achterstand-2} :: GFP]) ^{12, 20, 21.} OPMERKING: als q Is56 wordt gebruikt, zal expressie van GFP niet zichtbaar in de IL2Qs zijn tot enkele uren in het dauer molt en een aantal van de eerste verbouwing gebeurtenissen zal niet zichtbaar zijn. Bovendien, terwijl het fluorescente signaal van de P _{achterstand-2} :: GFP transgene uiteindelijk helderder in de IL2s tijdens dauer dan P _KLP-6 fluorescente reporters, de P _lag-2 :: GFP transgene drukt ook zwak in de kop spieren die kan de fijne IL2 takken maskeren.
3. Volgende ei-leggen, verwijder de volwassen hermafrodieten, verzegelen de platen met Parafilm en incubeer gedurende 34 uur bij 25 ° C ^17. OPMERKING: De lengte van de tijd om de dauer molt enigszins verschilt tussen individuen. De snelste periode van dendriet arborization begint 4-5 uur na het begin van het dauer molt (39-44uur na ei-leggen bij 25 ° C) ^12.
4. De dag voor beeldvorming, maakt een oplossing van 10% ^(w / _v) agarose in M9 buffer dauer feromonen bij de _EC90 concentratie. Portie ongeveer 100 ul van agarose op een microscoop glijbaan en snel, maar voorzichtig, plaats nog een dia op de top van een vlakke agarose oppervlak te creëren. Nadat de agarose is gestold, wikkel de dia's in Saran wrap en op te slaan in een vochtige kamer (pipettip doos met natte papieren handdoeken).
5. Na de 34 uur incubatietijd, onderzoeken feromoon platen voor aaltjes die pharyngeal pompen zijn gestopt. Afzonderlijke dia zodat slechts een oppervlak van een schuif heeft agarose op. Kies een of meer aaltjes op een 10% agarose pad en 1 μ l van 0,1 micron polystyreen parels ^22. OPMERKING: Bij een goed gesynchroniseerde bevolking, de meerderheid van de nematoden op de plaat wordt het sluiten van de rui van L2D tot dauer. Echter, er kan variatie tussen i zijnndividuals. Het is daarom belangrijk om extra functies (stoma occlusie, keelholte remodeling) mee naar de hoeveelheid tijd die de dieren hebben in de dauer rui geweest (zie representatieve resultaten bijvoorbeeld) te schatten.
6. Bepaal de oriëntatie (links / rechts, dorsale / ventrale) van de nematode. Leg Z-stack beelden van een IL2Q dendriet bij 100x vergroting met de laagst mogelijke fluorescentie-intensiteit elke 15 minuten of indien dat voor het specifieke experiment. Blijven vastleggen van beelden tot de nematode is gescheiden van de L2D nagelriem en immobilisatie onmogelijk is of indien het dier herstelt van dauer (keelholte begint te pompen). Als deze niet actief beeldvorming, plaats de dia in een vochtige kamer. LET OP: Wij maken gebruik van een epifluorescerende microscoop met een gemotoriseerde podium en differentieel interferentie contrast (DIC) optiek.

Resultaten

De productie van ruwe dauer feromoon resulteert in een gele vloeistof (figuur 1) die zowel warmte en koude stabiel. Hoeveelheden van ruwe feromoon opgeslagen bij -20 ° C onbeperkt zonder duidelijke verlies van activiteit. Na de productie van feromonen, een enkele dosis-respons bioassay is voldoende voor een ruwe schatting van potentie. Voor de meeste experimenten moet de bioassay 2 nogmaals - 3 keer en neem het gemiddelde van elk experiment. Representatieve resultaten van twee feromoon bioassays zijn aa...

Discussie

Een onderzoek van dauer-specifieke neuroplasticiteit en andere dauer geassocieerde morfologische veranderingen vereist gecontroleerde en betrouwbare vorming van dauers hetzij door genetische mutatie (dwz daf-c mutanten) of door blootstelling van wildtype dieren feromoon. Hoewel het gebruik van een genetische mutatie te induceren dauers handig kan deze resultaten verwarren. Daarom verzamelde gegevens met daf-c mutaties moet vervolgens worden bevestigd met wild-type dieren veroorzaakte aan de dauer fase ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
N2 C. elegans Bristol-stam	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	Op verzoek van Schroeder lab
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	Op verzoek van Schroeder lab
JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Petrischalen	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM-agar	Verschillende		3 g NaCl, 17 g agar, 2,5 g pepton in 975 ml H2O geautoclaveerd, afgekoeld tot 55°C gevolgd door 1 ml van 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 ml van 1 M KPO4-buffer (pH 6,0), 1 ml van 1 M CaCl2, 1 ml van 1 M MgSO4
S-medium	Verschillende		S-medium bestaat uit S-basisoplossing (1,46 g NaCl, 0,25g K2HPO4, 1,5 g KH2PO4, 0,25 ml van 5 mg/ml cholesterol in ethanol en H2O tot 250 ml. Geautoclaveerd.) Aan de S-basisoplossing 2,5 ml kaliumcitraat pH 6,0 toevoegen (2 g citroenzuurmonohydraat, 29,4 g trinatriumcitraatmonohydraat, H2O tot 100 ml, geautoclaveerd), 2,5 ml van Trace Metals Solution (1,86 g dinatrium-EDTA, 0,69 g FeSO4 •7 H2O, 0,2 g MnCl2•4 H2O, 0,29 g ZnSO4 •7 H2O, 0,025 g CuSO4 •5 H2O, H2O tot 1 L. Geautoclaveerd en in het donker bewaard), 0,75 ml van 1 M CaCl2, en 0,75 ml van 1 M MgSO4.
Dauer-feromoonplaten voor dosis-responstest	Verschillende		Meng 0,085 g Nobel-agar, 0,5 ml van 0,513 M NaCl en 5 µl van 5 mg/ml cholesterol opgelost in ethanol in elk van 6x 15 ml kweekbuizen. Voeg voldoende ruw feromoon toe aan elke buis om een ​​reeks concentraties te creëren. Voeg H2O toe om het volume op 4,725 ml te brengen.  Kook op een Bunsenbrander totdat de agar is opgelost en koel vervolgens af tot 55 °C. Voeg 125 µl 1 M KPO4-buffer (pH 6,0), 50 µl 0,1 M CaCl2, 50 µl 0,1 M MgSO4 en 50 µl van 5 mg/ml streptomycinesulfaat toe aan elke buis.  Giet de inhoud van elke buis in een petrischaal van 35 mm diameter. Laat de agar overnacht op kamertemperatuur stollen (bij langer bewaren in een afgesloten container bewaren om overmatig uitdrogen te voorkomen).
Microsfeerkralen 0,1 micron	Polysciences Inc.	00876-15
M9-buffer	Verschillende		Meng 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O tot 1 liter. Steriliseer door autoclaven