Het is aangetoond dat de regulatie van alternatieve splicing bijdraagt aan de epitheel-mesenchymale overgang (EMT), een essentieel cellulair programma in verschillende fysiologische en pathologische processen. Hier beschrijven we een methode die gebruikmaakt van een induceerbaar EMT-model voor de detectie van alternatieve splicing tijdens EMT.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Detectie van alternatieve splicing Tijdens-mesenchymale transitie
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Alternatief splicing speelt een cruciale rol in de epitheliële-mesenchymale overgang (EMT), een essentieel cellulair programma dat optreedt in verschillende fysiologische en pathologische processen. Hier beschrijven we een strategie om alternatief splicing tijdens EMT te detecteren met behulp van een induceerbaar EMT-model door de transcriptie-repressor Twist tot expressie te brengen. EMT wordt gemonitord door veranderingen in celmorfologie, verlies van E-cadherine-lokalisatie bij cel-celverbindingen en de veranderde expressie van EMT-markers, zoals verlies van epitheliële marker E-cadherine en γ-catenine en verkrijgen van mesenchymale marker N-cadherine en vimentin. Met behulp van isovorm-specifieke primersets wordt het alternatieve splicing van geïnteresseerde mRNA's geanalyseerd door kwantitatieve RT-PCR. De productie van overeenkomstige eiwitisovormen wordt gevalideerd door immunoblot-assays. De methode voor het detecteren van splice-isovormen die hier wordt beschreven, is ook geschikt voor de studie van alternatief splicing in andere biologische processen.
Inleiding
De epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) is een ontwikkelings-programma dat orgaan morfogenese en weefselremodellering rijdt tijdens de embryogenese. Bij abnormaal geactiveerd, EMT bevordert tumor uitzaaiingen en orgaanfibrose 1,2. Overtuigend studies hebben het belang van transcriptionele regulatie beschreven tijdens het proces van EMT, bepaald door verscheidene transcriptiefactoren, zoals Twist, Slak en ZEB, die de expressie van de adherens junction eiwit E-cadherine onderdrukken, wat resulteert in verlies van klinkers steenachtige epitheliale morfologie en winst van een spoelvormige mesenchymale fenotype 3-8. Recente studies door genoom-br....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1 Cel Cultuur van EMT Inductie
Opmerking: EMT kan worden geïnduceerd door behandeling van TGFB of ectopische expressie van transcriptiefactoren Twist, slak of Zeb1 / 2 in epitheelcellen. Beschreven in dit protocol een induceerbare EMT systeem via de expressie van de Twist-ER fusie-eiwit in vereeuwigd menselijke borstklier epitheelcellen (HMLE / Twist-ER, een geschenk van Dr J Yang, UCSD) 9,11,29. Bij 4-hydroxytamoxifen (TAM) behandeling, het fusie-eiwit Twist-ER naar de kern om transcriptie en resultaten leiden in een volledig EMT overgang in 12-14 dagen 9,11,29. Extra EMT induceerbare systemen, zoals HMLE / Slak-ER, H....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De hierboven beschreven werkzaamheden een robuuste methode om alternatieve splicing detecteren tijdens EMT. Representatieve resultaten van CD44 splice isovorm schakelen tijdens-Twist geïnduceerde EMT worden hieronder als voorbeeld gegeven.
Twist-geïnduceerde EMT in HMLE / Twist-ER-cellen gekenmerkt door een overgang van een kasseien achtige epitheliale fenotype naar een langwerpige fibroblasten fenotype (Figuur 2A), het ontbreken van epitheliale merkers E-cadherine, γ-cateni.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hier beschreven werkwijze maakt de detectie van alternatieve splicing van een induceerbare EMT model. Als zodanig dynamische veranderingen van splice isovorm expressie kan worden ingenomen gedurende het tijdsverloop van EMT. Deze werkwijze heeft voordelen boven het gebruik van verschillende epithelial- of mesenchymale cellijnen die voor vergelijking van alternatieve splicing omdat verschillende genetische achtergronden van un-gerelateerde cellijnen onrechtmatig kunnen beïnvloeden alternatieve splicing. Wel moet de su.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
De auteurs willen Wensheng Liu graag bedanken voor de onschatbare hulp bij celbeeldvorming. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de US National Institutes of Health (R01 CA182467), American Cancer Society (RSG-09-252-01-RMC), Lynn Sage Foundation en A Sister’s Hope Foundation.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 4-hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | Maak oplossing door 4-hydroxytamoxifen op te lossen in ethanol tot 200 μM. Bewaar de oplossing bij -20 °C beschermd tegen licht. |
| E.Z.N.A. Total RNA Isolation kit | Omega Bio-Tek | R6731 | Totale RNA isolatie kit |
| GoScript Reverse Transcription System | Promega | A5001 | Reagens voor qRT-PCR-test |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6002 | Reagens voor qRT-PCR-test |
| LightCycler 480 Real-Time PCR System | Roche | Apparatuur voor qRT-PCR-test | |
| CD44 antilichaam | R&D Systems | BBA10 | 1:1.000 verdunning |
| E-cadherine antilichaam | Cell Signaling Technology | 4065 | 1:2.500 verdunning voor immunoblotting; 1:50 verdunning voor immunofluorescentie |
| γ-Catenine antilichaam | Cell Signaling Technology | 2309 | 1:1.000 verdunning |
| Occludin antilichaam | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-5562 | 1:500 verdunning |
| Fibronectine antilichaam | BD Transduction Laboratories | 610077 | 1:5.000 verdunning |
| N-cadherine antilichaam | BD Transduction Laboratories | 610920 | 1:2.000 verdunning |
| Vimentin antilichaam | NeoMarkers | MS-129-p1 | 1:500 verdunning |
| GAPDH antilichaam | Millipore Corporation | MAB374 | 1:10.000 verdunning |
| Amasham ECL Western blotting detectiereagens | GE Health Life Science | RPN2209 | Chemiluminescentiesysteem |
Referenties
- Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 131-142 (2006).
- Yang, J., Weinberg, R. A. Epithelial-mesenchymal transition at the crossroads of development and tumor metastasis. De....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
