Methodenartikel

Beoordeling van Muriene Oefening Endurance zonder het gebruik van een Shock Grid: Een alternatief voor Forced Exercise

19.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/51846

⸱

14 augustus 2014

 ,  , 
1Research Service, VA Puget Sound Health Care System, 2Seattle Institute for Biomedical and Clinical Research, 3Division of Gerontology and Geriatric Medicine, Department of Medicine, University of Washington, 4Geriatric Research, Education, and Clinical Center, VA Puget Sound Health Care System

In dit artikel

Samenvatting

Een methode om de inspanningsduur bij laboratoriummuizen te beoordelen zonder gebruik van een schokgrill wordt gedemonstreerd. Deze methode is een humane verbetering die de verstorende effecten van stress op experimentele parameters kan verminderen.

Samenvatting

Met behulp van laboratorium muismodellen, worden de moleculaire routes die verantwoordelijk zijn voor de metabolische voordelen van uithoudingsvermogen te oefenen begint te worden gedefinieerd. De meest voorkomende methode voor het beoordelen van de uitoefening uithoudingsvermogen in muizen maakt gebruik van gedwongen lopen op een gemotoriseerde loopband uitgerust met een schok net. Dieren die lopen stoppen worden geduwd door de bewegende loopband op een rooster dat een elektrische schok voet levert; de negatieve stimulus ontsnappen, de muizen weer lopen op de band. Echter, vermijdingsgedrag en psychische belasting door gebruik van een schok inrichting verstoren kwantificering van actief uithoudingsvermogen, en verwarren metingen postexercise serum hormoon en cytokine niveaus. Hier, we demonstreren en valideren van een verfijnde methode om draait uithoudingsvermogen in naïeve C57BL / 6 laboratorium muizen op een gemotoriseerde loopband meten zonder gebruik te maken van een shock raster. Bij muizen zijn preacclimated om de loopband, dat ze vrijwillig lopen met gang snelheden specifiek voor elk mouse. Gebruik van de schok net wordt vervangen door zacht stimulering door een menselijke operator met een tongspatel, gekoppeld aan gevoeligheid voor de vrijwillige bereidheid om op de van de muis. Clear eindpunten voor het kwantificeren looptijd tot uitputting voor elke muis worden bepaald en weergegeven in gedragssignalen uitgeput zoals gespreide houding en zware ademhaling. Deze methode is een humane verfijning die ook vermindert de verstorende effecten van stress op experimentele parameters.

Inleiding

Obesitas, insulineresistentie en type 2 diabetes met elkaar verbonden zijn metabole aandoeningen die ingrijpende gevolgen voor de gezondheid van zowel de Amerikaanse en wereldwijde populatie 1-4 uit te oefenen. Duurzaamheid oefening kan voorkomen en behandelen deze omstandigheden 5,6. Bovendien beoordeling van loopsnelheid en uithoudingsvermogen worden gebruikt als klinisch diagnostische testen voor kwetsbaarheid, sarcopenie en de gevolgen van andere aandoeningen zoals chronische obstructieve longziekte, bij mensen 7.

De biochemische pathways grondslag liggen aan de positieve effecten van duurtraining op de lichaamssamenstelling en insuline gevoeligheid beginnen te worden opgehelderd, met behulp van genetisch of farmacologisch gemodificeerde muizen die vertoning versterkte of verminderde inspanningscapaciteit 8-11. Toch hebben veel van dergelijke studies gemotoriseerde loopbanden uitgerust met shock roosters om muizen te forceren een 8-11 gebruikt. Dieren die lopen stoppen worden geduwd doorde bewegende loopband op een rooster dat een elektrische schok voet levert; de negatieve stimulus ontsnappen, de muizen weer lopen op de band. Deze procedures kunnen psychologische stress en vermijdingsgedrag te introduceren als verstorende factoren die van invloed experimentele parameters 12. Andere methoden voor het meten van het uithoudingsvermogen, zoals de kwantificering van ambulante activiteit met behulp van een straal-break apparaten of kwantificering van in-kooi wiel draait, kan worden verstoord door modulatie van het dagritme, angst, onbedoelde training, of voedsel zoekend gedrag 12-16. Bovendien vereisen deze procedures enkele behuizing, een bron van psychologische stress voor muizen. Daarom is een directe meting van lichaamsbeweging uithoudingsvermogen niet verstoord door spanning nodig.

Om deze bezwaren te ondervangen, heeft ons laboratorium ontwikkeld en gevalideerd een methode om de maximale loopprestatie capaciteit te evalueren en aanhoudende loopsnelheid in ongetrainde, naïeve muizen met behulp van een gemotoriseerde loopband niet equipped met een schok net. De ruimte aan het einde van het loopvlak, waarbij de schok rooster gewoonlijk verblijft, wordt dan een platform voor muizen te rusten, en biedt plaats voor muizen die weigeren werking te zitten totdat uit de inrichting. Muizen ertoe geleid door een menselijke waarnemer met zachte tikken of aanraken met een tongspatel, gekoppeld aan gevoeligheid voor de vrijwillige bereidheid om op de van de muis. Deze werkwijze is gebruikt om verschillen in de uitoefening uithoudingsvermogen van genetisch gemodificeerde en controle C57BL / 6 muizen die verschillen in expressie van de spier afgeleide cytokine interleukine-15 (IL-15) 16,17 kwantificeren. Deze methode is een humane verfijning die de verstorende effecten van negatieve versterking veroorzaakt door het gebruik van een schok rooster af.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De hier beschreven procedure is goedgekeurd door de VA Puget Sound Institutional Animal Care en gebruik Comite, en voldoet aan de ILAR gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren.

1 Experimentele Voorbereiding

  1. Beslis vooraf of bloed of weefselverzameltoestel spoedig na inspanning noodzakelijk, en zo ja, bepalen de post-oefening interval voor geleiding van deze procedures. Voorbeelden hiervan zijn de bepaling van de oefening geïnduceerde hormoon of cytokine release in de circulatie (noodzakelijk bloedafname), bepaling van de oefening geïnduceerde expressie van mRNA-soorten van belang (noodzakelijk euthanasie gevolgd door weefsel collectie). Als direct na de training van bloed of weefsel collectie is aangegeven, een materiaal dat voor deze procedures bij de hand in de procedure voor de kamer. Ontvang Institutional Review Board goedkeuring en uitvoeren volgens de wettelijke bepalingen. Niet alle experimenten vereisen postexercise bloed of weefsel collectidoor; Een eenvoudige vergelijking van het runnen van het uithoudingsvermogen kan zijn alles wat nodig is.
  2. Bepaal van tevoren op de experimentele groepen en postexercise procedures voor muizen (zie beschrijving hierboven).
  3. Plaats de loopband op een stevige tafel in een rustige kamer gewijd tijdens de lopende onderzoeken naar deze procedure.
  4. Plaats de loopband voor muis-en kleinbedrijf rijstroken en op een helling aangepast aan het protocol. De helling van 5 o wordt hier gebruikt om spierbeschadiging door excentrische beweging (verlenging van de spier tegelijk als contractie) die tijdens bergafwaarts voorkomen.
  5. Plaats een absorberend kussen onder de loopband om de ontlasting op te vangen.

2 Acclimation van Muizen op de loopband

Beslissen of een "sedentaire" (geen oefening) groep muizen is noodzakelijk, en sedentaire muizen om de loopband bloot zonder stromend zoals beschreven in stappen 2,1-2,5. Bepaal of 2 of 4 experimentele groepen vereist,. bijvoorbeeld sedentaire / Oefening (2 groepen); Uitgeoefend Controls / Uitoefening Behandeling (2 groepen, geen sedentaire dieren); of, sedentaire / Uitoefening x controle / behandeling (4 groepen). De "behandeling" kan een transgene of knock-out genotype, een farmacologische behandeling, speciaal dieet, of andere experimentele interventie.

  1. Laat de muis om te wennen aan de procedure kamer in zijn vervoerd kooi, met kooi mates, voor 1-2 uur.
  2. Selecteer een enkele muis en opnemen tag nummer; wegen muis en opnemen gewicht.
  3. Plaats de muis op de loopband zonder de motor ingeschakeld voor acclimatisatie, ongeveer 5 minuten. Schakel de stroom in, zonder dat de loopband lopen, en laat de muis wennen aan de machine lawaai voor nog eens 5 minuten.
  4. Verwijder muizen in de "sedentaire" groepen (indien van toepassing, zie Nota 1) van de loopband op dit punt en ze terug naar hun kooi of het gedrag na de training procedures volgens de proefopzet (zie noot 2).

3. Het starten van de Run-to-Uitputting-test

  1. Na acclimatisatie, zet de band een lage snelheid (10 m / min) wanneer het dier is het verkennen van de gordel en niet op het platform.
  2. Tik op of neem de achterhand van de muis met een tongspatel, 1-3 keer, om terughoudend dieren aan te moedigen om te blijven op de loopband en lopen voorzichtig.
    OPMERKING: De meeste muizen zal gemakkelijk lopen, maar ze soms stoppen voor een korte periode. Wanneer dit gebeurt, gebruikt u de tongspatel om voorzichtig te tikken of til de achterkant van het dier tot hervatting van de exploitatie aan te moedigen. Vaak hebben de muizen niet te worden aangeraakt met de tongspatel; merken van de hand met de tongdepressor afkomen zorgt ervoor dat de muizen om wat meer uit te voeren.
  3. Start een laboratorium timer zodra de muis draait op de beginsnelheid van 10 m / min.
  4. Zet de snelheid langzaam op wanneer de muis is aan de bovenkant (bergopwaarts einde) van de band, in stappen van 1 m / min, ongeveer om de 2 minuten.
  5. Zet de snelheid naar devorige instelling als de muis herhaaldelijk loopt in korte uitbarstingen en niet in een gestaag tempo.
  6. Bepaal de maximale aanhoudende loopsnelheid van elke muis (meestal 14-17 m / min voor C57BL / 6 muizen) door aanpassing van de snelheid en het kijken naar de muis. Noteer deze snelheid.
    OPMERKING: De locatie van het dier op de loopband keuen de onderzoeker de bereidheid van het dier op een hogere snelheid. Als de muis is aan het (bergop) einde en over te lopen in de muur, het is klaar om te draaien op een hogere snelheid. Als de muis draait met een constante snelheid in het midden van de loopband kan worden op zijn maximale snelheid, dan moeten worden bijgesteld, afhankelijk van de kwaliteit van de run.

4 eindpunten en Muizen die Stop

  1. Gebruik de tongspatel zachtjes tikken of neem de achterhand van de dieren die te stoppen, om de hervatting van de exploitatie aan te moedigen (zie toelichting 3.2). Gebruik de timer voor tijdelijke onderbrekingen niet stoppen in hardlopen.
  2. Identificeren en remove muizen die weigeren op te starten. U dit op de data sheet. Afhankelijk van experimenteel ontwerp, kunnen muizen die weigeren worden getest op een andere dag
    OPMERKING: Sommige muizen zal volledig weigert te draaien. Dergelijke muizen zal lopen in korte uitbarstingen, dan stoppen te verzorgen of "pedal", dat wil zeggen, zitten op het platform en gebruiken hun voorpoten op de band. De houding van deze muizen is gebogen, met de vier voetjes geplant onder het dier uit teruggedrongen op de loopband door de tongspatel te houden. Af en toe een muis wordt agressief naar de tongdepressor toen niet bereid om te draaien, bijten de tongspatel of het beklimmen van het als een manier om te ontsnappen. Het is duidelijk binnen de eerste 5 minuten van de proef of de muis, of zal niet in werking. Verwijder muizen die weigeren op te starten vanuit de analyse, maar ze niet tellen als "sedentaire" muizen.
  3. Identificeer uitgeputte muizen en stoppen van de timer.
    OPMERKING: Uitputting wordt gedefinieerd door drie opeenvolgende stops en weigering omsume loopt ondanks zachte aanmoediging, plus lichamelijke tekenen van uitputting zoals ademhalingsmoeilijkheden en gespreide houding. Muizen herstellen van uitputting binnen 30 tot 60 minuten.
  4. Noteer de totale hoeveelheid tijd die besteed draait op alle snelheden.
  5. Afhankelijk van de experimentele opzet, ofwel de terugkeer van de muis is aan zijn kooi, of die onmiddellijke procedures postexercise zoals bloed of weefsel collectie als per institutionele richtlijnen.
  6. Veeg de riem schoon met een kiemdodende doekje na het testen van elke individuele muis, zodat de geur van de vorige muis niet het gedrag van de latere muizen getest beïnvloeden.
  7. Test de volgende muis. Gebruik een nieuw tongspatel voor elke muis. Muizen die in dezelfde kooi staan ​​kan worden getest achtereenvolgens op dezelfde dag zonder extra acclimatisering de behandelkamer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Deze procedure voor het meten uitoefening uithoudingsvermogen nauwkeurig de moleculaire en metabolische profiel van verschillende stammen van C57BL / 6 muizen die verschillen in de expressie van het cytokine IL-15 16,17. Transgene muizen die een overexpressie van IL-15 (IL-15 TG muizen) vertonen significante aanloop tot uitputting keer boven littermate controles toegenomen, terwijl muizen die IL-15 (IL-15 KO muizen) vertonen missen doorlooptijden aanzienlijk verminderd voorafgaand aan het bereiken uitputting ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier beschreven is een methode om vrijwillige running uithoudingsvermogen bij laboratoriummuizen evalueren middels een gemotoriseerde loopband zonder het gebruik van een shock raster. Deze werkwijze kan verschillen tussen sublijnen van C57BL / 6 muizen die verschillen in de expressie van het cytokine IL-15, waardoor weer verschillen in expressie van factoren die oefening uithoudingsvermogen 16,17 grondslag onthullen. In overeenstemming met de principes van de "Three R's" in proefdierkunde, kan d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Ondersteund door Merit Review # BX001026 van het Department of Veterans Affairs (LSQ), en het gebruik van de middelen en faciliteiten VA Puget Sound Systeem van de Gezondheidszorg, de Transgene Resource Core aan de Universiteit van Washington Nathan Shock Center of Excellence in de fundamentele biologie van veroudering (NIA # 5P30AG-013280), en de Universiteit van Washington Diabetes Endocrinologie Research Center (NIH # P30 DK-17047). Wij danken Cynthia Pekow DVM en Kari L. Koszdin DVM, VA Puget Sound, mits nuttig commentaar op het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Open Rodent Treadmill Exer-3/6Columbus Instruments, Columbus OH1050RMDit catalogusnummer is voor modellen zonder schokraster. Schokrasters kunnen handmatig worden verwijderd van oudere modellen (Eco 3/6)
Sani Cloth Germicidal TowlettesPDI- Professional Disposables, Inc., Orangeburg, NYmeestal besteld via lokale faciliteitBevat 10% isopropylalcohol; elk gelijkwaardig product kan worden gebruikt.
TongetjesElke lokale leverancier
LaboratoriumtimerElke leverancier
IL-15 TG muizen*JAX, Bar Harbor, ME011002Murine IL-15 transgen tot expressie gebracht door gemodificeerd humaan alfa-skeletspieractine promotor met gewijzigde signaalsequentie om secretie te vergemakkelijken.
C57BL/6J muizen (wild-type)*JAX, Bar Harbor, ME000664Controlemuizen voor IL-15 TG
IL-15 KO muizen*Taconic Farms, Germantown, NY4269-MHomozygote IL-15 "knockout" muizen op C57BL/6 achtergrond
C57BL/6NTac (wild-type)*Taconic Farms, Germantown, NYB6-MControlemuizen voor IL-15 KO
*Optioneel; muislijnen en behandelingen kunnen specifiek zijn voor het experimentele protocol.

Referenties

  1. Hill, J. A., Wyatt, H. R., Reed, G. W., Peters, J. C. Obesity and the environment: where do we go from here? Science. 299 (5608), 853-855 (2003).
  2. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
  3. Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease. Nature. 444 (7121), 875-880 (2006).
  4. Pischon, T., Nothlings, U., Boeing, H. Obesity and cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 67 (2), 128-145 (2008).
  5. Benton, C. R., Wright, D. C., Bonen, A. PGC-1α-mediated regulation of gene expression and metabolism: Implications for nutrition and exercise prescriptions. Appl. Physiol. Nutr. Metab. 33 (5), 843-862 (2008).
  6. Handschin, C., Spiegelman, B. M. The role of exercise and PGC1alpha in inflammation and chronic disease. Nature. 454 (7203), 463-469 (2008).
  7. Vasunilashorn, S., et al. Use of the Short Physical Performance Battery score to predict loss of ability to walk 400 meters: analysis from the InCHIANTI study. J. Gerontol. A Biol. Med. Sci. 64 (2), 223-229 (2009).
  8. Wang, Y. X., et al. Regulation of muscle fiber type and running endurance by PPARδ. PLoS Bio. 2 (10), e294(2004).
  9. LeBrasseur, N. K., et al. Myostatin inhibition enhances the effects of exercise on performance and metabolic outcomes in aged mice. J. Gerontol. A Biol. Med. Sci. 64 (9), 940-948 (2009).
  10. Burch, N., et al. Electric pulse stimulation of cultured murine muscle cells reproduces gene expression changes of trained mouse muscle. PLoS ONE. 5 (6), e10970(2010).
  11. Li, L., et al. Mitochondrial biogenesis and peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α (PGC-1α) deacetylation by physical activity. Diabetes. 60 (1), 157-167 (2011).
  12. Knab, A. M., et al. Repeatability of exercise behaviors in mice. Physiol. & Behavior. 98 (4), 433-440 (2009).
  13. He, Y., et al. IL-15 Receptor deletion results in circadian changes of locomotor and metabolic behavior. J. Mol. Neurosci. 41 (2), 315-321 (2010).
  14. Wu, X., Hsuchou, H., Kastin, A. J., Rood, J. C., Pan, W. Essential role of interleukin-15 receptor in normal anxiety behavior. Brain Behav. Immun. 24 (8), 1340-1346 (2010).
  15. Pistilli, E. E., et al. Loss of IL-15 receptor α alters the endurance, fatigability, and metabolic characteristics of mouse fast skeletal muscles. J. Clin. Invest. 121 (8), 3120-3132 (2011).
  16. Quinn, L. S., Anderson, B. G., Conner, J. D., Wolden-Hanson, T. W. IL-15 overexpression promotes endurance, oxidative energy metabolism, and muscle PPARδ, SIRT1, PGC-1α, and PGC-1β expression in male mice. Endocrinology. 154 (1), 232-245 (2013).
  17. Quinn, L. S., Anderson, B. G., Conner, J. D., Wolden-Hanson, T., Marcell, T. J. IL-15 is required for post-exercise induction of the pro-oxidative mediators PPARdelta and SIRT1. Endocrinology. , (2013).
  18. Ward, J. M., Anver, M. R., Mahler, J. F., Devor-Henneman, D. E. Chapter 13, Pathology of mice commonly used in genetic engineering (C57BL/6; 129; B6,129; and FVB/N). The Pathology of Genetically Engineered Mice. Ward, J. M., Mahler, J. F., Maronpot, R. R., Sundberg, J. P. , Iowa State University Press. Ames, IA, Chapter. 161-179 (2000).
  19. Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Debate, K. A., Kleeberger, S. R. Interstrain variation in murine aerobic capacity. Med. Sci. Sports Exerc. 33 (12), 2053-2057 (2001).
  20. Turner, M. J., Kleeberger, S. R., Lightfoot, J. T. Influence of genetic background on daily running-wheel activity differs with aging. Physiol. Genomics. 22 (1), 76-85 (2005).
  21. Haight, T. J., van der Laan, M. J., Manini, T., Tager, I. B. Direct effects of leisure-time physical activity on walking speed. J. Nutr. Health Aging. 17 (8), 666-673 (2013).
  22. Studenski, S. Gait speed and survival in older adults. JAMA. 305 (1), 50-58 (2011).
  23. Jacobsen, K. R., Kalliokoski, O., Teilmann, A. C., Hau, J., Abelson, K. S. The effect of isoflurane anaesthesia and vasectomy on circulating corticosterone and ACTH in BALB/c mice. Gen. Comp. Endocrinol. 179 (3), 406-413 (2012).
  24. Sellers, T. L., Jaussi, A. W., Yang, H. T., Heninger, R. W., Winder, W. W. Effect of the exercise-induced increase in glucocorticoids on endurance in the rat. J. Appl. Physiol. 65 (1), 173-178 (1988).
  25. Cook, M. D., et al. Forced treadmill exercise training exacerbates inflammation and causes mortality while voluntary wheel training is protective in a mouse model of colitis. Brain Behav. Immun. 33, 46-56 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

MuisloopbandVrijwillig LopenAlternatief voor ShockgridGewenning aan de LoopbandUitputtingsendpuntenIL 15 TransgeenMaximale DuursnelheidZachte AanmoedigingTijd tot Uitputting

Gerelateerde artikelen